Examensarbete 10 poäng C-nivå
Biomedicinska analytikerprogrammet
Microdissection of well defined cell populations for
RNA isolation in the analysis of normal human skin
and basal cell carcinoma
Karolina Edlund
Handledare: Anna Asplund
Institutionen för Genetik och Patologi
Uppsala Universitet
ABSTRACT
The human skin provides us with an excellent protective barrier and possesses a remarkable ability of constant
renewal. Basal cell carcinoma is the most common type of skin cancer. The aim of this project was to verify
results from an earlier study investigating the molecular differences between basal cell carcinoma (BCC) and
basal cells of normal human epidermis. In that study microdissection of cell populations from BCC and basal
cells of normal epidermis respectively was performed in five cases of confirmed BCC. Following RNA
extraction and amplification, a gene expression analysis was performed using a 46 k human cDNA microarray.
Comparison of expression profiles showed a differential expression of approximately 300 genes in BCC. An
upregulation of signaling pathways previously known to be of importance in BCC development could be
observed, as well as a downregulation of differentiation markers, MHC class II molecules, and proteins active in
scavenging of oxygen radicals. We wanted to confirm these findings for a number of selected genes, using real
time PCR. The focal point of this project was microdissection of cells from BCC and subsequent isolation of
RNA. Microdissection based methods offer a possibility of selecting well defined cell populations for further
analysis by using a focused laser beam. Initially tests in order to optimize the method were also performed,
concerning the dehydration process and choice of slides used in microdissection. Isolation of RNA may, as we
experienced, be associated with problems due to destruction of RNA by degrading enzymes.
KEYWORDS
Skin, epidermis, basal cell carcinoma, microdissection, RNA extraction
2
INTRODUKTION
Hos en vuxen människa utgör huden ungefär 16% av kroppsvikten och täcker en kroppsyta
som kan uppnå två kvadratmeter. Huden är ett av kroppens största organ och har många
viktiga funktioner. Den bildar en barriär mot omgivningen som skyddar kroppens inre miljö
mot skadlig påverkan från yttervärlden. Hudbarriären skyddar oss mot uttorkning, infektion,
mekanisk skada och UV-strålning. Dessutom är huden är viktig för kroppens temperaturreglering samt syntes av D-vitamin. Receptorer i huden förmedlar sinnesintryck från
omgivningen, såsom beröring och smärta, till centrala nervsystemet.
Huden är uppbyggt av flera skikt: epidermis, dermis och subcutis. Epidermis (ytterhuden)
består av ett flerskiktat förhornat skivepitel, samt tillhörande hårfolliklar, talgkörtlar och
svettkörtlar. Det har en tjocklek på 0.1-1mm beroende på vilken kroppsdel det täcker. I
epidermis kan flera olika typer av celler urskiljas. Keratinocyter utgör huvuddelen av
epidermis. De producerar keratin, som är det huvudsakliga strukturella proteinet i epidermis,
samt i hår och naglar. Keratin är mycket motståndskraftigt och skyddar mot både mekanisk
och kemisk skada. Melanocyter tillverkar pigmentet melanin som ger oss ett skydd mot solens
ultravioletta strålning. Pigmentkorn med melanin produceras i melanocyter och distribueras
sedan vidare till keratinocyterna som upptar dessa via endocytos. Langerhans celler har en
immunologisk funktion genom att fungera som antigenpresenterande celler. De bildas i
benmärgen och transporteras via blodet till huden. Merkelceller är känselceller som reagerar
på tryck och står i förbindelse med nervceller. Mellan epidermis och dermis finns ett
basalmembran, som består av ett tunt hårt packat lager av proteiner (t. ex. kollagen,
proteoglykaner och lamininer). Dermis (läderhuden) är ett 1-2 mm tjockt lager under
epidermis och består till största delen av bindväv. Det är uppbyggt av ett nätverk av kollagena
och elastiska fibrer med ett fåtal celler, såsom fibroblaster, makrofager och mastceller. Dermis
utgör ett strukturellt stöd för epidermis och via dess rika nätverk av blodkärl tillförs huden
näring. Genom att reglera blodcirkulationen genom dermis kan kroppen reglera sin
temperatur. Subcutis (underhuden), som även kallas hypodermis, består av lucker bindväv och
binder huden till underliggande vävnad. I subcutis finns också fettceller i varierande mängd.
Denna fettdepå fungerar som en energireserv och isolerar mot stötar och kyla. I underhuden
finns också en viktig vätskedepå.
Epidermis är uppbyggt av skikt av keratinocyter i olika differentieringsstadier (figur 1).
Stratum basale, eller basallagret, är det understa skiktet. Det består av cylindriska celler som
3
vilar på ett basalmembran. Cellerna är förankrade i varandra via desmosomer och till
basalmembranet via hemidesmosomer. I basallagret sker nybildningen av hudceller.
