Föreläsning 1
Molekylär Bioteknik HT 2007
Molekylär bioteknik
Molekylärbiologi
Mikrobiologi
Transgena djur
Biokemi
Genetik
Molekylär
bioteknik
Kemiteknik
Cellbiologi
Rekombinant proteinproduktion
-terapeutika
-diagnostik
-vaccin
-växter
-djur
Diagnostik
Förståelse av sjukdomar
-genetisk predisposition
-detektion av patogener
Förståelse av cellbiologi
-signalöverföring
-differentiering
-celldöd
-infektiösa: HIV, Hepatitis
-genetiska: cancer, Alzheimer, CF
Vad är en gen?
gen
promotorer
signalpeptid
transkriptionsstart
RBS
transkriptionsterminering
TAA
TAG
TGA
ATG
GTG
TTG
strukturell gen
transkriptionsenhet
Prokaryot transkription/translation
RNA polymeras
SD
SD
SD
SD
SD
P
ribosomer
SD
polycistront mRNA
SD
proteiner
-operon
-kopplad transkription/translation (cytopl.)
Eukaryot transkription/translation
exon
P
intron
SD
transkription
primärt mRNA
(monocistront)
cellkärnan
processning
5’Cap
AAAA
splicing
5’Cap
AAAA
export
5’Cap
AAAA
translation
protein
cytoplasman
Molekylärbiologiska verktygslådan
• Enzymer
-restriktionsenzymer
-ligaser
-DNA-polymeraser
-omvänt transkriptas (RT)
-kinaser
-polynukleotidtransferaser
-fosfataser
• Oligonukleotidsyntes
-primers
-prober
-gene assembly
• DNA sekvenering
-Maxam-Gilbert
-Sanger
-pyrosekvenering
• PCR
• Transformering
• In vitro mutagenes-heat-shock
• Vektorer
-plasmider
-fager (M13, λ)
-cosmider
-YACs
-virus
• Värdceller
-bakterier
-jäst/svampar
-växtceller
-insektsceller
-mammalieceller
-elektroporering
-partikelbombardemang
-mikroinjektion
-transfektering
• Selektionsmetoder
-antibiotika resistens
-genetisk komplementering
• Screeningmetoder
-genotypisk
-fenotypisk
Kloning - Expression
Enzymer
Restriktionsenzymer
• Specifika DNA-sekvenser (4-8bp) känns igen och klyvs av restriktionsenzymer
• Igenkänningssekvensen (RS) är ofta en palindrom, d v s kan läsas från båda håll
• Specifika metylaser metylerar baser i RS varmed bakteriens eget DNA skyddas
från klyvning
EcoRV
GATATC
CTATAG
GAT
CTA
ATC
TAG
”blunt end”
EcoRI
PstI
GAATTC
CTTAAG
G
AATTC
G
CTTAA
CTGCAG
GACGTC
CTGCA
G
G
ACGTC
”sticky ends”
Restriktionsenzymer
Restriktionsenzymer
Ligaser
• Ligaser återskapar fosfodiesterbindningar genom att 5’-fosfatgruppen förenas
med fria 3’-hydroxylgruppen. Ett vanligt använt ligas är T4-DNAligas.
• Ligaser används för att ”klistra ihop” DNA-fragment med varandra.
G-OH P-GATCC
CCTAG-P HO-G
+ T4-DNAligas, ATP
GGATCC
CCTAGG
kan återklyvas med BamHI
(5’-GˇGATCC-3’)
G-OH P-GATCT
CCTAG-P HO-A
+ T4-DNAligas, ATP
G GATCT
CCTAG A
kan ej återklyvas med BamHI
(5’-GˇGATCC-3’)
DNA-polymeraser
• DNA-polymeraser inkorporerar deoxynukleotider (dNTPs) till en
växande DNA-kedja genom att addera dessa dNTPs till den fria 3’OH-gruppen på kedjan med motstående DNA-sträng som templat.
Några vanligt använda polymeraser är DNA-polymeras I samt T7DNA polymeras.
• De används bl a för att:
-generera blunt-ends
-vid sekvensreaktioner
G
CCATG
+ dNTPs, polymeras
GGTAC
CCATG
Omvänt transkriptas (RT)
• Omvänt transkriptas (RT) syntetiserar en komplementär DNAsträng utifrån ett RNA-templat. Retrovirus (ex HIV) använder
denna mekanism för att göra en DNA-kopia av sitt RNA-genom.
