Jean-Yves Sgro! Virus struktur och förökning" Maria Söderlund-Venermo, FD, doc." " Haartman-institutet, Virologiska avdelningen" Helsingfors universitet" Vad är ett virus? Virus avviker från alla andra organismer" - Fullständigt egen livsform" Obligatoriska intracellulära parasiter, som har en minimimängd gener vilka omgivs av ett skyddande skal som ger viruset dess infektionsförmåga Virus kan inte föröka sig utan levande celler. Utanför värdcellen är viruset en metaboliskt inaktiv partikel. " " Viruspartikeln måste klara sig i två miljöer: både utanför och innanför cellen samt kunna upplösas i en passlig cell. " " Efter att ha trängt in i cellen tar viruset cellen i eget bruk och använder sig av dess metaboliska och syntetiska apparatur med bekostnad av cellens välbefinnande. " " Virus finns i alla livsformer, djur-, växt-, bakterie-, alg-, och svampceller. " Det finns över 10 miljoner viruspartiklar/ml vatten" " Virus består av protein och nukleinsyra, endel har även lipider och kolhydrater. " Vad är virus: LWOFFS KRITERIER" Egenskap " " "" Bakterier! Riketsia! Virus! Gen! " Storlek (> 500nm) " Förökning:" "delning " " "replikation " Ribosomer " " Egen energiproduktion " Egen proteinsynees " Arvsmassa: DNA " " DNA ellerRNA Infektionsduglighet " (Antibiotika känslighet) " "+ "± "– "–" "+ "– "+ "+ "+ "+ "– "+ "+ "+ "– "+ "– "+ "+ "– "+ "+ "– "+ "– "– "– "– "+ "+ "– "– "+" "–" "–" "–" "+" "–" "–" "–" Bakterier förökar sig genom celldelning i syntetiskt medium. " Virus förökar sig endast i levande celler: cellen fungerar som fabrik och producerar virusets beståndsdelar på skilda håll i cellen." - först efter detta går virusdelarna samman till nya viruspartiklar. " " Viruspartikeln växer inte i storlek! Bakterien växer" André Lwoff (1902-1994) "" VIRUS STORLEK" Viruspartikelns storlek är endast 15 - 300 nm! [1000nm = 1 µm; 1000µm = 1 mm]" - Virus kan inte ”ses”, man behöver ett elektronmikroskop" Ljusmikroskop elektronmikroskop röntgen NMR Upplösningsförmågan: ögat ljusmikroskop EM 0,1 mm = 100 µm 0,2 µm 0,2 - 2 nm Albumin Polio Influenssa Smittkoppor Stafylokock Mänskocell storlek 5nm 28nm 100nm 250nm 1000nm 15 000nm genom (MW) - 2,6 x 106 4 x 106 160 x 106 3000 x 106 10 000 000 x 106 VIROLOGINS HISTORIA" 1000-talet-> " "Variolation av smittkoppor" 1796" "Edward Jenner "Smittkoppsvaccin (vacca; vaccination)" 1881" "Louis Pasteur "Rabies i kaniner" 1892" "Dimitri Iwanowsky "TMV är mindre än andra sjukdomsalstrare, bakteriens toxin" 1898" "Martinus Beijerinck "Virus = gift, ny sjukdomsalstrare" " Virus ”hittades”:" " Tobakens mosaikvirus (TMV) var mindre än andra sjukdomsalstrare." " Kan inte filtreras bort." " Nytt slags sjukdomsalstrare => smittande levande vätska "Contagium vivum fluidum”" " eller ”smittande giftig vätska” ”Contagium virum fluidum” " 1898" "Loeffler och Frosch "Mun och klövsjuka smittar likt TMV och förökar sig varje gång" 1902" "Walter Reed "Gula febern smittar via myggor, orsakar viremi" 1908" "Landsteiner, Popper "Barnförlamning orsakades av ett virus " 1911 " "Peyton Rous "Första tumörviruset från sarkom, RSV" 1916" "Twort, d’Herelle "Bakterievirus hittades (fager)" 1923" "Theiler och Smith "Mus och hönsäggs