Merkelceller och melanocyter återfinns i epidermis basallager, där de utgör en minoritet av
det totala cellantalet. Utanför basallagret ligger stratum spinosum. I detta skikt är cellerna
kubiska eller något utplattade. De har en central kärna och en cytoplasma fylld med buntar av
keratinfilament. Dessa buntar strålar samman till tagglikande utskott med desmosomer längst
ut. Cellerna i detta skikt är starkt bundna till varandra via dessa filamentfyllda
cytoplasmatiska utskott och desmosomer. Stratum spinosum är särskilt tjock i områden som
utsätts för kraftig nötning, t ex fotsulor och handflator. Langerhanska celler återfinns i stratum
spinosum. Stratum granulosum består av mellan tre och fem lager platta celler som är viktiga
för hudens barriärfunktion. Cellernas cytoplasma är fylld av icke-membranomslsutna basofila
granula, sk keratohyalina granula. En annan struktur som är karaktärisktisk för celler i stratum
granulosum, och som endast kan urskiljas i elektronmikroskop, är membranomslutna
lamellära granula, som innehåller lipider. Dessa lipider frisätts i utrymmet mellan cellerna, där
de fungerar som en slags cement och bildar en barriär. Stratum lucidum är ett skikt som är
synbart främst i tjock hud. Det består av ett tunt genomskinligt lager av platta celler utan
cellkärna och organeller. Stratum corneum, eller hornlagret, är hudens yttersta skikt. Det
består av 15-20 lager av platta keratiniserade celler, utan cellkärna och cellorganeller.
Hornlagret har en viktiga funktioner, t. ex. att reflektera UV-strålning, förhindra intrång av
smuts och mikroorganismer, samt förhindra vätskeförlust. Då huden nöts skalas de yttersta
cellerna av och lossnar i små grupper, stratum disjunctum. Cellerna i epidermis förändras
under sin vandring mot ytan. När cellerna med tiden vandrar utåt mot hudytan kommer antalet
keratinfilament att öka och i slutändan utgöra hälften av den totala proteinmängden i cellen.
Under differentieringsprocessen förlorar cellen sina organeller, för att slutligen bilda det lager
av terminalt differentierade döda celler som utgör hornlagret.
S tra tu m c o rne u m
S tra tu m g ra n u lo s u m
Ep id e rm i s
S tra tu m s p ino s um
S tra tu m b a s a le
B a sa l m e m b r a n
D e rm is
Fig. 1. Epidermis uppbyggnad
med keratinocyter i olika skikt.
4
Andra strukturer som associeras med huden är hårfolliklar, talgkörtlar och svettkörtlar. Hårfolliklar återfinns över hela huden, utom på handflator, fotsulor och läppar. Dessa är
uppbyggda av en yttre rotskida (ORS) som är sammanväxt med basallagret i epidermis, en
inre rotskida (IRS) och själva hårskaftet. Det nedre segmentet av en hårfollikel går igenom
cykler av aktiv tillväxt, nedbrytning och vila [1]. Talgkörtlar mynnar i den översta delen av
hårfollikeln och producerar det lipidrika talg som gör epidermis smidigt och vattenavstötande.
Svettkörtlar finns i dermis och har utförsgångar som leder upp till hudytan. Svettning är en
viktig mekanism för reglering av kroppstemperaturen.
Hudceller nybildas i en ständigt pågående process och cellerna i epidermis omsätts normalt på
15-30 dagar. Denna enorma kapacitet till förnyelse genereras av stamceller i epidermis [2]. I
huden återfinns stamceller i den sk `bulge´ regionen i hårfolliklar samt i epidermis basallager
[3]. Stamcellerna i hårfolliklarna har visats kunna ge upphov till såväl hårfollikelepitel som
epidermis och talgkörtlar, medan stamceller i basallagret i epidermis endast verkar ge upphov
till epidermis [3,4]. Balansen mellan förnyelse av stamceller och differentiering åstadkoms
genom sk asymmetrisk delning (figur 2), där varje stamcell som delar sig ger upphov en ny
stamcell och en sk `transit amplifying´ (eller `transient amplifying´) cell (TA). TA celler
delar sig ett fåtal gånger innan de lämnar cellcykeln och genomgår terminal differentiering.
En funktion hos dessa TA celler är att öka antalet terminalt differentierade celler som
produceras vid varje stamcellsdelning [4].
Stamc ell
Trans it
A mplify ing
c eller (TA )
Dif f erentierade celler
Fig. 2. Stamceller nybildas och bildar TA celler som delar
sig ett fåtal gånger och sedan differentieras.
