Immunohistokemi
Cecilia Ottosson
Laboratoriemetodik, grundläggande, vt14
Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin
Litteratur
• Cellular pathology
- kap 10, 13
• Immunohistochemical
Staining Methods
(finns i pingpong)
- kap 1, 2, 3, 8, 9 och 17
Immunohistokemi
• Identifiering av vävnadskomponenter med hjälp av
antikroppar
• Immunohistokemi – vävnadsprover
Immunocytokemi – cellutstryk
• Antigener, ag - epitop
• Antikroppar, ak – Immunoglobuliner (Ig)
-plasmaceller (B-lymfocyt)
-IgG, IgM
Immunohistokemi
• Polyklonala antikroppar
- immunisering av värddjur
- ak mot ett flertal olika epitoper
• Monoklonala antikroppar
-hybridomteknik
-högt specifika, riktade mot endast en epitop
Immunohistokemi
• Bindning ag-ak
- samverkan mellan jonbindningar, vätebindningar, Van der Waals krafter och hydrofoba
bindningar
• Visualisering av ak
- markörer
- kovalent bindning
- konjugering, biotinylering
Markörer
• Enzymer
- horseradish peroxidas (HRP)
- alkaliskt fosfatas (AP)
• Horseradish peroxidas
- substrat: väteperoxid
- PRP: syre
- kromogen: DAB (diaminobenzidin)
AEC (aminoetylkarbazol)
• Alkaliskt fosfatas
- substrat: α-naftolfosfat
- PRP: : α-naftol
- kromogen: diazosalter (Fast Red)
Substrat primär reaktionsprodukt (PRP)
PRP + kemiskt ämne slutlig
reaktionsprodukt (SRP)
SRP – olöslig (precipitat)
Markörer
• Fluorescerande molekyler
- FITC, Texas Red
- fluorescensemikroskop
- nackdel: speciellt mikroskop
mörkt rum
svårt att orientera sig
bleknar med tiden
• Metaller
- guld, silver
- vid elektronmikroskopi
• Biotin
- avidin
- ej visualisering!
Ospecifik bakgrund
• Ospecifik inbindning av ak
- inkubering med proteinlösning innan ak
- normalserum
• Endogent enzymaktivitet
- peroxidas – väteperoxid
- alkaliskt fosfats - levamisol
• Endogent biotin
- avidin
Korsreaktioner
• Ak reagerar med en snarlik epitop på annat ag
• Ak korsbinder till varandra
Spädning av ak
• Optimal spädning – högsta spädningen på ak som ger stark
färgningsreaktion med låg bakgrundsfärgning
• Högre affinitet – lägre koncentration (hög spädning)
• Affinitet – dragningskraften/bindning mellan ak-ag
• ”Smarta” spädningar
Inkubering
• Tid
• Temperatur
• Fuktig kammare
Avmaskering
• Formaldehydfixerat, paraffininbäddat material
• Fixering – maskering av antigen
• Enzymatisk behandling
- proteolytiska enzymer (trypsin, proteinase K)
- kritisk steg: tid
för kort tid – ej tillräcklig avmaskering
för lång tid – tar bort antigen
• Värmebehandling
- mikrovågsugn, tryckkokare
- citratbuffert, EDTA-buffert
Metoder i ett och två steg
• Direkt metod
- endast en ak
- ak märkt med markör
- fördel: snabb metod
- nackdel: låg sensitivitet
• Indirekt metod
- omärkt primär ak
- märkt sekundär ak riktad mot primär ak
- fördel: känsligare metod, mer ekonomisk
- nackdel: långsammare
Metoder i tre steg
• PAP – peroxidas-anti-peroxidas
• APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas
• ABC – avidin biotin komplex
• LSAB – labelled streptavidin biotin
Enzym-anti-enzymkomplex
• PAP – peroxidas-anti-peroxidas
APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas
• Naturlig affinitet hos en antikropp mot ett antigen (här:
enzym)
- omärkt primär ak
- sekundär ak – ”bro”
- enzym-anti-enzymkomplex
- substrat och kromogen
Avidin-biotin
• ABC (avidin-biotin-komplex)
LSAB (labelled streptavidin biotin)
• Avidins höga affinitet mot biotin
- omärkt primär ak
- sekundär biotinylerad ak
- avidin-biotin/avidin konjugerat med enzym
- substrat och kromogen
Immunogold
• Ej naturligt i kroppen
- primär omärkt ak
- sekundär ak märkt med guldpartikel
- om ljusmikroskopi: intensifiering med silver
- om elektronmikroskopi: olika storlekar på guldpartiklarna → dubbelinfärgning
Polymerkonjugerade system
• Dextranmolekyl
• Direkt metod
- ex EPOS (Enhanced Polymer One-Step Method)
• Indirekt metod
- ex Envision
Kontroller
• Vävnadskontroller
- positiv
- negativ
• Blank
In situ hybridisering
• Lokalisering på vävnad
• Märkta DNA strängar – fluorescense (FISH)
kromogen (CISH)
silver (SISH)
In situ hybridisering
• Små mängder prober
• DEPC, EDTA, formamid, NaCl
• Förbehandling:
- avmaskering av DNA
- blockering av ospecifik inbindning