virus isolation" 1930-" "Wendell Stanley "Kristallisering av TMV:n — modellvirus" 1940-" "Ernst Ruska et al. "Elektronmikroskopi" 1949" "John Enders "Cellodlingar; odling av polio" 1950-" "Salk / Sabin "Poliovaccin" 1952" "Hershey & Chase "Bakteriofags genom är ensamt infektiöst" 1964" "Epstein & Barr "Första viruscancern hos människan: EBV, Burkitts lymfom" 1977 " "Sista smittkoppsfallet. WHO:s program ledde till sjukdomens försvinnande" 1983" "Montagnier / Gallo "AIDS orsakande virus (HIV) isolerades" 1983" "Karry Mullis "PCR dvs DNA-amplifikation" 1986" "Första rekombinations-DNA-vaccinet (Hepatit B) togs i bruk" VIRUS SAMMANSÄTTNING" NUKLEINSYRA "1-30%" - DNA eller RNA" - 1- eller 2-strängad" - lineär eller cirkulär" - enhetlig eller segmenterad" - storlek ~4-400 x 106 d (begränsad " genetisk kapacitet)" PROTEIN "60-80%" - skyddande skal runt genomet " - oftast enbart några sorter" - immunologisk specificitet" - receptor igenkänning" - enzymfunktion (polymeras)" - kodade av virusgenomet" KOLHYDRATER" LIPIDER "0-20%" - höljets glykoproteiner och lipider" - värdcellens enzymer ansvarar för syntesen - i höljet" - från värdcellen" - sammansättningen följer maturationsstället" - kan variera enligt värdcell" "" VIRUS STRUKTUR (MORFOLOGIA)" EM (1950): "Ytstrukturen är inte jämn utan består av underkomponenter" " Röntgendifraktion (1972): "Viruspartikeln är inte amorfisk" " " "- Består av regelbundet återkommande enheter" " " "- lätt att kristallisera och symmetriska" " " "- forskar redan med < 2 Å noggrannhet" " Kryo-EM + datamaskin-gjord 3D-bildrekonstruktion" Provet fryses snabbt så att inte förstörande iskristaller bildas " Mikroskopering i -160°C." " Virus former: stav, boll, ikosaheder, pistolkula, mask... VIRUSTERMINOLOGI" Kapsid (kapsidi, capsid)" " Strukturell enhet" " Kapsomer" " Nukleinsyra (DNA eller RNA)" " Nukleokapsid (eller RNP)" " Lipid" " Glykoprotein, ”spike”" " Hölje (vaippa, envelope)" " Matrix-protein" " Virion: infektionsdugligt färdigt virus" " Replikation: genomets amplifikation" Transkription: bildning av mRNA" Translation: proteinsyntes" Cytomegalovirus Paramyxovirus VIRUSSYMMETRI" HELIKAL" Proteinenheterna fördelar sig sida vid sida runt nukleinsyrasträngen formande en spiral, där varje strukturell enhet är lika till sin granne = nukleokapsid. Tobakens mosaikvirus fungerar som modellvirus–> Genomet kodar endast ett protein, men väldiga mängder av detta" Hela kapsidens längd är beroende av RNA-strängens längd " Endast en symmetriaxel, längs med centralkanalen" Virusets utseende kan ändå vara antingen runt eller långsmalt TMV Rabies Paramyxovirus Helikal symmetri" Filo: Ebola Paramyxo Ortomyxo: Influensa A" Coronavirus Arenavirus Rhabdo: Vesicular Stomatitis (VSV) VIRUSSYMMETRI" IKOSAHEDRAL! Genomet är ”löst” inuti skalet (=kapsiden), dvs inte fast i proteinskalet likt de helikala virusen" Konstruktionen bygger på att man kan dela ytan i ett jämnsidigt triangelnät, så att varje triangel motsvaras av tre strukturella proteinenheter (20 x 3), vilka man behöver 60 av. " Ursprungstrianglarna formar en ikosaeder så att runt vart och ett av de 12 spetsarna bildas en ring av fem enheter. " Den minsta ikosaedern