Kopiera DNA med hjälp av
PCR-metoden
Niklas Dahrén
PCR-metoden
ü
ü
ü
ü
PCR=Polymerasechainreac/on.
KopierauppspecifikaDNA-sekvenser:MedhjälpavPCRkanviväljautdeområdeniDNA:t(t.ex.STRområdenellerspecifikagener)somvivill/IanärmarepåochkopierauppdessaDNA-områden/DNA
sekvenseriväldigtstoramängder.VikaneLerkopieringenköravårakopieradeDNA-områdenien
elektrofores(gelelektroforesellerkapillärelektrofores),somsorterardessau/frånstorlek,ochsedan
analyseraresultatet.
NärPCR-metodenkompå80-taletsårevoluAoneradedetbl.a.kriminalteknikeneLersomdetnuräckte
medyIerstsmåmängderDNAfrånbroIsplatsenföraIkunnagöraenDNA-analys.
NobelprisetförPCR-metoden:KaryMullisficknobelprisetimedicin1993förhansuppfinningavPCR
metoden.
Användningsområden
ü
ü
ü
KriminaltekniskDNA-analys:Bindaenmisstänkt/llenbroIsplats.
Faderskapstest:Taredapåomenvisspersonärbarnetspappa.
MedicinskDNA-analys:Diagnos/ceragene/skasjukdomarochupptäckavirus-och
bakterieinfek/oner.
En modern PCR-apparat
Bildkälla:"PCRmasinakasutamine"byKarlMumm-Ownwork.LicensedunderCCBY-SA3.0viaWikimediaCommons-hIp://commons.wikimedia.org/
wiki/File:PCR_masina_kasutamine.jpg#mediaviewer/File:PCR_masina_kasutamine.jpg
”Ingredienser” som behövs för att kunna kopiera
DNA:t i en PCR-apparat
DNA-nukleoAder:DessaärbyggstenarnasombehövsföraIbyggadenyaDNA-strängarna.Taqpolymerasetsammanfogardessamedvarandranärsträngarnabyggs.
Primers:Kortanukleo/dsekvenser(ca20nukleo/der)sombinder/llutkantenavdeområdenviska
kopiera(t.ex./llutkantenavolikaSTR-områdenaeller/llspecifikagener).Dessafungerarsom
startpunktersåaIDNA-polymerasetvetvartkopieringenskastarta.Detärvik/gtaIhaprimerssomär
väldigtspecifikafördeområdenvivillkopiera,annarsärriskenaIvåraprimersbinder/llmångaställeni
DNA-molekylernaochaIvidärmedfåreIfelak/gtresultat.
ü Taq-polymeras(DNA-polymeras):Taq-polymerasliknarDNA-polymerasetochanvändsföraIbyggade
nyaDNA-strängarna(görakopiorna).DeIaenzymtåldockhögvärmemycketbäIreänDNA-polymeras
ochfungerardärförbraidehögatemperaturersomvimåstehaivårPCR-apparat.Taq-polymerasethar
forskaretagitfråndenvärmetåligabakterienThermusaqua+cus.
ü
ü
ü Buffertlösning:StabiliserarpH-värdetpåräInivåochinnehållerbl.a.magnesiumsombehövsföraI
DNA-polymerasetskafungeraop/malt.
PCR-metoden sker i 3 temperatursteg
1.
2.
3.
Denaturering,ca94-96grader.
Annealing,ca53-68grader.
Elongering,ca72grader.
Bildkälla:ByEnzoklop(Ownwork)[CCBY-SA3.0(hIp://crea/vecommons.org/licenses/by-sa/3.0)],viaWikimediaCommons
PCR-reaktionen sker i 3 temperatursteg som
vanligtvis upprepas
i 20-40 cykler
Elongeringvidca72grader:ViddennatemperaturarbetarTaq-polymerasetsomallraeffek/vast.Taq-
ü Denatureringvidca94-96grader:DenhögatemperaturengöraIvätebindningarnamellanDNAsträngarnaförsvagasochaIdebådaDNA-strängarnadärmedseparerarfrånvarandra.Ivåracellerär
detenzymet”Helikas”plusfleraandraenzymersomsköterdennaganskakompliceradeprocess.
UtanförcellernaärdetbetydligtläIareaIfådennaprocessaIfungeragenomaIhöjatemperaturen
pådeIasäI.
ü Annealingvidca53-68grader:Viddennatemperaturfästervåraspecifikaprimers/llutkantenavde
områdenviskakopiera.Dennatemperaturkanskiljasigåtberoendepåvilkaprimersvianvänderossav
(storlekenavdessaochävennukleo/dsekvensenidessapåverkareLersommångaG-Cinnebärfler
vätebindningar).FörhögtemperaturinnebäraIvåraprimersharförmycketrörelseenergiochdärmed
harsvårtaIbinda.FörlågtemperaturkaninnebäraaIvåraprimersbinderospecifikt(kanfastna”lite
överallt”).
ü
polymerasetkopierardeutvaldaområdenagenomaIsammanfoganukleo/dermedvarandramed
originalsträngarnasommall.
Äldre PCR-apparater bestod av 3 vattenbad
med olika temperaturer!
Bildkälla:"PCRmasinakasutamine"byKarlMumm-Ownwork.LicensedunderCCBY-SA3.0viaWikimediaCommons-hIp://
commons.wikimedia.org/wiki/File:PCR_masina_kasutamine.jpg#mediaviewer/File:PCR_masina_kasutamine.jpg
Tips på filmklipp att titta på:
ü hIps://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
(anima/on).
ü hIps://www.youtube.com/watch?v=jZ7Hr_QRpQs
(filmfrånHögskolaniDalarna). SegärnaflerfilmeravNiklasDahrén:
hXp://www.youtube.com/KemilekAoner
hXp://www.youtube.com/MedicinlekAoner