En cells liv och död är i normala fall en kontrollerad process. Proliferation, differentiering och
apoptos är noga reglerade förlopp. Cancerceller å andra sidan karakteriseras av en
okontrollerad och ofta snabb tillväxt, där den normala regleringen har satts ur funktion.
Egenskaper som är kännetecknande för cancerceller är att de är självförsörjande på
5
tillväxtfaktorer, ej mottagliga för tillväxtinhiberande signaler, har en förmåga att undgå
apoptos, besitter en obegränsad proliferativ potential, uppvisar en ökad angiogenes, samt har
en förmåga att växa invasivt och bilda metastaser [5]. Omvandlingen av en normal cell till en
cancercell är en flerstegsprocess, där en cell ackumulerar flera olika skadliga mutationer som
förändrar cellen. Det kan vara mutationer som inaktiverar suppressorgener eller mutationer
som aktiverar onkogener. Tumörsuppressorgener kodar vanligtvis för proteiner som bromsar
celldelning, t ex receptorer för tillväxtinhibitorer. Onkogener kodar vanligtvis för proteiner
som stimulerar till celldelning [6].
Hudcancer är den vanligaste cancerformen i västvärlden [7]. Den tveklöst största riskfaktorn
för utvecklandet av alla former av hudcancer är UV-strålning [8]. UV-spektrat kan indelas i
UVC (200-280nm), UVB (280-320nm) och UVA (320-400nm). UVC absorberas av det
atmosfäriska ozonlagret som omger jorden. UVB och UVA leder till DNA-skada, genom att
inducera
mutationer.
UVB
inducerar
bildandet
av
kovalenta
bindningar
mellan
bredvidliggande baser (tymin och cytosin) i DNA, sk pyrimidindimerer, vilket genererar
fotoprodukter som är mutagena. Förutom den direkta skadorna på DNA kan UV-strålning,
framförallt UVA framkalla bildandet av fria radikaler, t ex reaktiva syreradikaler (reactive
oxygen species, ROS) som i sin tur kan angripa DNA och orsaka mutationer [8]. På grund av
sitt utsatta läge besitter keratinocyterna i epidermis en hög risk att förvärva
cancerframkallande mutationer. Ändå är det relativt få celler som verkligen utvecklas till
cancerceller, eftersom celler i huden omsätts i en relativt snabb process och de celler som
muterat går förlorade i den normala differentieringsprocessen. Stamcellerna är förmodligen de
enda celler som finns kvar i epidermis under tillräckligt lång tid för att hinna ackumulera de
multipla skadliga mutationer som är nödvändiga för uppkomsten av en tumör [2].
Malignt melanom, som härstammar från melanocyter i epidermis, är den cancerform som
vanligtvis associeras med begreppet hudcancer. Denna form är inte den vanligaste, men det är
den form av hudcancer som orsakar flest dödsfall. Basalcellscancer (BCC) och skivepitelcancer (SCC) är de två vanligaste typerna av hudcancer [2]. Hudcancer, förutom
maligna melanom kommer på femte plats i listan över de mest diagnostiserade cancersjukdomarna i Sverige enligt statistik från cancerfonden. BCC är den allra vanligaste formen
och man har beräknat att ungefär 20000 svenskar varje år får denna diagnos [9]. Det finns tre
huvudtyper av BCC: nodulär, ytlig (superficial) och infiltrativ, där den nodulära formen är
6
den vanligaste (figur 3). Tumörer uppstår i ungefär 80% av fallen på huvud och i nacke [10].
BCC är en långsamt växande tumör som sällan metastaserar [10]. Till skillnad från SCC, som
vanligtvis uppstår stegvis via förstadier som aktinisk keratos och cancer in situ, verkar BCC
uppstå utan föregående varningstecken. Tumören består av celler som är negativa för
markörer för terminal differentiering, d v s cellerna i tumören är odifferentierade [2]. Även
om det inte är fastställt så härstammar med största sannolikhet BCC från antingen stamceller i
epidermis eller hårfollikels yttre rotskida [2].
Fig. 3. Nodulär BCC i histologiskt snitt.
Signalvägen som involverar genen Sonic Hedgehog (figur 4) tros spela en viktig roll för
uppkomsten av BCC och man misstänker att mutationer som påverkar Sonic Hedgehog
signalering ger upphov till BCC. Hedgehog signalering beskrevs först i Drosophila och är där
inblandad i tillväxt och segmentell utveckling av insekten. Idag har man funnit homologa
reaktionsvägar i ryggradsdjur. I människa och i mus har denna signaleringskaskad bl a viktiga
funktioner i embryonal utveckling av neuralrör, muskel- och skelett, hud, tänder, hårfolliklar
och hematopoesen [7]. Det utsöndrade proteinet Sonic Hedgehog (SHH) binder till ett
membranreceptorkomplex bildat av transmembranreceptorerna Patched (PTCH) och
Smoothened (SMO). SMO inhiberas av PTCH, men vid bindning av SHH till PTCH tillåts
intracellulär signalering via SMO. Detta leder till aktivering av transkriptionsfaktorerna Gli1,
Gli2 ochGli3 och transkription av målgener . Den exakta funktionen för var och en av Gliproteinerna är idag ej klarlagd [2]. SHH signalering i huden är i normala fall förbehållet
tillväxtperioder i normalt hårfollikelepitel. I BCC är denna reaktionsväg ständigt aktiv, med
en konstant signalering, även utan bunden ligand [7].