är T=1 (triangulationsnumret x 60 enheter)" 5-3-2-symmetri: Parvovirus kapsid" Parvovirusens kapsid följer T=1 ikosahedral symmetri —> ett virion består av 60 VP2-protein kopior." " CPV: Agbandje, Parrish, Rossman Agbandje, Parrish, Rossman. Semin Virol 6; 1995 MVM: Agbandje-McKenna Ikosahedral symmetri Herpesvirus Parvovirus Papillomvirus Adenovirus Enterovirus Rotavirus VIRUSSYMMETRI! The Eden Project with geodesic domes near St Austell, England. Climatron at the Missouri Botanical Garden, St. Louis, 1960 Fuller’s geodesic system consists of dividing a sphere into equal triangles; Geodesic Dome! A geodesic grid is a technique used to model the surface of a sphere with a subdivided polyhedron, usually an icosahedron. VIRUSSYMMETRI" KOMPLEX " Pox-virus (t.ex. smittkoppsvirus) är varken helikala eller ikosahedrala, " utan mycket komplexa stora partiklar (250 nm)" - ser ut som tegelstenar" - följer ingen symmetri!" " Finns även virus i andra former, t.ex. citron, droppe eller vinflaska..." Molluscum contagiosum poxvirus Fusellovirus Acidianus bottle-shaped virus (Ampullavirus) VIRUS KLASSIFICERING" Man betraktar kemiska, fysikaliska och biologiska egenskaper:" VIRION: virionets storlek, form, hölje, kapsidens symmetri" " GENOM: DNA/RNA, en/tvåsträngad, lineär/cirkulär, +/- polaritet (ambisens), segmenterad eller segmentens antal, storlek, sekvensen, etc." " PROTEIN: antal sorter, storlek, funktioner, aminosyresekvens" " REPLIKATION: strategi, transkriptionssätt, translationssätt, maturationsställe, effekt på cellen" " FYSIKALISKA: pH-tolerans, kation beroende, värme-, lösnings-, detergent- eller strålningskänslighet" " BIOLOGISKA: serologiska relationer, släktskap, värd- eller vävnadsspektrum, sjukdomsalstringsförmåga (patogenitet)" RNA Ikosahedral Helikal DNA Ikosahedral Helikal Okänd DNA-VIRUS" Papillom" Polyom Exempel: B19 papillom (egen familj) Boca polyom (egen familj) Parv4 SV40 " AAV BK, JC, " MVM KI, WU, MCV,TSV CPV" HBV " HSV " CMV " EBV " VZV" "HHV-6, 7, 8" LCV " rana" " AcMNPV " " " smittkoppor" vaccinia" molluscum contagiosum" RNA-VIRUS" Exempel: " " " " " " Rota " " " " " " IBDV Noro polio Sapo " rino " HAV " entero " " dengue rubella TBEV " sindbis gula febern HCV " " " HIV " HTLV " " " " SARS Ebola Marburg " " " " rabies VSV Hantaan Influenssa Puumala Inkoo Uukuniemi " " RSV Lassa" påssjuka mässling" parainfluensa" sendai" hendra" "" Stort och litet virus" Mimivirus: 1,2 Mega bp Anellovirus: TTV: 3,8 kbp Bendinelli et al. Clin Microbiol Rev 14; 2001 Raoult et al. Science 306; 2004 Mimi: 400nm Circo: 20nm BAKTERIOFAG" Bakterie ätare, dvs bakterievirus, dvs bakteriofager, eller fager (phage, faagi)" Troligtvis har alla bakterier sina egna fager, vars värdspecificitet beror på receptorerna på cellytan. Olika morfologityper (A-F)." Används i fagterapi!" T4 fag" T4 fag" Tectiviridae fag" Enterobacteria virus P2" Inovirus, M13" Virophage" = virusets fag! Jättevirusen har sina egna virus som gör dem sjuka Fagen heter Sputnik ~50 nm ikosahedral kapsid ~18 kbp dsDNA cirkulärt genom Innehåller 21 gener, som har homologer med olika organismdomäner (eukaryoter, arkebakterier och bakterier) Different morphological aspects of