Avdelningen för kemi och biomedicin
Karlstads universitet
Laboration v.40
Detektion av Legionella pneumophilia med nestad
PCR
Frågeställning: Vattenlednings system med tillväxt av Legionella pneumophilia eller
Patient med misstänkt Legionella pneumophilia infektion=>
Isolering av Bakterien Legionella pneumophilia. Provtagning; vattenprov med
filtrering eller BAL alt sputum prov) =>
Preparering av Legionella pneumophilia DNA=>
Amplifiering av DNA;
PCR steg 1 =>
PCR steg 2 =>
Detektion av amplifierat Legionella pneumophilia DNA på agarose gel.
Enzymatisk amplifiering mha PCR av specifika sekvenser för detektion av bakterier, virus
eller parasiter är en mycket användbar metod, speciellt i de fall där odling, serologi etc
visat sig vara otillräckliga och/eller för långsamma.
I laborationen har vi valt att detektera Legionella Pneumophilia (L.pneumophilia) mha
PCR. För att öka specificiteten och sensitiviteten så har vi valt att använda en PCR som
bygger på amplifiering i två steg med två olika primerpar, en sk nested PCR. Den nestade
PCRen för detektion av L.pneumophilia är utformad så att det första PCR steget
amplifierar en region som är ca 625 bp i 30 cykler. 1/50 (1µl ) av produkten från denna
första amplifiering tas därefter ut till ett ytterligare PCR steg, i detta andra steg
amplifieras i 30 cykler en region som är ca 450 bp, inom det 625 bp fragmentet. Storleken
på PCR produkterna från steg 1 och 2 analyseras därefter på en EtBr inmärkt agarosgel.
PCR produkterna från PCR reaktionens första steg analyseras på gel eftersom det bland
annat kan ge en indikation om koncentrationen bakterier i ursprungsprovet var högt eller
lågt.
Den nestade PCRen ökar som sagt specificiteten men också sensitiviteten till viss del
eftersom amplifieringen totalt körs 60 cykler och detta hade inte varit möjligt med ett
enda primerpar det hade ökat icke specifika bakgrunds produkter.
Inom de amplifierade fragmenten dvs PCR produkterna från amplifieringen med de
legionella primers ni ska använda finns också ett restriktions-site, som kan användas för
att ytterligare verifiera att det är rätt DNA fragment dvs sannolikheten ökar ytterligare att
det verkligen är L.pne patienten har. Detta ska dock vi inte göra i denna lab.
Man kan också detektera PCR produkterna på andra sätt än på gel tex. mha dot-blot och
ELISA men i båda dessa detektionssätt behövs en sk probe en enkelsträngad oftast märkt
DNA sekvens som binder PCR produkter med rätt sekvens.
Mer och mer börjar man använda real-tids PCR med fluorescerande nukleotider och
smältpunktsanalys eller probe för detektion. Real-tids PCRen möjliggör detektion av PCR
produkter i real-tid dvs man mäter koncentrationen PCR produkt efter varje cykel vilket
gör att man även kan bestämma koncentrationen på DNA´t man har i sitt prov.
Laborations utförande Dag 1-Dag2:
1.)DNA preparation av L.pneumophila bakterier.
Varje grupp skall analysera minst ett positivt och ett negativt prov.
DNA preparationerna skall göras i ”provpreparerings/provtillsats-rummet” (om möjligt
gör i ordning en separat del av eran bänk yta som är avsatt för detta). Vi ska använda oss
av ett kit från QIAGEN (DNeasy tissue kit ) se separat beskrivning (DNeasy Tissue
Handbook) finns på nätet och på kurshemsidan. Med hjälp av denna beskrivning ska ni
själva leta er fram till metod delen för ”framrening av DNA från Gram negativ bakterie”.
OBS! I sista steget ska ni eluera ut erat DNA i en totalvolym som räcker till PCR (10µl),
spektrofotometer mätning (ca 50-100µl) och analys på gel (ca 10-20µl).