7
SHH
SMO
Gli
Transkription av
målgener för Gli
PTCH
Cellmembran
Kärna
Fig. 4. Sonic Hedgehog pathway.
Gorlins syndrom, även kallat `basal cell nevus syndrome´ (BCNS), är en ärftlig autosomal
dominant sjukdom som bland annat leder till utvecklingsstörningar och utveckling av multipla
BCC i ung ålder. Hos personer med BCNS är en PTCH allel inaktiverad pga av mutation.
Också i sporadisk BCC är PTCH ofta muterad. Mutation av PTCH leder till en ökad
aktivering av SHH pathway och därmed en ökad aktivering av dess målgener, men den exakta
mekanism som leder till BCC har idag ej identifierats [7]. Gli2 tros undertrycka gener
associerade med epidermal differentiering, samt aktivera anti-apoptosfaktor bcl-2. Gli
inducerar även transkription av PTCH och Wnt gener. Proteiner i Wnt-familjen tros orsaka
ackumulering av β-catenin, ett protein som man kunnat visa är överuttryckt i BCC [??].
Målet med molekylära studier är ofta att karaktärisera den genetiska bakgrund som ger
upphov till en viss fenotyp. Trovärdigheten hos de data man får är beroende av renheten av
den cellpopulation som analyseras. Mikrodissektion ger en möjlighet att med hög precision
välja ut en viss population celler. Genom användning av en fokuserad laserstråle kan valda
bitar av ett vävnadsprov skäras ut. De utskurna bitarna kan därefter med hjälp av laser
katapultas från vävnadssnittet till en uppsamlingsbehållare, utan att cellernas DNA och RNA
förstörs [11]. Med hjälp av cDNA microarrays möjliggörs skapandet av en profil av
genuttryck som inkluderar tiotusentals gener i ett enda experiment [12]. Denna teknik
utnyttjar hybridisering mellan två komplementära nukleinsyrasekvenser. Ett stort antal
genspecifika polynukleotidsekvenser deriverade från 3´änden i mRNA (3´expressed sequence
tags, ESTs) placeras på ett `chip´. Detta `chip´ hybridiseras med fluorescensinmärkt cDNA
representativt för totala mängden RNA som extraherats från en utvald population celler.
Genom att mäta fluorescensen som utsänds kan mängden transkriberat RNA i provet
detekteras och jämföras med en referens. Detta ger, för varje gen, ett mått på i vilken
8
omfattning den uttrycks [13]. Realtids PCR är också en metod som kan användas för att få ett
mått på vilken mängd av en viss nukleinsyrasekvens som finns i ett prov. Med hjälp av
genspecifika primers amplifieras den utvalda nukleinsyrasekvensen. Mängden slutprodukt
bestäms genom jämförelse med en standardkurva där man utgått från kända koncentrationer
och är proportionell mot den ursprungliga mängden i provet.
Målsättningen med detta projekt var att verifiera resultat från en tidigare studie, i vilken man
genomfört en sk genuttrycksanalys av celler i basalcellscancer och basalceller i normalt
epidermis. I denna studie visades att ungefär 350 gener är differentiellt uttryckta i
basalcellscancer, varav 202 är uppreglerade och 161 nedreglerade. Ökat uttryck av PTCH
genen observerade ej, men däremot visades att flera proteiner vars uttryck styrs av SHH /
PTCH signalering är differentiellt uttryckta i tumörceller. En uppreglering av Gli1, Gli2,
Wnt6 och två receptorer för proteiner i Wnt-familjen, samt β-catenin kunde påvisas. Erhållna
resultat tyder också på en avsaknad av epidermal differentiering, nedreglering av MHC klass
II, ändrad syntes av basalmembrankomponenter, samt nedreglering av proteiner som skyddar
mot reaktiva syreradikaler [13]. Metoder som användes i denna studie inkluderade
mikrodissektion av celler från tumör respektive epidermis basallager i normal vävnad,
extraktion av RNA, samt RNA amplifiering och transkriptionsanalys med hjälp av cDNA
microarrays. Resultatet från denna studie vill man alltså nu, för ett tiotal utvalda gener,
verifiera med hjälp av realtid PCR. Metoder som ska användas är också denna gång
mikrodissektion av celler från basallager respektive tumör och RNA isolering, nu följt av
realtids PCR. Detta arbete fokuserades i första hand på mikrodissektion av tumör och
efterföljande RNA isolering. Inledningsvis utfördes tester för att optimera metoden, med
avseende på dehydreringsprocessen och val av objektsglas. Isolering av RNA av bra kvalitet
är ett viktigt steg för att möjliggöra vidare analyser. RNA isolering kan vara förknippat med
ett flertal problem, vilket också vi fick uppleva. Efter lyckade inledande optimeringstester
upplevde vi problem med att överhuvudtaget kunna detektera RNA när arbetet gick vidare
med RNA isolering från mikrodissekerade cellpopulationer från basallager och BCC
tumörvävnad
9
MATERIAL OCH METODER
Provmaterial
Frysta vävnadsprover erhölls från den upprättade biobanken på Avdelningen för Patologi,
Akademiska Sjukhuset, Uppsala.
