MLPA - Equalis

Framtida tekniker – MLPA (Multiplex
Ligation Probe Amplification) med
tillämpning inom Talassemi.

Dick Nelson
Klinisk kemi, Labmedicin Skåne
α-talassemi – 4 genotyper
Wild type
αα / αα
α+-talassemi
αα / α Ingen anemi
(tyst) α+-talassemi
αα / - -
eller
α-/α-
α0-talassemi
--/α-
mild anemi
anemi
α+-talassemi
HbH
--/-neonatal död
HbBart
Deletionsanalys för α-globin (α-talassemi),
många varianter!



α-globin ”cluster”: kromosom 16 och sträcker sig
över ~30kb
~128 olika DNA defekter kända för α-talassemi.
α-talassemi karakteriseras till ~80% deletioner.
Kr. 16
α-locus
Deletionsanalys för α-globin (α-talassemi),
många varianter!



α-globin ”cluster”: kromosom 16 och sträcker sig
över ~30kb
~128 olika DNA defekter kända för α-talassemi.
α-talassemi karakteriseras till ~80% deletioner.
Kr. 16
α-lokus
Finns flera tekniker för deletionsanalys, dock
med tekniska, resursmässiga, etc begränsningar
vilket gör att intressantare alternativ vore
önskvärt.




Gap-PCR
Southern blot
FISH
m.fl
Ett alternativ till ovan är MLPA (Multiplex Ligation
Probe Amplification)
Vad krävs på laboratoriet för en MLPA analys?




Utföra hybridisering resp ligeringsexperiment
PCR
Kapillärelektrofores
Ingen speciell DNA preparering
Alltså kända moment resp instrument som
finns på många molekylärgenetiska lab.
MLPA – kemisk princip (steg 1)
Denaturering & Hybridisering

Probe-par med:
a) identiska sekvenser i 3´(Y-prober) samt 5’ (X-prober)
för alla probe-par.
b) ena proben (X-proben) med olika ”stuffer seq.”längd
MLPA – kemisk princip (steg 2)
Ligering


Proberna är placerade direkt i anslutning till varann.
Saknas ”target” (deletion) – ingen ligering!
MLPA – kemisk princip (steg 3)
PCR





PCR görs på ligerade proberna!
Multiplex PCR
Ett primer-par till alla amplifieringarna
Forward primer (fluoroscenseinmärkt, FAM)
PCR produkter – skiljer som minst 3-4 baspar
MLPA – kemisk princip (steg 4)
Fragmentanalys av PCR produkterna

Fluoroscenseinmärkta primers → kapillär el.fores
Differensen i relativ mängd (patient/kontroll prober) ger
resultatet.

Beräkning med GeneMarker (mjukvara)

Beräkning: relativ beräkning för varje probe
mot ref.proberna → ratio 1.0 (= två kopier)
MLPA – stort användningsområde.


Erhåller kvantitativa skillnader för homozygota resp
heterozygota deletioner, duplikationer eller
kromosomer skillnader(ex. trisomi).
Kan användas för punkt mutationer
Exempel: En patient med α3.7 deletion skulle i en genomförd
MLPA analys sakna följande sekvenser.
α3.7
Utförande (sammanfattning)



Tämligen ”straight forward” enligt vedertagen
labpraxis när det gäller hybridisering, ligering
resp PCR – följa protokollet.
Nästföljande steg kapillärelektrofores enligt
leverantörs anvisningar.
Slutlig analys görs med mjukvara GeneMarker
Intresserade kontaka:
Agneta Östensson (040-336447)
Rebecca Rappner (040-333261)
Leverantör: MRC-Holland



Finns stort antal MLPA applikationer till hands.
SUS, Malmö (klin.kem) utvärderat α-talassemi kit.
28 prober täcker undersökta områden på α-locus
Slutlig analys - 1
Constant Spring SNP
heterozygot SEA
Slutlig analys - 2
Wild type
Slutlig analys - 3
α-/α-
homozygot α3.7
Slutlig analys - 4
~50%?
SNP
störning?
αα / α -
heterozygot α3.7
Slutlig analys - 5
α-triplett, αα/αααanti3.7
Resultaten är inte alltid klockrena!!!




Diagnostiken baseras inte enbart på MLPA!
Läs bipacksedeln noga – detaljer där hjälper till i
tolkningen!
Dock för sammanhängande deletionspartier bör tolkning
med tillräcklig säkerhet kunna göras.
Enstaka deletioner ska tas till stort övervägande.
Validering (α-talassemi med MLPA) har
inkluderat:



Detektionsgräns
Riktighet (mot:sekvensanalys, gap-PCR)
Repeterbarhet
Totala intrycket tillfredställande, samt inga
avvikelser kopplade till kemi, instrumentering
etc. har observerats som kan leda till felaktigt
svar.
Fördelar & nackdelar









Rubust och hög reproducerbarhet [↑]
Känsligheten hög [↑]
Upp till 40 ”targets” kan studeras i varje prov [↑]
Ej dyra och invecklade analysinstrument [↑]
Utvecklingsbar [↑]
Brett användningsområde (deletioner, SNP, kvant.) [↑]
Finns kontaminationsrisk [↓]
Tolkningsproblematik att ta ställning till. [→]
Ekonomisk [↑]
fortsättningen….



På samma sätt som för α-talassemi har βtalassemi MLPA satts upp.
MODY
Utveckla egna prober för fördjupa oss i tekniken.
Litteratur
1.
2.
Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex
ligation-dependent probe amplification.
Schouten J.P. et al, Nuclleic Acids Research, 2002;30:e20
Nine unknown rearrangements in 16p13.3 and 11p15.4 causing αand β-thalassaemia characterised by high resolution multiplex
ligation-dependent probe amplification.
Harteveld C.L. et al, J Med Genet 2005;42:922-931
Medarbetare



Agneta Östensson
Rebecca Rappner
Camilla Valtonen-Andre’