• Tekniskt användningsområde:
-utnyttjas i ett steg då man vill göra cDNA.
mRNA 5’Cap
AAAAA 3’
TTTTT 5’
omvänt transkriptas
+ dNTPs
mRNA 5’Cap
cDNA
3’
AAAAA 3’
TTTTT 5’
Terminaltransferas
• Terminaltransferas adderar nukleotider till 3’-änden av DNAkedjor.
• De används bl a för att generera kohesiva ändar från blunt-end
fragment och vid cDNA-syntes.
5’
3’
+
3’
dATP
5’
dTTP
terminaltransferas
3’
AA…AA-OH
5’
HO-TT…TT
3’
5’
ligering
5’
AA…AA
3’
3’
TT…TT
5’
Fosfataser och kinaser
• Fosfataser tar bort fria 5’-fosfatgrupper från DNA
-används för att minimera bakgrundsligering av självligerad vektor
vid kloningsförsök
-vanliga fosfataser är shrimp- samt bovine alkaline phosphatase
• Kinaser adderar fosfatgrupper till 5’ änden av DNA
-används för att fosforylera syntetiskt DNA (ex linkers) före
ligering till vektor
-polynukleotidkinas (PNK)
Kloning - Expression
DNAsekvenering
Maxam-Gilbert-sekvenering
1.
5’
3’
2.
3’
3.
3’
3’
5’
dubbelsträngat DNA
3’
märk med 32-P
3’
klyv med RE
preparera enkelsträngat
DNA
4.
5.
selektiv kemisk
degradering av
specifika baser
G
A+G T+C
C
6. G
A
+
G
T
+
C
C
C
G
A
C
A
C
T
G
A
C
T
G
A
T
Sanger-sekvenering
Sangers dideoxymetod
P
5’-märkt
oligonukleotid
P
P
O CH23
Bas
O
H
H
H
H
H
ssDNA
H
2’,3’-dideoxyanalog
+ DNA-polymeras
+ dNTPs
T C G A
+ ddATP
A
+ ddCTP
C
A
+ ddTTP
T
G
C
A
+ ddGTP
T
G
C
G
T
G
T
C
G
A
C
T
G
C
A
A
T
Pyrosekvenering
Light intensity
is proportional
to the number
of nucleotides
incorporated
2xT
LIGHT
Photomultiplication
on CCD camera
A
CAT
Addition order
A T G C AT...
Kloning - Expression
PCR
PCR (Polymerase chain reaction)
94°C
DNA-templat
94°C ⇒ separation av DNA-strängarna
45-65°C
45-65°C ⇒ annealing av specifika primers
72°C ⇒ extension
(värmestabilt Taq polymerase)
72°C
Upprepa 25-40 cykler ⇒ exponentiell ökning av mängden produkt
Kloning - Expression
Mutagenes
In vitro mutagenes
Riktad mutagenes
Slumpmässig mutagenes
Studera effekter av
enstaka mutationer
Screena/selektera för
intressanta mutationer
Riktad mutagenes
TTC
AAG
Exempel:
TTC → TAC
Ser → Tyr
Denaturera och hybridisera
med mutant oligonukleotid
TAC
AAG
Komplementära, syntetiska
oligonukleotider med den önskade
mutationen:
DNA-polymeras + DNAligas
TAC
AAG
TAC
TTC
AAG
TTC
Transformera bakterier
TTC
AAG
TAC
AAG
Kloning - Expression
Vektorer
Plasmider
• Plasmider är cirkulärt extrakromosomalt DNA
• De används som vektorer = bärare av främmande DNA
-utnyttjas för detta ändamål vid kloning och proteinexpression
-insert ≤ 5 kb
• Plasmidvektorer innehåller generellt:
-ori (origin of replication)
-gen/er för selektion (ofta antibiotikaresistens)
-multikloningssite
-ibland gen för screening (t ex lacZ för blå-vit screening)
• Olika typer av plasmidvektorer har olika ”copy nr”
• Plasmider tillhör olika inkompatibilitetsgrupper. Två olika
vektorer tillhörande samma inkompatibilitetsgrupp kan ej
propageras samtidigt i en och samma värdcell.