Vävnadsproverna har tidigare skurits ut från färskt
operationsmaterial, bäddats in i OCT substans (Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek
Europe B.V.) och frysts i isopentan / torris, för att sedan förvaras i -70ºC.
Fryssnittning
Preparaten fryssnittades i 16 μm tjocka snitt och överfördes sedan till PALM membranglas
(P.A.L.M. GmbH, Bernried, Germany), autoklaverade 180ºC i 3h. Snitten torkades ett
ögonblick i rumstemperatur och förvarades sedan i -70ºC.
Färgning, fixering och dehydrering av snitt
Precis innan mikrodissektion tinades snitten och färgades 1 min med hematoxylin
innehållande 0,8U/μl RNasin® Plus RNase Inhibitor (Promega). Därefter fixerades snitten
1 min i zinkfixeringsmedel (0,1M Tris-HCl pH 7,4, 0,003M kalciumacetat, 0,02M zinkacetat,
0,04M zinkklorid) och dehydrerades 30 sek i 70% EtOH och 1 min vardera i resp. 95% och
99,5% EtOH.
Mikrodissektion
Mikrodissektionen utfördes med hjälp av PALM Robot-Microbeam laser microdissection
system (P.A.L.M. GmbH, Bernried, Germany). De utskurna cellerna katapultades upp i 25μl
extraktionsbuffert (PicoPureTM RNA Isolation Kit, Arcturus). Röret förvarades upp och ner på
torris. Cellerna centrifugerades ner och röret inkuberades 30 min i 42ºC för att sedan förvaras
i –70ºC.
Isolering av RNA
RNA isolerades med hjälp av PicoPureTM RNA Isolation Kit (Arcturus) enligt medföljande
protokoll.
Kontroll av RNA kvalitet
RNA kvaliteten kontrollerades med hjälp av RNA 600 Pico Assay Kit (Agilent Technologies)
i en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) enligt tillverkarens protokoll (Reagent
Kit Guide, 2003). Metoden grundar sig på en storleksseparation med hjälp av microchip
10
gelelektrofores. Som stege användes som rekommenderat RNA 6000 ladder (Ambion).
RNaseZap® (Ambion) och DEPC-vatten användes för dekontaminering av elektroder.
Bestämning av RNA koncentration
NanoDrop® ND-1000 spektrofotometer användes för koncentrationsbestämning av RNA. Vid
koncentrationsbestämning av RNA används 1 μl av provet. Som blank användes samma
elueringsbuffert som vid isolering av RNA.
Med ovan beskrivna metoder ville vi få svar på följande:
1. Påverkas morfologin i snitten samt mängden och kvaliteten på isolerat RNA av
dehydreringsprocessen? Vi ville undersöka om en bättre morfologi i snitten kan
uppnås genom att avbryta dehydreringen vid 95% EtOH, istället för att fortsätta till
99,5%
EtOH,
och
även
hur
detta
påverkar
kvalitet
och
mängd
RNA.
Utgångsmaterialet var här preparat av tonsill. Hela snitt skrapades ner i
extraktionsbuffert (inget mikrodissektionssteg) .
2. Har val av objektsglas någon betydelse för mängden och kvaliteten på isolerat RNA,
samt har autoklavering av objektsglasen någon betydelse? Vid mikrodissektion kan
man använda antingen PALM membranglas eller vanliga objektsglas och vi ville testa
vilket som var bättre med avseende på mängd och kvalitet RNA. Autoklavering av
glas ska enligt PALM minska mängden RNaser på glasytan och vi ville också testa
om detta påverkade RNA kvalitet och mängd. Utgångsmaterialet var även här
tonsillvävnad. Ca 5000 celler mikrodissekerades från snitt av tonsill och överfördes till
antingen PALM membranglas eller vanliga objektsglas, autoklaverade (180ºC 3h) och
icke autoklaverade.