mamavirus and Sputnik. La Scola et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07218 VIRUS FÖRÖKNING I CELLEN" 1. ADSORPTION (FASTSÄTTNING)" - virus fäster sig vid cellreseptor" 2. PENETRATION" "- virus kommer igenom cellmembranen" 3. NUKLEINSYRESYNTES" "- genomet frigörs och replikerar" Infektiösa partiklar per cell" Extracellulära" viruspartiklar" " 4. "PROTEINSYNTES" "- cellen producerar virala proteiner" 5. " 6. Infektiösa partiklar" i cellen" 1, 2 "3, 4 "5 6"Tid Eklips" VIRUSENS MONTERING/ ASSEMBLY (MOGNAD)" "- proteinenheterna formar kapsiden, inuti " vilken nukleinsyran packas" FRIGÖRELSE AV FÄRDIGA VIRUS" "- de färdiga virusen lämnar cellen" 1954 R Dulbecco, M Vogt Renato Dulbecco 1. ADSORPTION" Slumpmässig kollision, fysikaliskt fenomen, fordrar ej energi" "–> hög virionkoncentration, varav inte många fäster sig vid cellen" Virus känner igen en receptor på cellens yta och fastnar i den " "–> mycket specifik bindning " Virus infekterar bara några få celler " Virus kan även komma in i celler som det inte kan replikera i" Beanpod mottle virus (växt) Chlorellavirus (alg) CELLMEMBRAN OCH RECEPTORER" Hundens parvovirus transferrinreceptor !! (C.R. Parrish 2001) ! Exempel på cellreceptorer: Integrin, heparinsulfat, sialsyra, CD21, CD4, CCR5, globosid, ICAM-1, laminin-receptor, EGF-rcseptor..." Endel virus behöver co-receptor för att komma in i cellen" Reseptorerna utgör oftast en viktig andel i cell-och vävnadstropismen" 2. PENETRATION" Många olika metoder hur virus tar sig in i cellen" " a) Viruset lämnar över sin nukleinsyra eller nukleokapsid direkt " till cytoplasman genom plasmamembranen" " b) Virushöljet går samman (fusionerar) med cellmembranen" " c) Virus passerar igenom cellen i cellvesikler (endocytos)" "- fusion med endosomens membran (influenssa)" - Lys av endosom-membranen (adeno)" b) HI-viruset fastnar och kommer in" a) PBCV-1 virusets DNA " matas in i Chlorella algen" Virus endocytotiska transportleder" Marsh, Helenius: Virus entry Cell 2006 TRANSPORT AV VIRUS INUTI CELLEN" Höljelösa DNA-viruset (CPV) transporteras i cellvesikler till cellkärnan:" Cytoplasm! Clathrin-" Coated " Viruses" vesicles" Early endosome " Carrier vesicle" Late " endosome " Lysosome Nucleus! " Maija Vihinen-Ranta Jyväskylä universitet TRANSPORT AV VIRUS INOM CELLEN" Cytoplasman är för viruset som ett stort visköst hav igenom vilket det måste ta sig för att komma till cellkärnan." För viruset tar 1 cm resa ca Poliovirus 16 nm Adenovirus 45 nm HSV 63 nm i vatten 45 d 122 d 169 d i cytoplasma 61 år 166 år 231 år Från Sodeik, Trends Microbiol 8: 465" Många virus (rabies, influenssa, herpes, adeno, parvo) använder sig av cellens stödstrukturer, dvs mikrotubulus, " samt cellens cellkärnstransportpotein: dynein och kinesin" Nucleus" MTs" Maija Vihinen-Ranta, Jyväskylä PENETRATION" Smith, Helenius: Virus entry Science 2004 TRANSPORT AV VIRUS INOM CELLEN" Transport av virus till cellkärnan och DNA-genomets frigivning! 