2.)Koncentration och renhetsmätning i spektrofotometer
På DNA´t som ni renat fram med DNeasy tissue kit ska en ungefärlig koncentration och
renhet bestämmas i spektrofotometer vid 260 respektive 280 nm. Mätningen sker i quartz
kyvett. En del av det framrenade provet tex 1/5del spädes med vatten till en volym på
500µl. Nollställ spektrofotometern med vatten och mät vid 260 respektive 280 nm. Vid
260 nm absorberar nukleinsyra (DNA och RNA) ljuset, ett absorberat värde 1 motsvarar
en koncentration på ca 50 µg/ml. Räkna ut vilken koncentration nukleinsyra du har i ditt
(ospädda) prov. Vid 280 nm absorberar vissa aminosyror (de aromatiska) ljus värdet vid
280nm kan därför ses som ett mått på mängden protein, genom att ta kvoten på värdet
2
vid 260 nm genom värdet vid 280 nm så får man en uppskattning om renheten (mängden
nukleinsyra i förhållande till mängden protein). I DNA tissue kit hittar ni en hel del tips
som ni kan använda vid koncentrations och renhets mätning och tolkning.
3.)PCR förberedelser. Läs informationen i ”Taq PCR Handbook” innan
du ”sätter
upp”/startar dina PCR reaktioner. Ta reda på vad en mastermix är (se nedan) och
vad syftet med denna är. Fundera över om man verkligen kan pipettera 1
mikroliter (µ
µl) exakt? Ni kan gå ihop flera grupper och blanda en större
mastermix tillsammans om ni tror att det ökar noggrannheten.
Innan ni börjar blanda mastermix (reagensen till alla PCR reaktionen) måste ni
fundera igenom hur ni på bästa sätt kan undvika kontamination. Fundera på hur
ni på bästa sätt skulle organisera de olika rummen (bänkytorna) för blandning av
rena reagens och provtillsats renat DNA och PCR produkt steg 2 om ni arbetade
på ett rutin lab.
4.)PCR steg 1, reagens
”Tag PCR core kit”
I PCR steg 1 används primers Lmip 920 (5´-GCT ACA GAC AAG GAT AAG TTG-3´) och
Lmip 1548 (5´-GTT TTG TAT GAC TTT AAT TCA-3´).
I ”rena reagens rummet” blandas PCRens reaktions mix den sk ”master mixen” .
Volymerna per prov är följande; 24.7 µl vatten, 5 µl 10x PCR buffert, 6 µl Mg 2+ (25 mM), 2
µl dNTP-mix (10mM vardera av dATP, dTTP, dGTP dCTP),1µl primer Lmip 920 (50 µM), 1
µl primer Lmip 1548 (50 µM) och 0.3 µl Taq-polymeras (5 unit/µl).
Mängderna ovan är angivna för ett prov om fler prov ska analyseras ex. 3 så blandas ca 3.2
gånger mängden av allt (annars räcker det oftast inte, eftersom det blir ett svinn i rör och
pipett tipp), detta mixas noga och pytsas upp på 3 rör (i detta fall 40 µl till varje rör) för att
få exakt samma proportioner av alla de ingående reagensen (detta är annars svårt att få när
man pipetterar så liten mängd av så många olika saker).
Rören med ”master mix” tas sedan till ”provpreparerings/provtillsats-rummet ” där 10 µl
prov (legionella DNA eller vatten) tillsätts.
Proven placeras i PCR apparaten och körs i ett program med följande temperaturer och
tider; 94oC i 15 minuter, 30 cykler i 94oC i 30 sek., 50oC i 30 sek., och 72oC i 60 sek.. Och
slutligen 72oC i 6 minuter.
3
5.)PCR steg 2, reagens
”Tag PCR core kit”
I PCR steg 2 används primers Lmip 976 (5´-TAA AAA TCA AGG CAT AGA TG -3´) och
Lmip 1427 (5´-AGA CCT GAG GGA ACA TAA AT -3´).
I ”rena reagens rummet” blandas ”master mixen” , volymerna per prov är; 33.7 µl vatten, 5
µl 10x PCR buffert, 6 µl Mg 2+ (25 mM), 2 µl dNTP-mix (10mM vardera av dATP, dTTP,
dGTP dCTP),1 µl primer Lmip 976 (50 µM), 1 µl primer Lmip 1427 (50 µM) och 0.3 µl Taqpolymeras (5 unit/µl).
