Beteckning:________________
Institutionen för matematik, natur- och datavetenskap
Mordet i salladsdisken
- utveckling av en PCR-baserad laboration för
Gymnasiet
Niklas Hedqvist
Ht-2008
10p C-nivå
Lärarprogrammet 180p
Examinator: Christina Hultgren Handledare: Anna Lindvall
Sammanfattning: Det har nyligen skett ett mord i salladsdisken i närbutiken. Så börjar
inledningen till detta arbete. Syftet med studien var att ta fram en PCR-baserad
genetiklaboration med RAPD-primer som är lärorik och intressant för gymnasielever i de
naturvetenskapliga ämnena. RAPD är en metod där endast en primer används, till skillnad
från de flesta andra PCR-metoder som använder två stycken primer. Laborationen har aldrig
gjorts förut, vilket lett till att en stor del av arbetets tyngd ligger i att metodutveckla
laborationen och sedan testa laborationen på en testgrupp. Testgruppen bestod av 9
gymnasieelever som läser naturkunskap B. Resultatet visade att 8 av de 9 elever som gjorde
laborationen ansåg att laborationen bör ingå i naturkunskap B. Enkätundersökningen visar
även att genetiklaborationen med RAPD primer höjde intresset för genetik och genteknik hos
försökspersonerna. Slutsatsen är att laborationen lämpar sig mycket väl för att öka intresset
för genetik och genteknik bland gymnasieelever.
Nyckelord: Genetik, genteknik, laboration, PCR, pedagogik, RAPD
i
Innehållsförteckning
Innehållsförteckning ................................................................................................................ i
1 INLEDNING ........................................................................................................................... 1
1.1 Syfte ................................................................................................................................. 1
1.2 Bakgrund .......................................................................................................................... 1
1.3 Litteraturgenomgång ........................................................................................................ 2
1.3.1 DNA uppbyggnad ..................................................................................................... 3
1.3.2 Proteinsyntes ............................................................................................................. 3
1.3.3 PCR ........................................................................................................................... 3
1.3.4 Laboration som pedagogiskt hjälpmedel. ................................................................. 4
1.3.5 RAPD ........................................................................................................................ 5
1.4 Frågeställningar ................................................................................................................ 6
2 METOD ................................................................................................................................... 7
2.1 Urval ................................................................................................................................. 7
2.2 Etiska överväganden ........................................................................................................ 7
2.3 Datainsamlingsmetoder .................................................................................................... 7
2.4 Metodutveckling............................................................................................................... 8
2.4.1 Isolering .................................................................................................................... 8
2.4.2 PCR .......................................................................................................................... 8
2.4.3 Elektrofores och analys ............................................................................................ 9
2.5 Pilotstudie ......................................................................................................................... 9
3 RESULTAT .......................................................................................................................... 11
3.1 Metodutveckling............................................................................................................. 11
3.2 Pilotstudie ....................................................................................................................... 12
4 DISKUSSION ....................................................................................................................... 14
4.1 Metodutveckling............................................................................................................. 14
4.2 Pilotstudie ....................................................................................................................... 16
REFERENSER ......................................................................................................................... 18
Bilaga 1 ................................................................................................................................ 20
Bilaga 2 ................................................................................................................................ 21
Bilaga 3 ................................................................................................................................ 22
Bilaga 4 ................................................................................................................................ 26
ii
1
1 INLEDNING
Det har nyligen skett ett mord i salladsdisken i närbutiken. Kriminalkommissarien och hans
kriminaltekniker har kunnat säkerställa förövarens DNA från offret. Men på grund av
varierande omständigheter har de inte tid att fortsätta med brottsgåtan, utan de har hyrt in er
för att lösa uppgiften. De finns ett antal misstänkta gärningsmän som har setts på mordplatsen
vid den ungefärlig tid då mordet uträttades. Nu är er uppgift att genom en DNA-analys av de
olika misstänkta säkerställa vilken som är mördaren. Detta är inledningen till laborationen
”Mordet i salladsdisken” och grundidén till mitt examensarbete är att göra genetik och
genteknik intressant i en laborativ miljö. Mitt intresse för genetik väcktes på Högskolan i
Gävle när jag läste kurserna Cellen och livsprocessen och Populationsgenetik ur ett
molekylärbiologiskt perspektiv. Det som öppnade mina ögon för gentiken var just
laborationerna. Kurslitteratur kan vara förvillande med alla nya begrepp, och det hjälpte att få
använda kunskaperna praktiskt som i sin tur ledde till en djupare förstålelse. För att öka
intresset för genetiken är laborationen kopplad till någonting som de flesta elever känner igen
och kan ha en relation till, DNA. Kriminalserier går dagligen på tv så de flesta elever vet vad
det är. Det är också viktigt att eleverna får praktiska tillämpningar i ett ämne som genetik
eftersom det avsnittet innehåller många nya begrepp (Strömberg 2006) . Det är bra om
eleverna får läsa, höra, skriva och jobba med ämnet praktiskt. Det ökar på så sätt elevens
chans för inlärning (Bjerg 2000). Det är också viktigt att förankra begrepp och jobba med en
långsiktig inlärning (Wallin et. al 2005).
1.1 Syfte
”Mordet i salladsdisken” är en laboration framtagen för att öka intresset för genetikstudier.
Med inspiration från dagens omåttligt populära kriminalserier så får gymnasieeleverna testa
på att vara kriminaltekniker och analysera DNA från de olika misstänkta gärningsmännen eg.
salladssorterna. Genetiklaborationen riktar sig framförallt till de naturvetenskapliga ämnena
biologi, naturvetenskap och kemi. Arbetet syftar till att gymnasieeleverna ska få en ökad
kunskap om genetik, samt ett ökat intresse för de naturvetenskapliga ämnena. Därför kommer
arbetet att kunna vara en bra grund för lärare som undervisar gymnasielever som både ska
studera vidare inom biologi och för de elever som inte kommer att fortbilda sig i ämnet.
1.2 Bakgrund
På skolverkets hemsida (www.skolverket.se) finns kursplanerna för de naturvetenskapliga
ämnen som kan läsas på gymnasienivå:
Biologi A (skolverket SKOLFS: 2000:19)
Eleven skall:
kunna planera och genomföra fältstudier och experimentella undersökningar,
tolka dessa samt redovisa arbetet både muntligt och skriftligt,
[…]
ha kunskap om arvsmassans strukturer samt förstå sambanden mellan dessa
och individens egenskaper,
2
ha kunskap om gentekniska metoder och deras tillämpningar samt kunna
diskutera genteknikens möjligheter och risker ur ett etiskt perspektiv
Naturkunskap B (skolverket SKOLFS: 2000:9)
Eleven skall:
kunna planera, utföra och tolka enkla experiment och undersökningar samt
kunna rapportera muntligt och skriftligt
ha kunskaper om användning av naturvetenskap och teknik i samhället
ha fördjupade kunskaper om några grundämnen, kemiska föreningar och
viktiga kemiska begrepp som används i vardagsliv
ha kunskaper i genetik och modern genteknik samt kunna diskutera
tillämpningar
ur
etisk
synvinkel
Kemi B (skolverket SKOLFS: 2000:65)
Eleven skall:
ha förvärvat självständighet och vana vid laborativt arbete samt tillägnat sig
förmåga att kritiskt granska och analytiskt behandla kemiska förlopp och
egna mätresultat
kunna förklara och tillämpa några vanliga analysmetoder samt kunna
beskriva deras användningsområde och utveckling inom t.ex. sjukvård,
miljöarbete, forskning och industri
[…]
kunna schematiskt beskriva uppbyggnaden av och egenskaperna hos några
biologiskt viktiga molekyler och beskriva de biokemiska huvuddragen i
cellens metabolism och reproduktion
Sammantaget så passar en genetiklaboration väldigt bra in på samtliga kurser samt att det är
bra för eleverna att få en praktisk erfarenhet av de begrepp som uppfattas svåra. Det viktiga
med laborationen är att skapa ett intresse och en förståelse som eleven kan ha svårt att få
genom kurslitteraturen.
1.3 Litteraturgenomgång
Tidigare utvecklade och utvärderade genetiklaborationer av Petterson (2004) och Häägg
(2005) genomförda för gymnasieskolan visar att genetiklaboration passar väl för de
naturvetenskapliga ämnena på gymnasieskolan. Dessa har visat på ett bra resultat och att
eleverna tycker att det är roligt och lärorikt. Det som har upplevts som jobbigt är att det blir
mycket väntetid (Pettersson 2004). Det har även framkommit att laborationer passar bra som
undervisnings- och inlärningsform men bör ligga i slutet av genetikavsnittet då eleverna har
haft en chans att lära sig alla begrepp (Häägg 2005).