1) Frigivna genomets (+ protein) transport" "- genomet frigörs" " " i cytoplasman: HIV, influensa" " " i cellkärnan: herpesvirus, adenovirus, hepatit B virus" " 2) Hela viruspartikeln transporteras till nucleus" " "- genomet frigörs i nucleus " "- ex. geminivirus, parvovirus " 3) Virus kommer in i kärnan under celldelningens mitos" Nukleärpor" "- simian retrovirus 1" Cellkärna" Genomets frigörelse från sitt skal”uncoating”" VIRUS TRANSPORT I CELLEN ! Virus transport till cellkärnan och genomets frigivning" dvs. uncoating" " " " " " Whittaker GR, Kann M, Helenius A. 2000. Viral entry into the nucleus. " Annu. Rev. Cell Dev. Biol.16:627-51." BAKTERIOFAGERS PENETRATION" E. coli T4-fagen sprutar in sin nukleinsyra genom cellväggen 3 - 4 EKLIPS (NUKLEINSYRA- OCH PROTEINSYNTES)" Tiden då vi inte ”ser” virusen inne i cellen för viruset har upplösts." " Virus är en högt utvecklad parasit: cellens egna metoboliska verksamhet stannar nästan helt och cellen börjar producera virusdelar." " Endel virus använder cellens polymeras till sin replikation, emedan andra har eget polymeras enzym." " DNA-virus går till cellkärnan men RNA-virus går till cytoplasman." " Virus förökar sig INTE genom att integrera sig i cellens kromosomer!" VIRUS-RNA:S PROCESSERING" Capping: " RNA-polymeras II tillsätter efter RNA-syntesen en inverterad metylerad ”G”-trifosfat till RNA:s 5-ända." Polyadenylering: " Alla RNA:n skärs av och polyA-polymeras tillsätter en poly A-sekvens (50-200 nt) vid ett speciellt ställe. En viktig konsensus sekvens är ”AAUAAA”." CAP-molekyl 7megG" Splicing: " mRNA är inte en enhetlig kopia av DNA:t, utan består av bitar som fogats samman. Många virus använder splicing för reglering av translationen samt för att få tillstånd så många protein som möjligt av ett litet genom: ”alternativ splicing”." " pre-mRNA" Cap och Poly A bibehålls" mRNA" VIRUS TRANSKRIPTIONSKARTA" Exempel ssDNA-virus: parvovirus B19" Re a d i n g 12 fr a m e 3 M ap u n i ts 0 20 Nu cl eo ti d es mR N A s : 10 0 0 p 6 40 20 0 0 60 30 0 0 80 40 0 0 10 0 50 0 0 P ro te i n s: V P 1 (8 3 kD a ) an d 7. 5 k D a p ro te i n V P 1 (8 3 kD a ) NS 1 (7 7 k D a ) V P 2 (5 8 kD a ) an d 7. 5 k D a p ro te i n V P 2 (5 8 kD a ) 7. 5 k D a p ro te i n ? 7. 5 an d 11 k D a p ro te i n s 11 kD a p ro te i n VIRUS REPLIKATIONSSTRATEGI" - tai + ssDNA" (parvo, circo, anello)" +ssRNA" -ssDNA" +ssRNA" -ssRNA" (retrovirus)" Bär med sig reverse-transkriptas (picorna," flavi," toga," corona)" Kodar till RNA/RNA-polymeras ±dsDNA" (papillom, polyom, adeno, herpes, " HBV, irido, pox)" +RNA" ±dsRNA" (reo, birna)" Bär med sig RNA/RNA-polymeras -ssRNA" (rhabdo," paramyxo," orthomyxo," arena, filo," bunya, borna)" Bär med sig RNA/RNA-polymeras DNA-virus! DNA –> tidig mRNA –> tidigt protein (enzym) DNA-virus DNA replikerar sent mRNA –> sena protein (strukturella) DNA-virus går ända till cellkärnan! - små virus använder cellens polymeras och stora virus har eget polymeras ex. HSV:s transkription, translation & replikation —> ssDNA: Parvovirus replikation" MVM: Agbandje-McKenna B19: Clinical Virology, 1997 RNA-virus" Oftast ett relativt litet genom, kanske för att större genom skulle medföra för mycket mutationer i.o.m. att RNA-polymeras inte har felkorrigering" Behöver eget RNA-RNA-polymeras, ty finns inte normalt i cellen" Inga protein kan produceras utan mRNA, därför påverkar virionets RNAtyp virusets