Rören med 49 µl ”master mix” tas sedan till ”provtillsats-rummet nestade-steget” där 1µl
av PCR produkterna från steg 1 överförs till respektive mix.
Proven placeras i PCR apparaten GenAmp PCR System 2400 och körs i ett program med
o
o
o
följande temperaturer och tider; 94 C i 15 minuter, 30 cykler i 94 C i 30 sek., 55 C i 30 sek.,
o
o
och 72 C i 60 sek.. Och slutligen 72 C i 7 minuter.
6.) Analys av storlek på PCR produkter och koncentration/renhet på det framrenade
DNA´t på agarosegel
Blanda TAE-buffert (Tris-acetat-EDTA) så att det räcker till en gel och ett litet geltråg
Recept på TAE-buffert hittar ni på nätet eller i Manniatis.
Gjut en 1.5-2.5% agarosgel (vikt/volym%). Använd dom små gelhållarna som rymmer ca
40 ml gel. Tag rätt mängd agaros och blanda med TAE-buffert, lös upp agarosen genom
att koka blandningen i mikrovågsugn. Lösningen är färdig kokt då den är helt
genomskinlig. Låt sedan lösningen svalna till 55oC (bäst att använda vattenbad) tillsätt då
2 µl EtBr (ethidiumbromid 10 mg/ml). Tejpa kanterna på gelhållaren och se till att den
står plant. Häll i gelen (ca 5 mm hög) och sätt i 2 kammar (med breda tänder). OBS! då ni
häller gelen får den inte vara kallare än 50oC, häll den därför direkt efter att ni tillsatt EtBr
och blandat försiktigt. Låt svalna i rumstemperatur och ställ sedan gelen i kylen minst 10
minuter innan ni tar ur kammarna. Om gelen inte skall användas direkt så förvara den
inslagen i gladpack i kylen.
PCR produkterna från steg 1 och 2 tas från kyl till ”amplifierat-material rum”. Här blandas
15 µl av varje PCR produkt med 3 µl färglösning (BPB) på en bit parafilm innan det
pipetteras på gelen. Av molekylviktsmarkören tas 2-5 µl plus 3µl färg.
Molekylviktsmarkören placeras någonstans i mitten på varje gel rad. Vilken storlek har
banden i molekylviktsmarkören? Vilken koncentration DNA per mikroliter finns i
markören och vilken koncentration har varje band per mikroliter? Försök hitta detta på
nätet. Firma och namn på molekylviktsmarkören står på rörets etikett dessa kan ni
använda som sökord på nätet.
Gelelektroforesen körs vid 50-75 V i ca 80 minuter (det negativt laddade DNA´t vandrar
mot den positiva polen), därefter placeras gelen på UV bordet och fotograferas. Resultatet
4
analyseras. I labrapporten skall gelen beskrivas så noga som möjligt. Mha MW-markören
får ni reda på om storleken på PCR produkterna verkar stämma. Ni får även en möjlighet
att uppskatta koncentrationen på det framrenade DNA´t mha markören.
Om någon grupp inte får ett resultat från gel analysen som kan användas, så ska ni anta att ni
hade fått det resultat som visas i figuren nedan i brunn 2, 3, 4, 5, 14 och 8 samt 16. Analysera
detta resultat som om det vore erat eget;
1
2 3 4 5 6
7 8
9 10 11 12 13 14 15 16
Figur X: Brunn: 1; 50bp ” track it” storlek på band dvs baspar (bp) anges ej för denna
markör eftersom den är nedbruten), 2; steg1 pos, 3; steg 1 neg, 4; steg 2 pos, 5; steg 2
neg6; DNA pos (syns ej fast det borde), 7;DNA neg, 8; MW markör 100bpladder
totalt har 2 µ l av denna markör à 0.5 µg/µl satts på gelen Storlek på band i
bp100,200,300, 400, 500(dubbelt så många av denna storlek därför är detta band
tjockare),600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400).
Brunn 9-16 samma som 1-8 ovan. (fast här syns även positivt i brunn 11 i steg 1
negativt och framrenat DNA brun 14 (totalt 10 µl satt på gel).
5
6
7