3
1.3.1 DNA uppbyggnad
Freeman och Herron (2007) skriver att vår
arvsmassa brukar förkortas DNA vilket är en
förkortning för Deoxyribonukleinsyra. DNA är
en
lång
kedja
som
består
av
Deoxyribonukleotider eller kvävebaser. Varje
Deoxyribonukleotid består av en 5 kols
sockermolekyl kallad deoxyribos och en
fosfatgrupp. Hela DNA-kedjan är uppbyggd på
fyra består: Adenin, Guanin, Cytosin och
Tymine. Alla dessa baser har en 5´ ända och en
3´ända. Detta är viktigt eftersom DNA-kedjan är
en dubbelspiral och därför måste en av kedjorna
ha sin 5´ände uppåt medan den andra kedjan har
sin 3´ ände uppåt vilket leder till att kedjorna kan
kopplas samman genom vätebindningar. Dessa
vätebindningar (se figur 1) kan bara ske mellan
Guanin-Cytosin (G-C) och Tymine-Adenin (TA) . Alltså består DNA av fyra kvävebaser och Figur 1 DNA-molekyl visar vätebindingar mellan
varje bas har en fix basparkamrat. (Freeman & Adenin-Tymine och Cytosin-Guanin (www.wikepedia.se
Herron 2007)
2008-10-20)
1.3.2 Proteinsyntes
En av uppgifterna som celler har är att producera protein. Detta kallas för proteinsyntes
(Brändén 2003). Det protein som ska skapas är kodat i DNAt. Cellen går inte direkt från
DNA till protein utan det sker vissa mellansteg. Ett sådant steg är att cellen skapar en
enkelsträngad kopia av DNAt. Denna kallas för RNA vilken är uppbyggd på samma sätt med
skillnaden att Tymine är utbytt till Urasil. Dessa kvävebaser binder lika bra till adenin. Det
första cellen gör vid skapande av ett protein är att det bildas mRNA-kedjor vilket kan liknas
vid schematisk ritning så att cellen vet vilket protein som ska skapas. När väl det finns
mRNA-molekyler så kommer tRNA-molekyler vilka kan liknas vid arbetare, att koppla in de
kvävebaser som passar efter den schematiska ritning som mRNA visar. tRNA bygger alltså
upp proteinet som mRNA kodar för genom att i ena änden binda till sig en aminosyra och i
den andra sidan ha tre kvävebaser som bara passar in på den specifika plats som mRNAt
kodar för och detta sker i cellens ribosomer (Brändén 2003).
1.3.3 PCR
PCR (Polymerase chain reaction) är en metod som hjälper till att mångfaldiga en liten bit
DNA till ett stort antal kopior (www.genteknik.nu 2008-10-15). Brändén (2003) förklarar att
för att kunna använda PCR behövs en oligonukleotid, vilket är en bit DNA som är 15-20
baspar lång. Dessa kallas primer som flankerar/passar till DNA-sekvenser på sidorna om den
DNA-sekvens man vill mångfaldiga. Det krävs också att startänden och slutänden har ett
ungefärligt lika antal kvävebaser av GC (Brändén 2003). Dessa ändar brukar kallas för 5´ och
3´. Vid mångfaldigande vid byggandet av de nya DNA-kedjorna så adderas nukleotiderna på
från 3´ mot 5´ (figur 2). För att mångfaldiga DNA behövs byggstenar kvävebaser samt ett
4
polymeras som kan bygga nya kopior av DNA-sekvensen. Sedan körs det i en PCR-maskin
som cykliskt pendlar mellan olika temperaturer så att polymeraset kan mångfaldiga DNAsekvensen. Vid hög temperatur blir DNAt enkelsträngat, för att sedan kylas av så att primern
kan fästa anneala till DNA-sekvensen. Sedan kan polymeraset bygga nya kedjor av den
DNA-sekvens som primerparet flankerat. Polymeraset måste vara värmetåligt eftersom PCRmaskinen pendlar cykliskt mellan varmt och kallt. Detta upprepas cykliskt många gånger och
DNA-sekvensen mångfaldiga ( Brändén 2003).
1. Här blandas en mix med
kvävebaser, taq-polymeras
primer. Sedan höjs
temperaturen och DNAt
delar sig vid 95°C.
2. Temperaturen sänks till
45°C så att primrarna kan
fästa vid DNA- kedjan.
3. Temperaturen höjs till
72°C så att det
värmetåliga taqpolymeraset kan bygga
ihop det nya DNAkedjorna.
Figur 2. Schematisk bild över PCR
(www.wikepedia.se 2008-10-20)
4. PCR jobbar cykliskt och
fördubblar DNA-kedjorna
varje cykel.
1.3.4 Laboration som pedagogiskt hjälpmedel.
Laborationer är ett pedagogiskt hjälpmedel för att förklara cellbiologi, genetik och genteknik.
Det är många steg i en laboration som kan användas för att förklara dessa moment. (Bjerg
2000) Vanligtvis används metoder där växtceller fryses ned till -80 grader och med tillsatt
alkohol kan DNA extraheras (Sharma et. al 2003). En annan billigare och enklare metod är
Chelexisolering. Denna metod är en metod för att isolera DNA ur celler utan alkohol eller att
frysa växtceller. I Chelexisolering används Protinas K och DTT för att bryta ned cellerna.
Protinas K bryter ned proteiner och DTT bryter sulfidbryggorna i proteinerna. När detta är
gjort kommer chelexkornen, som är som små innebandybollar, att binda de föroreningar som
finns i lösningen. Under inkuberingstiden jobbar DTT och Protinas K aktivt. Vid
upphettningen kommer cellerna att släppa ut sitt innehåll, och DTT och Protinas K kommer
att deaktiveras. Vid centrifugeringen kommer de tyngsta pariklarna att samlas på botten i
provrören (chelex och andra tyngre partiklar). Genom denna isoleringsmetod kan flera
paralleller dras till cellens uppbyggnad samt hur DNA kan utvinnas ur cellen. När isoleringen
är klar vid PCR-replikation delar sig DNAt och blir enkelsträngat vid 96 grader. Därefter
fäster primrarna vid de båda enkelsträngade kedjorna vid 37 grader, och vid 72 grader bygger
5
taq-polymeraset upp de nya DNA-kedjorna. Detta är en väldig förenkling verkligheten.
(Campbell 2005). Rent pedagogiskt kan detta även vara en bra förklaring av vad som naturligt
sker i cellen vid replikation.
Under cellens naturliga replikation spricker DNAt och bildar en bubbla. I denna bubbla har
DNA-kedjan två enkelsträngade kedjor varvid det finns möjlighet för cellen att bygga upp två
kedjor av DNAt. Vad finns det då för likheter mellan PCR och naturlig replikation? Jo, PCR
är naturlig replikation på konstgjord väg. Syftet med PCR är att mångfladiga just den del av
DNAt som behövs, medan naturlig replikation mångfaldigar hela DNA-kedjan. Vid PCR
mångfaldigas en viss gen, det kan vara till exempel genen som kodar för om individen ska bli
brun- eller blåögd. När PCR är gjord låter man PCR- produkten vandra genom en gel. Desto
mindre genen är desto kortare vandrar genen i gelen. En blåögd person har dubbel uppsättning
av gener som kodar för blåa ögon (homozygot). En brunögd person kan både ha dubbel
uppsättning gener för brunögdhet alltså homozygot eller en gen för blåa ögon och en för bruna
ögon. Det kallas för heterozygot. (Campbell & Reece 2005). När gelen studeras med PCRresultatet kommer man se detta som ett eller två bandmönster om generna är olika långa. Om
generna skulle vara lika långa användes restriktionsenzymer för att klyva generna på specifika
ställen vilket leder till att man kan se variationen som ett eller två bandmönster. Men det finns
även stora skillnader som är viktiga att ta upp. En självklar skillnad är temperatur. Det är ju
omöjligt för kroppen att ändra temperatur mellan 37 till nästan 100 grader vid
mångfaldigandet av DNA.
1.3.5 RAPD
RAPD är en ny, snabb, enkel och förhållandevis billig metod för att studera genetisk variation
på molekylär nivå (Clark & Lanigan´f 1993). Den första studien som beskriver RAPD
metoden är Williams et. al (1990). I Williams et. al studie kan man läsa att
molekylärgenetiska kartor vanligtvis är konstruerade med att analysera segregation av
restriktionsfragmentens längdskillnader (RFLPs). Här beskriver de en ny DNA-metod för att
urskilja skillnader i DNA baserat på ett slumpmässigt DNA-fragment genom en enkel primer.
Dessa skillnader i DNA är enkla att upptäcka eftersom de bara amplifierar från ena delen av
nukleotidsträngen. de föreslår att den blir kallad RAPD markers, efter Random Amplified
Polymorphic DNA (Williams et. al 1990). RAPD är alltså en PCR metod som utgår från en
slumpmässig amplifiering genom en enkel primer (Williams et. al 1990). RAPD är en av de
vanligaste metoderna för att studera genetisk variation (Friedt et. al 2007). Vanligtvis vid PCR
används två primer, en forward och en revers (Brändén 2003). En primer är vanligtvis mellan
15-20 baspar lång (Campbell & Reece 2005). Men en RAPD primer är bara ungefär 10 baspar
lång, vilket leder till att primern kommer att passa in på fler ställen på DNA-isoleringen,
vilket leder till att man kan se variation (Williams et. al 1990). Det visar sig också att antalet
annealingställen är kopplat till variation av amplifieringar av PCR (Li et al. 2006). RAPD
primer har inte som andra primer en 5´ände och en 3´ände. Detta på grund av att de är så korta
och att det bara används en primer mot andra metoder där det finns två primer. RAPD är en
bra metod som passar till växt- och djur-DNA (Williams et. al 1990). Det finns studier som
visar att RAPD mycket väl kan användas till att detektera genetiskvariation på växter (Lázaro
& Aguinagalde 1998). Med RAPD-primer är det vanligt att få ett bandmönster upp till 8 band
(Li et al. 1999). Det man detekterar med RAPD är nukleärt kärn-DNA (Crockett et. al 2000),
vilket är det DNA som finns i cellkärnan. Det går även att se genetik variation på DNA ur
cellernas mitokondrier.