replikation:" +ssRNA! -ssRNA! dsRNA! RNA->DNA! Genomet fungerar som mRNA +RNA-virus protein (RNA-polymeras) Syntes av komplementär RNA-sträng (-RNA) Nya RNA genom (+RNA) protein +ssRNA: Picornavirus" Replikation: Translation:" "+ssRNA —> -ssRNA —> +ssRNA => replikation" ! ! ! !enkapsidation" " " " "translation" -ssRNA: Paramyxovirus! Replikation:! -ssRNA —> +ssRNA —> -ssRNA! ! Transkription: ! -ssRNA —> 6 mRNA! Virusgenetik" Virus förökar sig mycket snabbt" Bra exempel på evolution! " En endaste viruspartikel kan producera mycket avkomma" –> quasispecies! " Transformationsmekanismerna är" Mutationer! Rekombination! Omorganisation (reassortment)! Blandning av olika fenotyper! MOGNAD AV VIRUSETS HÖLJEPROTEIN! Höljeproteinens" sekretionsrutt:" 1. ER: " " - proteinsyntes" - vikning av proteinet" - svavelbindningar" - glykosylationens början" " 2. Golgi:" " - Glykosylationen slutförs " - Transportvesikler för " proteinen till cellmembranen" 5 - 6. MOGNAD OCH FRIGÖRELSE! Nukleinsyran och proteinerna sammanförs till nya viruspartiklar." Viruskapsidens ihopmontering är programmerat i proteinens aminosyresekvens = ”self assembly”" Proteinen sammanfogas på ett för viruset säreget sätt." Höljeproteinen glykosyleras och transporteras till cellmembranen." Vissa virus får omkring sig ett hölje bestående av lipider (och glykoprotein)." a) " P.g.a. virusinfektionen har cellen inte kapacitet att lappa och förnya sig och virusen ”söndrar” cellen = cellen lysar och virionerna frigörs och cellen dör. " b) En virustriggad signal leder till cellens självförstörelse (apoptos)." c) Höljebeklädda virus kan komma ut genom avknoppning (”budding”). " Viruset hamnar i de delar av cellmembranen där virusglykoproteinen lagrats. " " d) Viruspartikeln kommer ut via exocytosrutten." VIRUS TRANSPORT UT UR CELLEN! Virusgenomets eller partikelns transport från cellkärnan till cytoplasman" Transport av RNA genom poren" - Retrovirus (HIV, SIV)" - Influenssavirus" - DNA-virus som har reverse " transriptas aktivitet (RNA —>DNA)" (hepatit B virus)" " Viruspartikeln frigörs vid cell lysis" (adeno, polyom)" " Viruspartikeln går igenom poren " (gemini, parvo)" " Partikeln avknoppas genom " cellmembranen " (herpes, baculo, SV40?)" Whittaker GR, & Helenius A. 1998. " Nuclear import and export of viruses " and virus genomes. Virology 246:1-23." BAKTERIOFAGERS UTGÅNG! Höljelösa virus lysar cellen ”burst” ADSORPTION PENETRATION FRIGÖRELSE Värdcellfunktion Transkription Translation REPLIKATION VIRUS FÖRÖKNING Assembly (mognad) FRIGÖRELSE VIRIONER KÄLLOR! Virus Ultrastructure by Linda Stannard [http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/linda.html]" " All the virology on the web by David Sander [http://www.tulane.edu/~dmsander/]" " ICTV [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/index.htm]" " Molecular genetics by Ulrich Melcher OSU [http://opbs.okstate.edu/~melcher/]" " Maija Vihinen Ranta, Jyväskylän yliopisto" " Fundamental Virology, Fields and Knipe, Raven Press" " Principles of Virology, Flint et al, ASM Press" Grundvirologikurs: Fortsättningskurser: “Johdanto viruksiin” (Biotdk) “Molecular Virology”, “Molecular epidemiology of virus infections” “Clinical virology”