3. Kan tillräckligt med RNA av god kvalitet isoleras från mikrodissekerat material från
hud? På grund av att vi efter inledande tester upplevde stora problem med att
överhuvudtaget kunna detektera RNA ville vi försöka finna felkällan och se att vi
kunde få metoden att fungera igen innan arbetet gick vidare. Vi bytte ut dom rör som
användes, då vi misstänkte att de kunde vara kontaminerade, samt blandade också nya
lösningar och rengjorde noga alla utrymmen som användes till RNA arbete.
11
Utgångsmaterialet var här hud från patientfall av basalcellscancer. Ca 7000 celler
mikrodissekerade från snitt bestående av både BCC tumörvävnad och normal vävnad.
Även 7000 celler från snitt av tonsill inkluderades som en form av kontroll, då
tonsillvävnad tidigare fungerat bra som utgångsmaterial.
RESULTAT
1. Påverkas morfologin i snitten samt mängden och kvaliteten på isolerat RNA av
dehydreringsprocessen?
Det blir bättre morfologi om man slutar dehydreringen vid 95% EtOH, istället för att fortsätta
till 99,5%, detta däremot på bekostnad av mängden RNA som kan isoleras, som framgår av
figur 5 där A representerar 95%, och B 99,5%. I båda fallen var RNA kvaliteten god.
(A)
(B)
Fig. 5. Kurvorna visar resultat från Bioanalyzer. De stora topparna representerar 18S och 28S rRNA. Tydliga
välseparerade toppar för 18S och 28S rRNA indikerar välbevarad RNA integritet, och en RNA kvalitet som är
tillräcklig för eventuella fortsatta analyser. En markörtopp (längst till vänster) ska också kunna ses vid lyckad
körning (här väldigt liten pga skalan på x-axeln). Observera skillnad i skala på x-axeln mellan A och B.
Figur 6 visar ett typiskt utseende hos en referens-RNA-stege vid lyckad körning.
Fig. 6. Sex toppar som visar hur Bioanalyzern tidsseparerar referens-RNAtranskript av olika storlek och en topp som visar en markör ska vara
synbara och väl avgränsade.
12
2. Har val av objektsglas någon betydelse för mängden och kvaliteten på isolerat RNA,
samt har autoklavering av objektsglasen någon betydelse?
Som framgår av figur 7 är membranglas bättre än vanliga objektsglas med avseende på
mängden RNA som kan isoleras från ett visst antal celler. Det verkar dessutom som om mer
RNA kan isoleras från glas som autoklaverats. Vid användning av autoklaverade
membranglas (A) kan endast en topp, 18S rRNA, urskiljas. Det har tidigare visat sig att det
kan hjälpa att späda provet och då få två tydligt urskiljbara toppar. Detta testades inte denna
gång, men troligtvis finns här tillräcklig mängd RNA av god kvalitet. Med icke autoklaverade
membranglas (B) erhölls två tydliga RNA toppar vilket antyder bra kvalitet och tillräcklig
mängd. Med autoklaverade vanliga objektsglas (C) blev resultatet att två små, men väl
avgränsade, RNA toppar var synliga. Vid användning av vanliga icke autoklaverade glas (D)
kunde RNA ej detekteras.
(A)
(B)
(C)
(D)
Fig. 7. Bioanalyzer-kurvor erhållna med RNA som preparerats med användning av:
(A) Autoklaverade membranglas. (B) Icke autoklaverade membranglas. (C) Autoklaverade vanliga objektsglas.
(D) Icke autoklaverade vanliga objektsglas.
13
3. Kan tillräckligt med RNA av god kvalitet isoleras från mikrodissekerat material från
hud?
Tilläckliga mängder RNA av god kvalitet kunde som figur 8 visar detekteras från
mikrodissekerat material bestående av ca 7000 celler. Den uppmätta RNA koncentration var i
prov från hud 5,6 ng/μl (medelvärde av två mätningar) och i prov från tonsill 9,9 ng/μl
(medelvärde av två mätningar)
(A)
(B)
Fig. 8. Bioanalyzer-kurvor erhållna med: (A) RNA isolerat från tonsill och (B) RNA isolerat från hud.
(Topparna för 28S rRNA bör i idealfallet vara högre eller lika höga som de för 18S.)
14
DISKUSSION
Lyckad isolering av RNA är ett första steg och ofta ett kritiskt steg i många analyser, t ex
analys av genuttryck. Isolering av RNA kan vara förknippat med ett flertal problem då RNA
snabbt bryts ner i rumstemperatur. Vi upplevde stundtals stora problem med att
överhuvudtaget kunna isolera RNA och i en experimentell process med många olika steg kan
det vara svårt att identifiera var problemet ligger. Val av färgnings- och fixeringsmetod kan
påverka kvalitet och koncentration av isolerat RNA och likaså kan närvaron av nedbrytande
enzymer.