6
RAPD metoden har fått kritik på grund av att den inte är säker (Dongre & Parkhi 2005). Det
som gör att RAPD primern inte är så tillförlitlig är att primer är så kort så att den kan passa in
på flera ställen vilket leder till att det kan skilja sig i resultat mellan provtagningarna. (Plieske
& Struss 2001)
1.4 Frågeställningar
Det primära syftet med arbetet är att ta fram en genetiklaboration som är lärorik och intressant
för gymnasielever.
Mina frågeställningar:
1)
2)
kan RAPD vara en lämplig metod för en genetiklaboration på gymnasiet?
Ökar försökspersonernas intresse för genetik och genteknik med ”Mordet i
salladsdisken”?
7
2 METOD
Metoddelen består av två huvuddelar: metodutveckling och pilotstudie. Det är framförallt
metodutvecklingen som är huvudsyftet med arbetet. Eftersom RAPD-metoden inte används i
stor utsträckning på gymnasiet trots att metoden är mycket väl lämpad för just gymnasieelever
har största delen av arbetet varit att ta fram en genetiklaboration som är snabb, enkel och
framförallt intressant.
2.1 Urval
Syftet med arbetet är att utveckla en laboration med en så enkel metod som möjligt. Urvalet
för laboration är att den ska fungera på växter samt att hitta en metod som fungerar på växter
som går att få tag på året om. Detta urval gjordes då efter att växterna ska gå att hitta i
salladsdisken på närmaste mataffär. De urval som gjorts är att laborationen ska bli så enkel
och kort som möjligt eftersom PCR-baserade DNA-laborationer annars tar lång tid.
För att utvärdera laborationen fick en testgrupp på nio gymnasieelever utföra laborationen
under en dag. Anledningen till att dessa elever fick göra laborationen var att de går kursen
naturkunskap B. Eleverna har ingen stor laborationsvana vilket är ett plus för denna studie.
Eftersom laborationen ska vända sig till naturkunskap B, biologi A och kemi B så är det
viktigt att laborationen fungerar trots att eleverna inte har någon gedigen laborationsvana.
2.2 Etiska överväganden
Det finns fyra etiska huvudkrav som bör tänkas på när arbetet berör andra människor. Dessa
fyra huvudkrav är informationskravet, samtyckeskravet, konfidentialitetskravet och
nyttjandekravet (www.vr.se).
1. Informationskravet innebär att alla deltagare i undersökningen informeras om vad
syftet med deras medverkan är, att det är frivilligt att deltaga samt att de kan avbryta
studien när som helst (www.vr.se). Detta informerades eleverna om vid början av
laborationen.
2. Samtyckeskravet betyder att deltagare över 15 år själva ska godkänna sin medverkan.
Alla elever fyllde i ett kontrakt om att vara med i studien (bilaga 1).
3. Konfidentialitetskravet innebär att alla deltagare ska ges största möjliga
konfidentiellitet och att deras personuppgifter ska förvaras så att ingen obehörig kan få
tag på dem (www.vr.se). Detta krav har uppfyllts genom att enkätundersökningen
eleverna deltog i var anonym.
4. Nyttjandekravet innebär att uppgifterna samlats in från deltagarna endast får användas
för forskningsändamål (www.vr.se). Detta har eleverna blivit informerade om och
eleverna har skrivet på ett kontrakt (bilaga 1).
2.3 Datainsamlingsmetoder
Litteratursökning gjordes på Högskolan i Gävles biblioteks databaser. Vetenskapliga artiklar
där forskare har använt RAPD-primer för att analysera genetisk varians hos växter lästes
översiktligt. Information från ett flertal artiklar sammanställdes för att utforma en lämplig
laborationsmetod. För att kunna besvara frågeställningarna gjordes en pilotstudie på en grupp
8
gymnasieelever. Gymnasieeleverna fick också besvara en anonym enkät. Resultatet
bearbetades och redovisas.
2.4 Metodutveckling
Isolering av växt-DNA gjordes först med 10 % chelex (10g chelexharts till 95 ml ddH20
dubbeldestillerat vatten). Dessa isoleringar utfördes enligt standardprotokoll. Isoleringarna
späddes med 50µl ddH20. De växter jag valde att testa denna laboration på var isbergssallad,
rucolasallad, romansallad, krispsallad, babyspenat, tall, en och gran. Tall-, gran- och enbarr
var med som referenser eftersom att primer som valdes ut till studien fungerade just på
barrträd (Allnutt et. al 2001). Ur T. R. Allnutt et. al´s (2001) RAPD studie på växter valdes 7
stycken primer ut.
Tabell 1. RAPD primrar använda i studien.
OPK 16
GAG CGT CGA A
OPK17
CCC AGC TGT G
OPK19
CAC AGG CGG A
OPK 9
CCC TAC CGA C
OPAL 6
AAG CGT CCT C
OPAL 12
CCC AGG CTA C
OPAL 17
CCG CAA GTG T
PCR-programmet var på 41 cyklar 92°C i 1 minut, 37°C i 1 minut och 72°C i 2 minuter,
därefter 72°C i 5 minuter (Black-Samulesson 1997). PCR-produkten kördes på en 1 %
agarosgel i 40 minuter med en spänning på 140V. Gelen färgades in med etidiumbromid och
fotograferades och analyserades på UVljus- bord.
2.4.1 Isolering
0,5g växtmaterial inkuberades med en mix av 200µl 10 % chelex (10g chelexharts till 95 ml
ddH20), och 17 µl av en mix med 210µl Protinas K (Protinas K 20mg/1 ml ddH2O) samt DTT
148 µl (1M DTT i 0,1M NaAc pH5,2 sterilfiltrerat). Detta prov inkuberades i en temperatur
på 56°C i två timmar. Det beställdes ett färdigt isoleringskit för växter från Dnesey. I väntan
på det nya isoleringskitet gjordes det nya isoleringsförsök med både Dnesey isoleringskit för
djurceller och nya Chelex 10% isoleringar. I de nya isoleringarna användes bara 0.25g
växtmateriell som mosats i mortel, samt nya spädningar av Protinas K- och DTT blandningar
eftersom dessa är känsliga och lätt kan tappa effekt.
2.4.2 PCR
De första isoleringarna (rent total DNA efter chelex isolering) kördes med två primrar OPAL
6: AAG CGT CCT C som forward och primer OP17: CCC AGC TGT G som reverse. Det
program som kördes i PCR-maskinen var på 41 cyklar 92°C i 1 minut, 37°C i 1 minut och
72°C i 2 minuter, därefter 72°C i 5 minuter. Med RAPD primer ska bara en primer användas
till skillnad från andra PCR-metoder. Vid nästa försök kördes PCR med dessa primer var för
sig. Nya försök gjordes där alla sju primrar testades med OPAL 6: AAG CGT CCT C,
OPK17: CCC AGC TGT G, OPK19: CAC AGG CGG A, OPK 16 GAG CGT CGA A,
OPK9: CCC TAC CGA C, OPAL 17 CCG CAA GTG T, OPAL 12 CCC AGG CTA C och
9
dessa analyserades för att ta fram den primern som bäst visade variation mellan de olika
salladsarterna.
Det program som kördes i PCR-maskinen var på 41 cyklar 92°C i 1 minut, 37°C i 1minut och
72°C i 2 minuter, därefter 72°C i 5 minuter (Black-Samulesson 1997). Detta program tog över
4 timmar att köra i PCR-maskinen. Försök gjordes att korta ner programmet till 92°C i 1
minut, därefter 41 cyklar 92°C i 15 sekunder, 37°C i 40 sekunder och 72°C i 45 sekunder,
därefter 72°C i 5 minuter. Detta program tog 2 timmar. Nya försök gjordes med att ta fram ett
nytt program 92°C i 1 minut, därefter 41 cyklar 92°C i 40 sekunder, 37°C i 40 sekunder och
72°C i 1 minut och 40 sekunder, därefter 72°C i 5 minuter.
Figur 3: Första körningen från min metodutveckling av laborationen. Efter PCR maskinen kördes
resultaten i elektrofores och bilden visar att primer opal 6 fungerar. Här kan man se att fyra av proverna
fungera genom att det har blivit band på gelen. Två av proverna har två band och två har ett band.
2.4.3 Elektrofores och analys
Flera provkörningar kördes med olika koncentrationer av agarosegeler. Både 1 % , 1,5 % och
2 % testades och analyserades med olika spänning i elektroforesapparaten. Agarosegelen
placeras i elektroforesapparaten. I agarosegelens brunnar pipetteras DNAt som sedan tvingas
fram genom att applicera spänning. De tyngre DNA-partiklarna, alltså de längsta DNAkedjorna kommer att vandra långsammare i gelen medan de korta DNA-kedjorna kommer att
vandra fortare. Dessa kommer senare att blida bandmönster beroende på hur primrarna har
fäst på DNAt. Det som analyserades och det som var grunden för urvalet var att få en tydligt
och skarp bildkvalitet som möjligt. Eftersom det bara fanns som mest 7 misstänkta mördare
valdes en kort agrosegel. Gelen färgades in med Etidiumbromid och analyserades och
fotograferades på ett UV-bord.