Bakteriofag λ
Bakteriofag λ
• Bakteriofag λ är ett virus som infekterar bakterier (E. coli).
-de kan ha en lytisk och en lysogen fas.
-de har ett genom om ca 45 kb, varav en central region,
omfattande ca 15 kb, ej behövs för dess replikation.
-i vardera ände av genomet finns enkelsträngade komplementära
kohesiva ändar (COS-sites). Dessa utnyttjar fagen för att göra
konkatamerer av sitt genom inför packning i fagpartiklar.
• λ-genomet har modifierats så att det passar som vektor. Bl a har
unika sites introducerat på vardera sida om den centrala regionen,
vilka kan utnyttjas för att ersätta denna med främmande DNA.
-insert måste ha en storlek om ca 15 kb, annars kan infektiösa
fagpartiklar ej packas.
• λ används för kloning av genomiska fragment, eftersom
plasmider inte lämpar sig som bärare av större fragment.
Cosmider
• Cosmider är hybrider av plasmider och λ fager. De innehåller:
-ori
-gen för antibiotikaresistens (ex Tet)
-cos-sites
-kloningsites
• Cosmider utnyttjas för kloning av genomiskt DNA när större
fragment än 15 kb används (gränsen för vad lambda kan
härbärgera). De kan bära ca 45 kb insert.
cos
vektor DNA (cosmid)
antibiotika-resistens
gen
genomiskt DNA
Yeast artificial chromosome (YAC)
• YACs innehåller:
-autonomously replicating sequence (ARS) från jästkromosom
-centromer (CEN), vilken bidrar till stabil fördelning av YACs
mellan moder- och dotterceller
-två telomerer, vilka fungerar som kromosomändar och därmed
möjliggör replikation av YACs i form av små linjära kromosomer.
-selekterbara markörgener, ex LEU2 vilken komplementerar Leunegativa stammar.
-kloningsites
• YACs används för kloning av mkt stora genomiska DNAfragment (100-2000 kb)
telomer
LEU2
ARS
CEN
50 kb
jäst DNA
telomer
Kloning - Expression
Värdceller
Värdceller
Olika vektorer används för att introducera rekombinant
DNA i olika typer av värdceller, t ex:
• Bakterier
•
•
•
•
Jäst
Insektsceller
Däggdjursceller
Växtceller
- E. coli är vanligast
- Höga expressionsnivåer
- Möjlighet till storskalig produktion.
Eukaryota celler
Post-translationella modifieringar
(t ex glykosylering) möjliga
Kloning - Expression
Selektionsmetoder
Antibiotika-resistens
Vanliga antibiotika inom molekylärbiologi:
-
ampicillin
carbenicillin
kloramfenikol
tetracyklin
kanamycin
Transformera bakterier
med ligerad plasmid
Klonad gen
Inhiberar syntes av cellväggen
Inhiberar proteinsyntes
Sprid ut bakterierna och
låt växa på agar-platta med
antibiotika
Gen för
antibiotikaresistens
Plasmid
Endast bakterier som tagit upp
plasmid med antibiotika-resistens
överlever och ger upphov till
kolonier
Kloning - Expression
Screeningmetoder
Genotypisk screening
• Probhybridisering
– känd nukleotidsekvens
• 15 nukleotiders prob
– okänd nukleotidsekvens
• guessmer, ca 50 nukleotider (unik)
Längre pga risk för mismatch
• degenererad prob, ca 17 nukleotider
baserad på aa-sekvens (6 st)
Fenotypisk screening
• Aktivitets-screening
– ex. proteasaktivitet (subtilisin)
• odling på kasein-medium
• klart område runt koloni
• Immunoscreening
– antikropp mot proteinet
Blå-vit screening
EcoRI site
LacZ
AmpR
Transformera bakterier och
odla på agar-plattor med
ampicillin och X-gal
H
N
OH
OH
O
H
OH
H
H
OH
O
Br
H
H
Cl
X-gal
Kloning av ett fragment i EcoRI
sitet förstör LacZ, som kodar för
enzymet β-galaktosidas
- endast bakterier som har tagit upp
plasmid är resistenta mot ampicillin
och kan växa
- bakterier utan klonat fragment har
funktionellt β-galaktosidas och bildar
en blå produkt av substratet X-gal
- bakterier med klonat fragment
saknar funktionellt β-galaktosidas och
bildar vita kolonier