RNA kan i rumstemperatur brytas ner av RNaser. RNaser är mycket stabila enzymer som är
svåra att inaktivera. Även efter långvarig autoklavering kan de bibehålla sin aktivitet. RNaser
finns överallt i omgivningen och även små mängder kan vara tillräckligt för att förstöra RNA i
ett prov. Vid RNA arbete är det alltså mycket viktigt att försöka skapa en RNas-fri miljö. Den
vanligaste källan till kontamination är RNaser som finns på huden, på dammpartiklar i luften
eller på det material som används. Det är därför viktigt att alltid använda handskar vid arbete
med RNA och att byta dem ofta. Man bör använda RNas-fria pipettspetsar, rör och annat
förbrukningsmaterial. Om möjlighet finns kan det vara bra att avsätta en viss arbetsyta till
RNA arbete och där använda särskilda pipetter, särskilt förbrukningsmaterial etc. Kemikalier
som används vid RNA isolering och analys bör reserveras för detta arbete och hållas separat
från kemikalier som används till annat, detta för att ytterligare minska risken för
kontamination.
Formalin är det mest använda fixeringsmedlet inom patologin. Rutinmässigt formalinfixeras
och paraffininbäddas alla vävnader. En nackdel med formalin är att det har en negativ
inverkan på kvaliteten hos isolerat DNA eller RNA, vilket leder till svårigheter vid analys av
gener och genfunktion. Färsk vävnad är då att föredra framför formalinfixerad
paraffininbäddad vävnad. I Biobanken har färsk vävnad, t ex operationsmaterial, samlats och
kan användas inom forskning. Vid den låga temperaturen under förvaringen i Biobanken är
RNA stabilt, då nedbrytande enzymer inaktiveras av den låga temperaturen. Under själva
fryssnittningen är temperaturen i kryostaten –25ºC. För att minska risken att RNA bryts ner
får man försöka arbeta snabbt, genast lägga snitten på torris och sedan förvara i -70ºC. Om
man snittar bort det översta skiktet på klossen kan man räkna med att RNA i provet är intakt.
Färsk vävnad måste fixeras för att motverka de normala nedbrytande processerna. Ett bra
15
fixeringsmedel ska vara förenligt med en så intakt och lättbedömd morfologi som möjligt.
Istället för formalin användes här ett zinkbaserat fixeringsmedel (ZBF) som visats bevara
RNA i vävnaden bättre. ZBF är dessutom ofarligt, billigt och lätt att framställa [14].
Användande av ZBF har tidigare visats fördelaktigt vid immunhistokemisk färgning av
paraffininbäddade vävnadssnitt [15] och vid isolering av RNA från mikrodissekerat material
[16]. Efter fixering bör vävnad dehydreras, då nedbrytande enzymer i vävnaden ej är
verksamma i avsaknad av vatten. Efter färgning, fixering och dehydrering ska man kunna
arbeta med snittet i rumstemperatur under mikrodissektionen utan att RNA påverkas
nämnvärt. Efter att de utvalda utskurna delarna överförts till extraktionsbuffert ska röret frysas
omedelbart för att motverka nedbrytning av RNA.
Vid mikrodissektion används ofta relativt tjocka snitt, med följd att den morfologiska
orienteringen blir försämrad och det kan vara svårt att tydligt urskilja olika strukturer. Detta
leder till en osäkerhet vid utskärningen. Vi kunde erhålla en bättre morfologisk bedömning
genom att stoppa dehydreringen vid 95% EtOH, men kunde då också se att mängden isolerat
RNA minskade. Man får här alltså göra en avvägning av vad man prioriterar, bättre morfologi
eller mer RNA.
Vilken typ av objektsglas som används påverkar dels mängden RNA som erhålls och dels den
tid och det arbete man får lägga ner. Antingen används membranglas (PALM), där ett
stabiliserande membran på objektsglasets yta tillåter att man skjuter upp stora intakta utskurna
bitar från snittet. Används vanliga objektsglas skjuts den utvalda biten upp med ett stort antal
skott, vilket gör att vävnaden går sönder i småbitar. Mer RNA kan isoleras från ett bestämt
antal celler om membranglas används, jämfört med vanliga objektsglas. Arbetet går dessutom
lättare och snabbare. Ett problem som uppstår när man arbetar med hud är att epidermis inte
fäster ordentligt på membranglas. Problemet som uppstår är att hela epidermis veckar ihop sig
och ställer sig på högkant mot utskärningsytan, vilken i princip omöjliggör mikrodissektion.
Anledningen till att detta händer vid arbete med hud och inte med annan vävnad är inte känd.