2.5 Pilotstudie
I pilotstudien deltog en grupp på nio gymnasieelever från samhällsprogrammet. Eleverna läste
naturkunskap B, vilket var passande eftersom att om laborationen fungerar för elever som
läser naturkunskap B så kommer laborationen även att fungera för biologi A och kemi B.
Dessa elever delades in i två grupper och fick på egen hand göra laborationen. Jag fanns med
som ett stöd till eleverna.
Eleverna hade väldigt liten labbvana sedan tidigare och det mesta i laborationssalen var nytt
för dem. För att få eleverna att känna utrustningen och få dem att hantera utrustningen på rätt
10
sätt fick alla elever testa att pipettera små mängder vanligt vatten. Innan laborationen gjordes
även en genomgång om laborationsuppförande samt en genomgång av alla kemikalier som
används i laborationen. Under väntetiden som fanns i laborationen fanns gott om tid till att ha
föreläsningar om vad som händer med DNAt i varje steg av laborationen, samt att koppla
förläsningen till lämpliga moment i vad som händer i kroppen till exempel proteinsyntes. En
enkät delades ut till eleverna precis innan de fick reda på deras resultat. Detta för att
säkerställa att resultatet på laborationen inte skulle påverka om laborationen varit lyckad eller
inte.
11
3 RESULTAT
Resultatet i denna rapport har delats in i två delar dels resultat från metodutvecklingen och
dels resultat från pilotstudien. Anledningen för att resultatet har delats in i två delar är att båda
delarna är viktiga för studien.
3.1 Metodutveckling
Isolering av växt-DNA gjordes först med 0,25g växt- DNA i 10 % chelex (10g chelexharts till
95 ml ddH20). Dessa isoleringar utfördes enligt standardprotokoll. Likaså 0,25g växt DNA i
Dnesys färdiga isoleringskit för djurceller enligt instruktioner. Ingen av dessa
isoleringsmetoder fungerade. Isolering av växt-DNA gjordes därefter med 0,25g mosat växtDNA i nya spädningar av 10 % chelex enligt standardprotokoll. Detta gav resultat. Dnesys
färdiga isoleringskit för växter och Chelex 10 % fungerar som isoleringsmetoder, dock är
Dnesys färdiga isoleringskit för växter inte testat i pilotstudien.
Under metodutvecklingen av laborationen gjordes försök att korta ned inkuberingstiden (den
tid som DTT och Protinas K bryter ned cellerna.) Dessa försök fick varierande resultat. Det
bästa resultatet erhölls då inkuberingstiden vara densamma som anvisningarna för metoderna.
Den första PCR-produkten med både primer OPAL 6: AAG CGT CCT C som forward och
primer OP17: CCC AGC TGT G som revelse blev otydlig. Därefter testades alla primrar.
Tabell 2: Primrar resultat
Namn
Primer
OPK 16
GAG CGT CGA A
OPK17
CCC AGC TGT G
OPK19
CAC AGG CGG A
OPK 9
CCC TAC CGA C
OPAL 6
AAG CGT CCT C
OPAL 12
CCC AGG CTA C
OPAL 17
CCG CAA GTG T
Resultat
Inget
Otydligt, Få
Otydligt, många
Otydligt, Få
Tydligt, Många
Tydligt, Få
Otydligt, Få
Den primer som gav bäst resultat var OPAL 6: AAG CGT CCT C. Alla primer testades i
PCR-programmet 1: 41 cyklar 92°C i 1 minut, 37°C i 1 minut och 72°C i 2 minuter, därefter
72°C i 5 minuter (Black-Samulesson 1997).
Tre program testades för PCR och dessa var:
program 1: på 41 cyklar 92°C i 1 minut, 37°C i 1minut och 72°C i 2 minuter, därefter 72°C i
5 minuter (Black-Samulesson 1997)
program 2: 92°C i 1 minut, därefter 41 cyklar 92°C i 15 sekunder, 37°C i 40 sekunder och
72°C i 45 sekunder, därefter 72°C i 5 minuter och
program 3: 92°C i 1 minut, därefter 41 cyklar 92°C i 40 sekunder, 37°C i 40 sekunder och
72°C i 1 minut och 40 sekunder, därefter 72°C i 5 minuter.
12
Program 1 fungerade bäst med avseende på resultat, program 2 fungerade bäst med avseende
på tid och program 3 fungerade bra med avseende på både tid och resultat. Därför valdes
program 3 till att användas i laborationen. Både 1 %, 1,5 % och 2 % av agarose till agarosgel
testades. Den koncentration som gav bäst resultat var 1,5 % .
3.2 Pilotstudie
Under pilotstudien gjordes observationer på hur eleverna
laborationen. Observationerna visade att eleverna jobbade aktivt
också framkom under observationerna var att eleverna
laborationserfarenhet. Detta syntes framförallt på osäkerhet vid
laborationsmateriell samt vid pipetteteringsmomenten.
arbetade praktiskt under
och självgående. Det som
inte hade någon stor
allmänkunskap om vanlig
I pilotstudien fick båda grupperna fram bra resultat. Jag har namngett grupperna till grupp 1
och grupp 2. Grupp 1 fick fram ett tydligt resultat där tre av fem salladsarter fick ett lyckat
resultat. I grupp 1:s resultat går det att urskilja vilken sallad det är som är mördaren (figur 4).
Grupp 2 har lite otydligare resultat. Men alla deras sallader har lyckade isoleringar och bra
PCR- produkt. Det går att urskilja vilken det är som är mördaren. Däremot så blev deras stege
(ett känt lambda-DNA som storleksmarkör) inte lyckad samt att även deras negativa kontroll
blev positiv. Båda grupperna har fått lyckade resultat.
Figur 4. Resultat från grupp 1 i pilotstudien
Figur 5. Resultat från grupp 2 i
pilotstudien.
13
Nedan kommer jag redovisa enkätunderesökning i form av en tabell.
Tabell 3. Resultat av enkätundersökning.
Fråga 1. Har du gjort liknande laborationer?
Svarsalternativ 5
4
3
2
Elevsvar
0
0
1
4
Fråga 2. har du haft intresse för genetik och genteknik tidigare
Svarsalternativ 5
4
3
2
Elevsvar
0
2
3
4
Fråga 3. Har det varit roligt att göra laborationen ”mordet i salladsdisken”?
Svarsalternativ
Elevsvar
5
4
3
2
2
6
1
0
Fråga 4. Har intresset för genetik och genteknik ökat med denna laboration?
1
4
1
0
1
0
Svarsalternativ 5
4
3
2
1
Elevsvar
1
5
3
0
0
Fråga 5. Har denna laboration gjort det lättare att förstå avsnittet om genetik och genteknik?
Svarsalternativ 5
4
3
2
Elevsvar
3
4
2
0
Fråga 6. Är detta en laboration som du tycker att borde ingå i naturkunskap B?
svarsalternativ 5
4
3
2
Elevsvar
8
0
1
0
1
0
1
0
14
4 DISKUSSION
Jag har valt att börja med att diskutera min metodutveckling och därefter kommer jag att
diskutera pilotstudien. Detta för att så bra som möjligt besvara mina frågeställningar
4.1 Metodutveckling
Under metodutvecklingen uppkom ett antal problem men inte bara problem utan med hjälp av
lite tur och mycket hårt arbete kom även nästan lika många lösningar. Själva syftet med
studien var att skapa en PCR-baserad laboration som är lämplig för gymnasiet. Laborationen
ska också ha potential att öka gymnasieelevers intresse för genetik och genteknik. En av
huvuduppgifterna var att laborationen inte får ta för lång tid. RAPD-metoden valdes ut på
grund av just detta kriterium. För att få laborationen att bli så lämpad som möjligt för en
gymnasieklass var tidsaspekten det väsentliga, och därför har mina val för att förbättra studien
ofta varit för att korta ned tiden. Studiens första steg var att hitta en isoleringsmetod som
fungerade bra.
Första försöket med Chelexmetoden fungerade inte önskvärt och väntetiden för Dneasys
isoleringskit för växter var lång. Detta gjorde att jag experimenterade med Chelexmetoden.
Under dessa försök visade det sig att Chelexmetoden fungerade med nya reagenser, mindre
del växtceller samt att dessa mosades. Troligtvis har Protinas K och DTT lättare att bryta ned
växtcellerna när de är mosade. Laborationen går att göra med både Dneasy isoleringskit för
växter och Chelexmetoden. Men anledningen att studien fortsatte med Chelexmetoden är att
denna metod är både billigare och mer pedagogisk. Eleverna kan följa vad som händer på ett
mycket bättre sätt under hela DNA-isoleringen. Under den första körningen med PCR
använde jag två primer trots att det bara ska var en. Eftersom de flesta PCR-metoder används
vanligtvis två primrar (Plieske & Struss 2001), en primer som forward och en som reverse
(Plieske & Struss 2001). Detta gjorde att jag tog för givet att även denna metod utgår från
detta men det visade sig att i RAPD-metoden använder man bara en primer (Williams et. al
1990). Detta ledde till att mina första resultat blev väldigt otydliga och värdefull tid
försummades. Det positiva som uppkom i och med detta var att jag var tvungen att göra en
felsökning då resultatet blev så pass dåligt. Tack vare detta upptäckte jag att endast en primer
åt gången ska användas (Williams et. al 1990).
Det som är speciellt för RAPD-primer är att annealingtemperaturen bara är 37°C (BlackSamuelsson 1997), vilket är lågt i jämförande med andra PCR-program där
annealingtemperaturen normalt ligger på runt 45°C (Plieske & Struss 2001). Därför testades
alla prover i PCR-programmet 1 (Black-Samuelsson 1997). Detta PCR-program tog över 4
timmar, vilket är för lång tid. Det viktiga för en gymnasieklass är att det inte blir tristess, och
därför är det viktigt att försöka korta ned tiden. För att minska tiden gjordes försök att korta
ned körningstiden i PCR-maskinen och detta utgör program 2. Program 2 tog bara två timmar
att köra, men resultatet blev alldeles för suddigt och otydligt samt att det var fler salladsarter
som inte gav något resultat. Därför testade jag ut ett nytt program som jag kallar för program
3. Detta är ett program som jag själv har utformat genom att studera PCR-program som är
utformade för andra PCR-metoder. Genom detta kunde jag dra slutsatser om hur lång tid varje
steg skulle vara i cyklerna samt vilken temperatur det skulle vara. Programmet tog lite under 3
timmar att köra och resultaten blev dugliga. Eftersom vi inte tidsmässigt kunde vänta på att få
det bästa resultatet och inte tidsoptimera för mycket så att resultatet blir lidande så använde
jag mig av mitt nyskapade program.
15
Denna laboration är mycket väl lämpad för gymnasielärare att använda för elever som läser
naturkunskap B, kemi B eller biologi A. Laborationen verkar ha potential att öka intresset för
genetik och genteknik, och det blir en naturlig diskussion med elever om begrepp som gener,
primer, arvsmassa mm. Det som läraren ska tänka på är att ha denna laboration i slutet av
genetikkapitlet då eleverna är bekant med begreppen eftersom det är väldigt många begrepp
att hålla reda på. Det kan också vara bra att låta eleverna göra enkla experiment där man
använder samma laborationsutrustning som i ”mordet i salladsdisken”. Då tänker jag
framförallt på till exempel pipettering.
Är RAPD en lämplig metod för en genetiklaboration på gymnasiet? I enkätundersökningen
svarade åtta av nio elever att ”mordet i salladsdisken” borde vara med i naturkunskap B. Detta
är en bra värdemätare för denna frågeställning. Jag tycker att RAPD är en utmärkt metod för
gymnasieelever att komma i kontakt med ämnet genetik och genteknik. Med RAPD är det lätt
att få bra resultat från DNA, samt att den är tidseffektiv i jämförandet med andra metoder för
att studera genetisk variation på molekylär nivå (Williams et. al 1990). Med många andra
metoder är man tvungen att använda restriktionsenzymer efter körningen med PCR-maskin.
Restriktionsenzymet kapar då DNA-kedjan vid specifik nukleotidsekvens, och efter det finns
det möjlighet att se om det finns variation mellan proverna. Detta steg behöver inte användas,i
och därmed tjänar eleverna laborationstid. Nackdelen med RAPD är att resultatet inte blir
exakt samma vid varje laborationstillfälle. Men är metodutvecklingen välgjord ska det vara
tillförlitligt. Oavsett är det inte något problem eftersom det viktiga är att få variation mellan
salladsarterna vid laborationen så att eleverna kan finna vilken mördaren är. Det är inte viktigt
att DNAt mångfaldigas och resultatet visar bandmönster som är precis lika för nästa grupp av
elever som gör laborationen ”mordet i salladsdisken”, utan att de också får variation och kan
finna vilken som är mördaren.
Jag anser att laborationen är mycket väl lämpad att använda för gymnasielever som läser
naturkunskap B, biologi A och kemi B. Detta då den påvisar stora pedagogiska fördelar
genom naturliga diskussioner om många viktiga steg som sker i människokroppen på cellnivå.
RAPD är en riktigt bra och enkel metod för gymnasieelever att komma i kontakt med genetik
och genteknik. RAPD används inte i stor utsträckning eftersom metoden har fått mycket kritik
för tillförlitligheten (Dongre & Parkhi 2005). Men i det syfte de används i denna laboration
spelar tillförlitligheten inte någon roll. Det som är speciellt med RAPD primer är att dessa
sätter sig slumpvis eftersom primern är relativt kort (Williams et. al 1990). Fördelen med
detta är att RAPD primer ofta ger resultat och att det är lätt att se variation mellan individer.
Läraren ska ha klart för sig innan laborationen startar att resultatet som tidigare fåtts på denna
laboration kanske inte är samma resultat som man får om man kör laborationen igen. Detta då
RAPD metoden inte är helt idiotsäker. Eftersom primern bara är 10 baspar (Williams et. al
1990) och en ”normal” primer är ungefär 20 baspar (Plieske & Struss 2001) kommer RAPD
primern att kunna passa på fler ställen i växtens DNA. Rent teoretiskt skulle primern kunna
välja att sätta sig på andra ställen än den gjorde första gången. Jag har upplevt att resultaten
har varierat mellan gångerna. Detta kan bero på en rad olika felkällor. Det är viktigt att
använda samma reagenser varje gång samt att vara otroligt noggrann vid pipetteringarna så att
det är samma mängder varje körning. Det finns även fler faktorer så som att använda samma
sallader vid varje körning eftersom att det kan finnas inomarts variation mellan salladerna.
Detta betyder att det kan finnas variation mellan olika individer av till exempel isbergssallad.
På samma sätt som att två människor inte har exakt samma arvsmassa behöver inte häller två
isbergssallader ha samma arvsmassa. Det som är viktigt vid alla laborationer är att likrikta så
att alla laborationer blir precis lika.
16
4.2 Pilotstudie
Under pilotstudien observerade jag elevernas uppträdande, samt om eleverna hade roligt och
om de verkade intresserade. Det jag kom fram till i mina observationer var att eleverna var
delaktiga och intresserade. Samtliga elever ville göra alla moment vilket ledde till att det tog
längre tid än planerat. Tanken från början var att eleverna skulle dela upp arbetet i gruppen
vilket hade lett till att laborationen utförts på kortare tid. Fördelen med att alla i gruppen utför
alla steg i isoleringsmetoden är den pedagogiska aspekten. Isoleringsmetoden är ett bra sätt att
förklara cellbiologi, alltså hur cellen är uppbyggd och hur Protinas K och DTT bryter ned
cellerna för att komma åt DNAt som finns i cellerna. Det är en viktig del i själva laborationen
att eleverna förstår vad som händer. Risken om det inte gör det är att de bara ser maskiner
som spottar ut färdiga prover. Observationerna visade även att eleverna inte hade någon stor
laborationsvana. Större delen av eleverna var osäkra under alla pipetteringsmoment. Detta
ledde till att båda grupperna hade kunnat få fram bättre resultat. Men det är väldigt bra att
pilotstudien visade att även elever med mindre laborationsvana klarar av att genomföra
laborationen på ett bra sätt.
I pilotstudien fick båda grupperna fram bra resultat (bild 4 och 5). Om bilderna 4 och 5
studeras syns det att i båda gruppernas resultat kan mördaren urskiljas från de misstänkta. Det
som var viktigt med resultaten var att två grupper som inte har någon särskild laborationsvana
klarar av att göra laborationen med bra resultat. Även om det finns detaljer i resultatet som
kan diskuteras i grupp 1:s resultat är det svårt att avgöra om det är individ 2 eller 3 som är
mördaren, samt att i grupp 2:s resultat är den negativa kontrollen positiv. Detta behöver inte
betyda så mycket eftersom nästan alla deras individer har olika DNA. Men i grupp 2 kan man
urskilja mördaren. Tillförlitligheten i dessa resultat är inte särskilt bra, men de räcker för att
fylla laborationens syfte. Det som är viktigt med laborationen är att eleverna ökar intresset
kring genetik och genteknik, och inte att de blir fullfjädrade mikrobiologer. I syfte som
utlärningsmetod fungerar laborationen utmärkt, men det skulle aldrig gå att avslöja en
mördare på ”riktigt” med denna metod.
Elevgruppen som gjorde pilotstudien fick svara på en enkät om laborationen, genetik och
genteknik. Ur denna enkätundersökning framkom det många intressanta svar. På fråga ett om
de hade gjort liknande laboration var det majoriteten av eleverna som inte hade gjort en
liknande laboration (tabell 3). Det märktes även under själva laborationen då många av
eleverna såg vilsna ut och de saknade erfarenhet av bland annat pipettering. På fråga två om
de haft intresse för genetik och genteknik tidigare var svaren blandade, ingen ”instämde helt”
men ingen ”instämde inte alls” (tabell 3). Om fråga två ställs mot fråga fyra så syns en
markant ökning av intresset (tabell 3). Detta ser jag som lyckat för att besvara frågeställningen
om intresset för genetik och genteknik ökar med ”Mordet i salladsdisken” och enligt
enkätundersökningen så steg intresset väsentligt.
Enkätundersökning anser jag ha en hög validitet då frågorna i enkätundersökningen är
relevanta och besvarar min frågeställning på ett bra sätt. Däremot har enkätundersökningen
inte en hög reliabilitet eftersom att det bara var nio elever som deltog i pilotstudien. För att
öka reliabilitet hade fler testgrupper behövt göra laborationen och svarat på enkäten. En
felkälla kan även vara mitt eget intresse för genetik och genteknik vilket kan leda till att jag
inspirerar eleverna i ämnet snarare än att laborationen i sig är intressant. Trots detta tycker jag
att enkätundersökningen besvarar min frågeställning och jag anser att intresset för genetik och
genteknik ökar med laborationen ”Mordet i salladsdisken” .