På vanliga objektsglas fäster epidermis bra. Att epidermis veckar ihop sig är främst ett
problem vid mikrodissektion av basallager i epidermis. Mikrodissektion av tumörvävnad
påverkas ej så mycket av detta då tumörvävnaden ligger djupare. Alltså användes
membranglas vid mikrodissektion av tumör. Vilken typ av glas som ska användas vid
mikrodissektion av basallager i epidermis återstår att besluta. Vi lyckades inte isolera RNA
från basallager i epidermis som mikrodissekerats från snitt på vanliga objektsglas och
16
katapultats med ett stort antal skott. Det är däremot svårt att säga om detta beror på glasen och
katapultsteget eller på att metoden då inte fungerade för att RNA bröts ner. Ett möjligt
alternativ till att katapulta upp de utskurna bitarna är att plocka upp dem för hand med hjälp
av en skalpell, vilket är tidskrävande och ställer stora krav på ett stabilt handlag. Det är
dessutom stor risk för kontamination som kan leda till degradering av RNA.
När vi efter lyckade inledande tester fick problem med att överhuvudtaget kunna detektera
RNA efter isoleringssteget blev målsättningen att först och främst identifiera felkällan och
åter få metoden att fungera. Efter att vi bytt ut de rör som användes, samt blandat nya
lösningar och noggrant rengjort de utrymmen som utnyttjas till RNA arbete, verkar metoden
nu fungera. En trolig förklaring är att rören som tidigare användes var kontaminerade.
Mängden RNA som kunde isolerades från ca 7000 celler är tillräcklig för realtids PCR. När
metoden nu fungerar kommer arbetet att gå vidare med att mikrodissekera specifika
cellpopulationer från tumörvävnad respektive normal basallager från ett antal patientfall med
BCC. Tio gener som är differentiellt uttryckta i BCC kommer att väljas ut för realtids PCR,
men vilka, som väljs ut är ännu inte slutgiltigt bestämt.
17
REFERENSER
[1] Alonso, L, Fuchs, E. Stem cells in the skin; waste not, Wnt not. Genes Dev 17 (2003) 1189-200.
[2] Watt F M, David M. Contribution of Stem Cells and Differentiated Cells to Epidermal Tumors, Nature 3
(2003) 444-451.
[3] Alonso L, Fuchs E. Stem cells of the skin epithelium, PNAS 100 (2003) 11830-835.
[4] Watt F M. Stem cell fate and pattering in mammalian epidermis, Current Opinions in Genetics and
Development 11 (2001) 410-417.
[5] Hanahan D, Weinberg R A. The hallmarks of cancer. Cell 100 (2000) 57-70.
[6] Knudson A G. Two genetic hits (more or less) to cancer. Nature Reviews 1 (2001) 157-162.
[7] Holíková Z, Massi D, Lotti T, Hercogová J. Insight into the pathogenesis of sporadic basal cell carcinoma.
International Journal of Dermatology 43 (2004) 865-869.
[8] Lear J T, Hoban P, Strange R C, Fryer A A. Basal cell carcinoma: from host response and polymorphic
variants to tumour suppressor genes. Clinical and Experimental Dermatology 30 ( 2005) 49-55.
[9] Cancer i siffror. Cancerfonden och Socialstyrelsen (2001) http://www. cancerfonden.com
[10] Wong C S M, Strange, R C, Lear J T. Basal Cell Carcinoma: Clinical review.
[11] Tetsushiko Tachikawa, Tarou Irié. A new molecular approach in morphology: basic method and
application of laser microdissection. Med Electron Microsc 37 (2004) 82-88.
[12] David J. Duggan, Michael Bittner, Yidong Chen, Paul Meltzer, Jeffrey M. Trent. Expression Profiling using
cDNA microarrays. Nature Genetics Supplement 21 (1999) 10-14.
[13] Asplund A, Gry Björklund M, Nilsson P, Pontén F, and Lundeberg J. Transcript Profiling of Microdissected
Cell Populations Selected from Basal Cells in Normal Human Epidermis and Basal Cell Carcinoma, Manuscript
[14] Wester K, Asplund A, Bäckvall H, Micke P, Derveniece A, Hartmane I, Malmström P-U, Pontén F. Zinkbased fixative improves preservation of genomic DNA and proteins in histoprocessing of human tissues.
Laboratory Investigation 83 (2003) 889-899.
18
[15] Beckstead J H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded
tissues. J Histochem Cytochem 42 (1994) 1127-1134.
[16] Scheidl SJ, Nilsson S, Kalen M, Hellstrom M, Takemoto M, Hakansson J, Lindahl P. mRNA expression
profiling of microbeam microdissected cells from slender embryonic structures. Am J Pathol 160 (2002) 801813.
19
20
21