17
Laborationen ”Mordet i salladsdisken” kan optimeras ytterligare framförallt vad gäller tid. För
detta skulle fortsatta studier behövas. Det är möjligt att ha olika varmvattenbad som eleverna
doppar proverna i istället för PCR-maskin. Detta skulle medföra kortare tid eftersom
maskinen tar tid på sig att höja och sänka temperaturen.
För att få laborationen mer intressant skulle även historien runt själva laborationen kunna
utvecklas. Jag anser att den även skulle vara väl lämpad till ämnesövergripande studier med
tillexempel svenska, rättskunskap och till viss del även samhällskunskap. Detta genom att
labborationsrapporter kan skrivas i svenska samt att brott och straff kan diskuteras i
rättskunskap och samhällskunskap.
18
REFERENSER
Allnutt T. R., Courtis J. R., Gardner M., Newton A. C. (2001) GENETIC VARIATION IN
WILD CHILEAN AND CULTIVATED BRITISH POPULATIONS OF PODOCARPUS
SALIGNUS D. DON (PODOCARPACEAE) EDINB. J. BOT. 58 (3): 459–473
Bjerg J. (2000) Pedagogik – en grundbok. Liber AB: Stockholm
Black-Samuelsson S. (1997). Genetic Variation and Phenotypic Plasticity in the Rare plant
Species Vicia pisiformis L. and V. dumetorum L. (Fabaceae). Uppsala. Doctoravhandling
Brändén H. (2003). Molekylärbiologi 3:e uppl. Studentlitteratur. Lund.
Campbell N. E, Reece J. B. (2005) Biology seventh edition. Pearson education Inc. San
Franscisco.
Clark A G, Lanigan’f M. S., (1993) Prospects for Estimating Nucleotide Divergence with
RAPDs. Molecular Biology and Evolution, Vol 10, 1096-1111
Crockett P. A, Bhalla P. L, Lee C.K., Singh M. B.. (2000). RAPD analysis of seed purity in a
commercialhybrid cabbage. Genome 43: 317–321 (2000)
Dongre A, Parkhi V. (2005). Identification of Cotton Hybrid through the Combination of PCR
Based RAPD, ISSR and Microsatellite Markers. J. Plant Biochemistry & Biotechnology Vol.
14, 53-55, January 2005
Freeman S., Herron J. C. (2007) Evolutionary analysis Fourth edition. Perarson prentice hill.
Upper saddle River.
Friedt W, Snowdon R, Ordon F, Ahlemeyer J. (2007). Plant Breeding: Assessment of Genetic
Diversity in Crop Plants and its Exploitation in Breeding. Springer Berlin Heidelberg.
Progress in Botany.
Häägg K. (2005) Metodutveckling av två genetiklaborationer för gymnasieskolan – Manuell
PCR på genen CCR-5 hos människa – PCR-laboration på genen CHD hos fåglar. Gävle Cuppsats
Lázaro A, Aguinagalde I. (1998). Genetic Diversity in Brassica oleracea L. (Cruciferae)
and Wild Relatives (2n = 18) using RAPD Markers. Annals of Botany 82: 829±833
Li J.J., Pei G.L., Pang H.X, Bilderbeck A, Chen S.S., Tao S.H. (2006). A new method
for RAPD primers selection based on primer bias in nucleotide sequence data. Journal of
Biotechnology 126, 415–423
Li Y. G., Dewald C. L., Sims P. L.. (1999) Genetic Relationships within Tripsacum as
Detected by RAPD Variation. Annals of Botany 84: 695±702, 1999
19
Pettersson P. (2004) Metodutveckling av gymnasialt laborativt läromedel inom genteknikPCR av genen CCR5. Gävle C- uppsats
Plieske J, Struss D.. (2001). Microsatellite markers for genome analysis in Brassica.
I. development in Brassica napus and abundance in Brassicaceae species. Theor Appl Genet
102:689–694
Sharma R, Mahla H.R, Mohapatra T, Bhargava S.C, Sharma M.M. (2003) Isolating Plant
Genomic DNA Without Liquid Nitrogen. Plant Molecular Biology Reporter 21: 43–50,
Strömberg S. (2006). Naturvetenskap, lärarutbildning och hållbar utveckling. Göteborg. Duppsats
Wallin A, Orlander C. Andersson B (2005) A content-oriented theory for teaching and
learning biological evolution. Proceedings of the Fifth International ESERA on the
Contributions of Research to Enhancing Students' Interest in Learning Science. (pp. 530532). Barcelona, Spain.
Williams J G.K., Kubelik A R., Livak K J, Rafalski J.A, Tingey S V.. (1990). DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids
Research, Vol. 18, No. 22 6531
[www dokument]. URL genteknik.nu
http://www.genteknik.nu/index.asp?id=570 (Hämtad 2008-10-15)
[www dokument]: URL wikipedia.se
bild 1: http://sv.wikipedia.org/wiki/Fil:DNA_sketch.png (Hämtad 2008-10-20)
bild 2: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/56/Pcr.png (Hämtad 2008-10-20)
[www dokument]. URL skolverket.se kursplaner för Naturkunskap B, Biologi A kemi B
http://www3.skolverket.se/ki03/front.aspx?sprak=SV (Hämtad 2008-09-30)
www dokument]. URL vr.se
http://www.vr.se/download/18.668745410b37070528800029/HS%5BI%5D.pdf (Hämtad
2008-10-30)
20
Bilaga 1
Onsdagen den 12 november kommer eleverna att göra en pilotstudie i en genetiklaboration
som syftar till att öka elevernas inblick och intresse för genetik och genteknik. Eleverna
kommer att extrahera DNA från olika typer av sallad.
Härmed intygar eleven att resultatet får publiceras i C-uppsatsen.
Elevens underskrift:____________________________________
Namnfötydligande:_____________________________________
Tack på förhand
Niklas Hedqvist lärarstuderande vid högskolan i Gävle
21
Bilaga 2
Enkät på laborationen ”mordet i salladsdisken”
1. Har du tidigare gjort likande laborationer?
Instämmer helt
5
4
3
2
instämmer inte alls
1
2. Har du haft intresse för genetik och genteknik tidigare?
Instämmer helt
5
4
3
2
instämmer inte alls
1
3. Har det varit roligt att göra laborationen ”mordet i salladsdisken”?
Instämmer helt
instämmer inte alls
5
4
3
2
1
4. Har intresset för genetik och genteknik ökat med denna laboration?
Instämmer helt
instämmer inte alls
5
4
3
2
1
5. Har denna laboration gjort det lättare att förstå avsnittet om genetik och genteknik?
Instämmer helt
instämmer inte alls
5
4
3
2
1
6. Är detta en laboration som du tycker att borde ingå i naturkunskap B?
Instämmer helt
instämmer inte alls
5
4
3
2
1
Tack för din medverkan
Niklas Hedqvist
lärarstuderande högskolan i Gävle
22
Bilaga 3
Mordet i grönsakslandet
Det har nyligen skett i mord i salladsdisken i närbutiken. Kriminalkommissarien och hans
kriminaltekniker har kunnat säkerställa DNA från förövaren från offret. Men på grund av
varierande omställningar så har de inte tid att fortsätta med brottsgåtan utan de har hyrt in er
till hjälp att lösa uppgiften.
De finns ett antal misstänkta gärningsmän som har setts på mordplatsen vid den ungefärlig tid
då mordet uträttades. Nu är er uppgift att genom en DNA analys av de olika gärningsmännen
säkerställa vilken som är mördaren.
Isolering av DNA
Material:
5% chelex
Protinas K 10mg/ml
1MDTT(dithiotreitol), i 0,1M NaAc pH5,2, sterilfiltrerat
ddH20 (sterilt destillerat vatten)
Ependorfrör 1,5ml sterila med säkerhetslock
Magnetomrörare och stavmagnet
Värmeplatta och kastrull med vatten
Vettenbad
Centrifug
Vortex
Mortel och mortelskål
Utförande:
1. Märk upp ett Ependorfrör ett för varje misstänkt gärningsman (salladstyp)
2. Sätt 10%chelex på magnetomröraren.
3. Blanda 210µl protinas K och 148µl DTT i ett sterilt Ependorfrör. Denna blandning räcker till
20 prover. Tillsätt 17 µl till varje uppmärkta Ependorfrör.
4. När 10%chelex är löst i burken tillsätts 200 µl till varje märkt eppendorfrör. Använd blå pipett
och blå pipettspets (200-1000 µl) OBS TÄNK PÅ KONTIMINATIONSRISKEN
5. Använd mortel och mortelskål för att mosa de olika salladsarterna tillsätt mindre än 1mm3 till
varje märkt Ependorf-rör
6. Inkubera i 2 timmar i vattenbad som är 56°C
7. Se till att det finns kokande vatten när proverna är klar.
23
8. Skaka häftigt i vortex 10 sekunder.
9. Koka proverna i 7 minuter (för att deaktivera protinas K och DTT, OBS PASSA SÅ ATT INTE
LOCKEN FLYGER AV. )
10. Skaka häftigt i vortex
11. Centrifugera 3 minuter vid 12000x/min efter centrifugeringen är isoleringen färdig. Märk upp
nya Ependorf-rör och pipettera 50µl av DNA-isolering (Sug upp DNA-isoleringen så nära
pelletsen som möjligt.) Späd ut Isolering med 50 µl ddH2O. Isoleringen är nu helt klar och kan
sparas i kyl eller frys.
PCR
Material:
10x buffert för dynazyme
dNTP 10mM
Primer 10 µM
Spermidin 10 µM
DNA-Polymeras (Dynaxyme)
Streilt Destilerat vatten (ddH2O)
PCR-rör, sterila
Pipettspetsar
Is
Låda
Utförande:
1. Märk upp PCR-rör (ett för varje prov)
2. Ta fram reagenserna ur frysen och ställ dessa i ett isbad. Det är viktigt att alla reagenser hålls
kylda hela tiden. Så fort de är använda ställs de tillbaka i frysen.
3. Pipettera 4 µl DNA-templat (DNA isolering) till varje märkt PCR-rör byt pipettspets mellan
varje prov (OBS KONTIMINATIONSRISK!)
4. Blanda ordning en PCR-mix, (detta kan enventuellt förberades av läraren) så att det räcker till
alla prover. Tillsätt enzymet sist (Dynazyme tas direkt ur frysen och så fort det är tillsatt så
sätts det tillbaka i frysen.) när mixen är klar skakas den kort i Vortex.
PCR-mix för 10 prover:
10x buffert
dNTP
Primer
Speridin
ddH2O
Dynazyme
27,5 µl
22 µl
22 µl
5,5 µl
160 µl
5,5 µl
24
5. Portionera ut 21 µl PCR-mix till varje märkt PCR-rör utan att doppa pipettspetsen byt
pipettspets mellan varje prov. Håll proverna på is och gör detta moment så snabbt så möjligt.
6. Blanda med vortex och centrifugera snabbt så att det inte är något kvar på kanterna.
7. Placera rören i PCR maskinen och stäng locket. Skruva ner locket så att det ligger digtan mot
PCR-rören.
8. Kör PCR maskinen med programmet RAPD
Elekrofores
Material:
Agaros
1xTAE buffert
E-kolv (250ml)
Aluminiumfolie
Mikrovågsugn
Värmehandske
PCR-produkt med färg
Laddningsfärg
DNA-Stege
Gelform 10x20cm med gummiblock och kam
Elektroforesapparat + nätaggregat och kontakter
UV-bord
Etidiumbromid i vattenbad i dragskåp
OBS ETIDIUMBROMID ÄR GIFTIGT OCH MUTAGENT. VAR FÖRSIKTIG! ANVÄND
HANSKAR , SKYDDSROCK OCH SKYDDSGLASÖGON. BYT HANDSKAR OM DU
TAGIT I ETIDIUMBROMID ELLER FÄRGAD GEL.
Utförande:
1.
väg upp 0,75 gram agaros i en 250ml e-kolv. Tillsätt 75 ml 1xTAE buffert och skaka om så att
agarosen suspenderas. Täck öppning med aluminiumfolie. Värm i mikrovågsugn i 1 minut.
Skaka om agaros lösningen minst 3 gånger under uppvärmningen så att det inte bildar
klumpar av agarosen. Se till så att den inte kokar över. När blandningen kokat upp så värm
den ytterligare i 3 minuter på lägsta effekt. OBS ANVÄND VÄRMEHANDKSE UNDER HELA
TIDEN.
2. Låt agarosen svalna i 5 minuter.
3. Gör i ordning gelformen: sätt på gummiblocken på korta gelformen och ställ in kammen på
önskad plats.
4. När du kan hålla agorasen i handen utan att bränna dig häller du i den i gelformen. Ta bort
eventuella luftbubblor med pastör pipett.
25
5. Låt agarosgelen stelna minst 20 minuter.
6. Gör i ordning PCR-proverna. Om de har stått frysen ska de skakas i vortex och centrifugeras.
7. Förbered storleksmarkör. 2 µl DNA stege, 1 µl laddningsfärg och 8 µl 1xTAE buffert.
8. Ta bort kammarna genom att försiktigt dra kammen rakt upp.
9. Placera gelformen med gel i elektrforesapparaten
10. Överför med pipett märkt PCR-produkt 12 µl PCR-produkt med laddningsfärg i brunnarna på
gelen. Och 12 µl DNA-stegen. (viktigt att veta ordningen och att inte doppa pipettspetsen i
brunnarna.) Skölj pipettspetsen mellan varje prov.
11. Sätt på locket och kör elektrofores på 140V i ungefär 40 minuter tills färgen börjar närma sig
kanten på gelen.
12. Avbryt genom att slå av spänningen och överför gelen till badet med Etifumbromiden. Låt
gelen färgas in i 8 minuter. (LÄMPLIGT ATT DETTA GÖRS AV LÄRAREN EFTERSOM
ETIDIUMBROMID ÄR FARLIGT) under tiden är det lämpligt att diska av gelformen med att
spola vatten på den.
13. Överför gelformen i en balja med vatten och placera den på UV-bordet med gelspaden.
Placera skyddslocket på UV-bordet över gelen. Slå på UV-bordet och inspektera och
fotografera gelen. Om gelen är dåligt infärgad kan man färga in den igen med etidiumbromid.
(detta syns genom att DNA stegen syns dåligt)
14. När gelen är inspekterad överförs gelen till en plastpåse och slängs i kem avfallspåse. Rengör
balja, gelspade och UV-bord. Allt papper som används slängs i kemavfallskartong.
TÄNK ATT DET ÄR VIKTIGT ATT VAR FÖRSIKTIGT PÅGRUND AV ATT DET FINNS FARLIGA
ÄMNEN I LABORATIONSSALAR.
26
Bilaga 4
”Mordet i salladsdisken” lärarhandledning.
Detta är en laboration som är till för att öka intresset laborativ miljö, genetik och genteknik
för gymnasieelever i kemi B, Naturkunskap B eller biologi A.
Det har nyligen skett i mord i salladsdisken i närbutiken. Kriminalkommissarien och hans
kriminaltekniker har kunnat säkerställa DNA från förövaren från offret. Men på grund av
varierande ställningar så har de inte tid att fortsätta med brottsgåtan utan de har hyrt in er
hjälp att lösa uppgiften.
De finns ett antal misstänkta gärningsmän som har setts på mordplatsen vid den ungefärlig tid
då mordet uträttades. Nu är er uppgift att genom en DNA analys av de olika gärningsmännen
säkerställa vilken som är mördaren.
Tidsplan
Isolering av kärn-DNA
PCR
Elektrofores
3 timmar (30 minuter, 2 timmar, 30 minuter)
3,5 timmar (30 minuter 3 timmar)
1,5 timmar (30 minuter , 40 minuter 20 minuter)
Det är viktigt att vara så effektiv som möjligt. Se till att göra förberedande arbete vid väntetid
vid inkuberingstid vid isolering samt PCR. Exempel på förberedelser är gjutning av agarosgel
märkning av rör samt att blanda i ordning enzymmixen till PCR. Man kan med fördel dela
upp laborationen på eftermiddag och förmiddag. Då kan man tjäna 3 timmars väntetid.
Säkerhet
Det är otroligt viktigt att alla har ett bra laborationsuppträdande.
Alla ska bära lämpliga skyddskläder. Skyddsrock och handskar
Använd en separat kyl och frys för laborations prover.
Tvätta alltid händerna när man tar rast eller slutar för dagen.
Var försiktig vi hanterandet av kokande agaros
Var noga med att skyddslocket på UV- ljusbordet används.
OBS ETIDIUMBROMID ÄR GIFTIGT OCH MUTAGENT. VAR FÖRSIKTIG ANVÄND
HANDSKAR! BYT HANDSKAR DIREKT EFTER KONTAKT MED ETIDIUMBROMID.
SAMT HA ALLTID BRA LABORATIONSUPPTRÄDANDE!
Isolering av DNA
DTT och Protinas K hjälper till att bryta ned cellerna. Protinas K bryter ned proteiner och
DTT bryter sulfidbryggorna i proteinerna. När detta är gjort kommer chelex-kornen som är
som små innebandybollar att binda de föroreningar som finns i lösningen. Under
inkuberingstiden jobbar DTT och protinas K aktivt. Vid upphettningen kommer cellerna att
släppa ut ditt innehåll och DTT och protinas K kommer att deaktiveras. Vid centrifugeringen
kommer de tyngsta pariklarna att samlas på botten i provrören (chelex och andra tyngre
partiklar). Vid pipetering ska man ta så nära supernatanten som möjligt men var noga med att
inget av supernatanten följer med.
27
Material:
5% chelex
Protinas K 10mg/ml
1MDTT(dithiotreitol), i 0,1M NaAc pH5,2, sterilfiltrerat
ddH20 (sterilt destillerat vatten)
Ependorfrör 1,5ml sterila med säkerhetslock
Magnetomrörare och stavmagnet
Värmeplatta och kastrull med vatten
Vettenbad
Centrifug
Vortex
Mortel och mortelskål
Utförande:
1. Märk upp ett Ependorfrör ett för varje misstänkt gärningsman (salladstyp)
2. Sätt 10%chelex på magnetomröraren.
3. Blanda 210µl protinas K och 148µl DTT i ett sterilt Ependorfrör. Denna blandning räcker till
20 prover. Tillsätt 17 µl till varje uppmärkta Ependorfrör.
4. När 10%chelex är löst i burken tillsätts 200 µl till varje märkt eppendorfrör. Använd blå pipett
och blå pipettspets (200-1000 µl) OBS TÄNK PÅ KONTIMINATIONSRISKEN
5. Använd mortel och mortelskål för att mosa de olika salladsarterna tillsätt mindre än 1mm3,
ungefär 0,25g till varje märkt Ependorfrör
6. Inkubera i 2 timmar i vattenbad som är 56°C
7. Se till att det finns kokande vatten när proverna är klar.
8. Skaka häftigt i vortex 10 sekunder.
9. Koka proverna i 7 minuter (för att deaktivera protinas K och DTT, OBS PASSA SÅ ATT INTE
LOCKEN FLYGER AV. )
10. Skaka häftigt i vortex
11. Centrifugera 3 minuter vid 12000x/min efter centrifugeringen är isoleringen färdig. Märk upp
nya Ependorf-rör och pipettera 50µl av DNA-isolering (Sug upp DNA-isoleringen så nära
pelletsen som möjligt.) Späd ut Isolering med 50 µl ddH2O. Isoleringen är nu helt klar och kan
sparas i kyl eller frys.
PCR - Körning
Polymerase Chain Reaction är ett sett att mångfaldiga en liten bit DNA till mycket, mycket
större DNA fragment. För att kunna mångfaldiga DNA i en PCR- maskin behövs en mix med
primers, nukleotidbyggstenar och DNA- polymeras. Det som händer är att DNApolymeraset tar nukleotidbyggstenarna och bygger ihop de nya DNA sekvenserna som
primerparet passar till.
Det som är viktigt i laborationen är att alla dessa enzymer och nukleotider samt primerna är
både dyra och känsliga. Dessa ska behandlas försiktigt och se till att de hålls på is.
Det som kan hända är att dessa inte fungerar och då kommer det inte att bli något resultat. Då
har man kastat bort både tid och pengar.
28
För att spara tid och minska risken för att någonting kan läraren förbereda PCR- mixen åt
eleverna. Var noga med att ha alla reagenser på is med du blandar i ordning mixen.
Primerna späds med fördel dagen innan laborationen och sparas i kylskåpet.
dNTP är de nukleotider (byggstenar) som behövs för att kunna bygga ihop DNA.
Spermidin fungerar som en katalysator för polymeraset. Vid kris går det troligtvis att köra
laborationen utan spermidin.
Programera PCR maskinen med ett RAPD- program
1. 92°C i 2 minut,
2. 41 cyklar
92°C i 40 sekunder
37°C i 40 sekunder
72°C i 1 minut och 40 sekunder,
3. 72°C i 5 minuter.
4.10°C och end
Döp detta program till RAPD
Vid 92°C kommer DNAt att denatureras. Alltså kommer DNAt dubbelsträngar att dela på sig.
Vid 37°C kommer primern att anela till DNAt (fästa sig vid DNAt). Vid 72°C kommer
polymerast att bygga de nya DNA kedjorna. Detta att sker cykliskt.
Material:
10x buffert för dynazyme
dNTP 10mM
Primer 10 µM
Spermidin 10 µM
DNA-Polymeras (Dynaxyme)
Streilt Destilerat vatten (ddH2O)
PCR-rör, sterila
Pipettspetsar
Is
Låda
Utförande:
1. Märk upp PCR-rör (ett för varje prov)
2. Ta fram reagenserna ur frysen och ställ dessa i ett isbad. Det är viktigt att alla reagenser hålls
kylda hela tiden. Så fort de är använda ställs de tillbaka i frysen.
3. Pipettera 4 µl DNA-templat (DNA isolering) till varje märkt PCR-rör byt pipettspets mellan
varje prov (OBS KONTIMINATIONSRISK!)
4. Blanda ordning en PCR-mix, (detta kan enventuellt förberades av läraren) så att det räcker till
alla prover. Tillsätt enzymet sist (Dynazyme tas direkt ur frysen och så fort det är tillsatt så
sätts det tillbaka i frysen.) när mixen är klar skakas den kort i Vortex.
PCR-mix för 10 prover:
10x buffert
dNTP
27,5 µl
22 µl
29
Primer
Speridin
ddH2O
Dynazyme
22 µl
5,5 µl
160 µl
5,5 µl
5. Portionera ut 21 µl PCR-mix till varje märkt PCR-rör utan att doppa pipettspetsen byt
pipettspets mellan varje prov. Håll proverna på is och gör detta moment så snabbt så möjligt.
6. Blanda med vortex och centrifugera snabbt så att det inte är något kvar på kanterna.
7. Placera rören i PCR maskinen och stäng locket. Skruva ner locket så att det ligger digtan mot
PCR-rören.
8. Kör PCR maskinen med programmet RAPD
Elekrofores:
Viktigt vid detta moment är att informera eleverna om laborationsuppträdande. Vid smältning av
agaros i kokande vatten så blir e-kolven varm se till att eleverna använder värmevante eller en
griptång så att de inte tar i e-kolven.
Var noga med att gå igenom att eleverna inte ska doppa pipettenspetsen i gelen när det överför PCRprodukt i gelens brunnar. Då kommer det att fastna som en propp i pipetten och det kommer inte att
bli en bra pipettering.
Läraren kan med fördel sköta infärgningen med etidiumbromid då detta är farligt och mutagent. Det
är inget svårt steg. men det är bra om en ansvarig gör detta. Tänk även på att UV-ljus inte är bra för
ögonen så det är viktigt att fälla ned skydsslocket för UV-ljusbordet så att eleverna samt lärare inte
skadar ögonen.
Material:
Agaros
1xTAE buffert
E-kolv (250ml)
Aluminiumfolie
Mikrovågsugn
Värmehandske
PCR-produkt med färg
Laddningsfärg
DNA-Stege
Gelform 10x20cm med gummiblock och kam
Elektroforesapparat + nätaggregat och kontakter
UV-bord
Etidiumbromid i vattenbad i dragskåp
OBS ETIDIUMBROMID ÄR GIFTIGT OCH MUTAGENT. VAR FÖRSIKTIG! ANVÄND
HANSKAR , SKYDDSROCK OCH SKYDDSGLASÖGON. BYT HANDSKAR OM DU
TAGIT I ETIDIUMBROMID ELLER FÄRGAD GEL.
Utförande:
1.
väg upp 0,75 gram agaros i en 250ml e-kolv. Tillsätt 75 ml 1xTAE buffert och skaka om så att
agarosen suspenderas. Täck öppning med aluminiumfolie. Värm i mikrovågsugn i 1 minut.
Skaka om agaros lösningen minst 3 gånger under uppvärmningen så att det inte bildar
klumpar av agarosen. Se till så att den inte kokar över. När blandningen kokat upp så värm
30
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
den ytterligare i 3 minuter på lägsta effekt. OBS ANVÄND VÄRMEHANDKSE UNDER HELA
TIDEN.
Låt agarosen svalna i 5 minuter.
Gör i ordning gelformen: sätt på gummiblocken på korta gelformen och ställ in kammen på
önskad plats.
När du kan hålla agorasen i handen utan att bränna dig häller du i den i gelformen. Ta bort
eventuella luftbubblor med pastör pipett.
Låt agarosgelen stelna minst 20 minuter.
Gör i ordning PCR-proverna. Om de har stått frysen ska de skakas i vortex och centrifugeras.
Förbered storleksmarkör. 2 µl DNA stege, 1 µl laddningsfärg och 8 µl 1xTAE buffert.
Ta bort kammarna genom att försiktigt dra kammen rakt upp.
Placera gelformen med gel i elektrforesapparaten
Överför med pipett märkt PCR-produkt 12 µl PCR-produkt med laddningsfärg i brunnarna på
gelen. Och 12 µl DNA-stegen. (viktigt att veta ordningen och att inte doppa pipettspetsen i
brunnarna.) Skölj pipettspetsen mellan varje prov.
Sätt på locket och kör elektrofores på 140V i ungefär 40 minuter tills färgen börjar närma sig
kanten på gelen.
Avbryt genom att slå av spänningen och överför gelen till badet med Etifumbromiden. Låt
gelen färgas in i 8 minuter. (LÄMPLIGT ATT DETTA GÖRS AV LÄRAREN EFTERSOM
ETIDIUMBROMID ÄR FARLIGT) under tiden är det lämpligt att diska av gelformen med att
spola vatten på den.
Överför gelformen i en balja med vatten och placera den på UV-bordet med gelspaden.
Placera skyddslocket på UV-bordet över gelen. Slå på UV-bordet och inspektera och
fotografera gelen. Om gelen är dåligt infärgad kan man färga in den igen med etidiumbromid.
(detta syns genom att DNA stegen syns dåligt)
När gelen är inspekterad överförs gelen till en plastpåse och slängs i kem avfallspåse. Rengör
balja, gelspade och UV-bord. Allt papper som används slängs i kemavfallskartong.
TÄNK ATT DET ÄR VIKTIGT ATT VAR FÖRSIKTIGT PÅGRUND AV ATT DET FINNS FARLIGA
ÄMNEN I LABORATIONSSALAR.
LYCKA TILL
