UMEÅ UNIVERSITET KEMISKA INSTITUTIONEN AL, MH 2011-09-22 Farmaceutisk kemi II Läkemedelskemi Läkemedelskemi Isolering och biologisk testing av en antibakteriell substans Innehåll: Riskbedömning Laborationsinstruktioner: Del 1, Separation av organiska föreningar Del 2, Biologisk testning Riskbedömning Vid riskbedömningen behandlas normalt nedanstående tio punkter för alla kemikalier i varje syntes; inte bara för startmaterial utan även för lösningsmedel och produkter. 1. Ämnets toxicitet och klassificering. T.ex. cancer- eller allergiframkallande, mutagena eller reproduktionstoxiska egenskaper. 2. Kemiska och fysikaliska egenskaper. T ex explosiva, häftiga reaktioner med andra ämnen, flyktighet, damm. (Ange även kokpunkt/smältpunkt, samt densitet) 3. Hälsorisker, vid t ex inandning och hudkontakt. 4. Första hjälpen, åtgärder vid ögon- och hudkontakt, åtgärder vid inandning eller sväljning. 5. Risker vid: normal hantering – det normala arbetssättet felaktig hantering – eventuella felgrepp läckage eller spill fel på utrustning olyckshändelse 6. Bedömning av risker vid de laborativa momenten. T ex hantering, överföring och blandning av kemikalier samt upphettning och destillering. 7. Skyddsutrustning och riskbegränsande (förebyggande) åtgärder. 8. Rengöring, sanering, avfallshantering. 9. Sammantagen riskbedömning. Ingående kemikaliers farlighet, laborativa moment och konsekvenser om något blir fel. 10. Övrigt: märkning, förvaring. Information om kemikalier kan erhållas från många ställen, t.ex. från olika statliga organisationer och myndigheter (i Sverige eller i andra länder) och från företag som saluför kemikalier (Aldrich, Fluka, etc.). Företag och organisationer som säljer/distribuerar kemikalier är skyldiga att deklarera kemikaliernas egenskaper m.m. genom varuinformationsblad. Dessa blad är ofta en bra källa till information. På engelska används ofta förkortningen SDS (safety data sheet) eller MSDS (materials SDS). www-servrar: SDS från www-servrar: Tre källor med utförlig information om kemiska ämnen ges nedan. Den första (National Institite for Occupational Safety and Health) har tydlig information, men endast för 1000-2000 ämnen. Kemikalieföretaget Sigma-Aldrich) uppges täcka över 200,000 ämnen. Var beredd på att länkar ändras då och då. 1. http://www.ilo.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/in dex.htm Om länken inte fungerar kan den vara ändrad, och man kan då starta på websidan http://www.cdc.gov/niosh och sedan leta efter en rubriker som ’Chemical Safety’, ’Chemical Safety Cards’ och ’MSDS’. 2. http://www.sigmaaldrich.com 2 Sök direkt från startsidan eller välj en länk för mer avancerad säkning, se nedan. 1) När du har loggat in genom att klicka på Login/eProfile i sidans överkant och gett lösen, så väljer du lämpligen `Advanced Search´, där det kan vara lämpligt och enkelt att söka på molekylformel, men det går förstås också att söka på namn (engelska namn förstås) eller CAS-nummer etc. (CAS = Chemical Abstracts Service Registry/Number) Det går även att söka på en ritad molekylformel, men här kan du kanske behöva viss information från lärare eller assistent. 2) Det första svaret på en sökning är vanligen en sida där du ställs inför valet av olika renhetsgrad eller kvalitet för föreningen (ASC reagent, puriss, anhydrous/vattenfri eller annat). Klicka på någon av dem; det spelar vanligen ingen roll vilken. Det är ändå samma säkerhetsinformation. Nästa svarssida som är produktinformationssidan har då grå bakgrund och du hittar en liten MSDS-länk uppe till höger eller till vänster. 3) Web-läsaren måste också tillåta pop-up-fönster. Ifall det skulle vara avstängt så brukar man få möjlighet att tillåta pop-up tillfälligt. Var också beredd på datortekniska problem utanför vår kontroll. 3. http://sis.nlm.nih.gov/chemical.html Kortfattad kemikalieinformation kan eventuellt även erhållas från: 4. Kemikalieinspektionen. Via kemikalieinspektionen kan man få R- och S-koder samt kodernas innebörd för kemiska ämnen i en av databaserna; se http://www.kemi.se/ 3 Farmaceutisk kemi II Läkemedelskemi UMEÅ UNIVERSITET KEMISKA INSITUTIONEN AL, MH 2011-09-22 Separation av organiska föreningar Bakgrund: Syra-bas extraktion är en teknik som används för att stegvis rena fram organiska föreningar med olika egenskaper från en blandning. Denna typ av exktraktion används rutinmässigt inom organisk syntes och vid isolering av intressanta föreningar från växt- och djurriket. Vid extraktion utnyttjar man det faktum att jonföreningar (föreningar med positiv eller negativ laddning) ofta har hög vattenlöslighet medans neutrala organiska föreningar ofta löser sig bättre i ett organiskt (opolärt) lösningsmedel. Eftersom vatten och många organiska lösningsmedel inte är blandbara med varandra kan man i många fall separera laddade föreningar från oladdade föreningar genom att använda sig av en separertratt innehållande både vatten (vattenfas) och ett organiskt lösningsmedel (organsfas). Genom att ändra pH-värdet I vattenfasen kan man bilda jonföreningar av neutral föreningar och därmed få dem att övergå från organfasen till vattenfasen. I denna laboration skall ni separera bensoesyra och sulfamethaxozole från varandra. Bensoesyra är en förening som är vanligt förekommande i bl.a olika bär och sulfamethaxozole är ett antibiotikum. Denna lab kan alltså ses som en förenklad extraktion av en biologisk intressant förening från växtmaterial (ett riktigt växtextrakt innehåller naturligtvis betydligt fler än 2 föreningar. CO2H H2N S O Bensoesyra pKa = 4,2 N O O Sulfametaxozol pKa ca. 9 4 N Utförande: Varje grupp kommer att få 1g av ett pulver som är en blandning av bensoesyra och sulfametaxozole. Lös upp pulvret i 100 mL etylacetat och för över lösningen till en separertratt. Tillsätt 50 mL mättad NaHCO3 lösning. Skaka ordentligt och separera de 2 faserna (vänd separertratten upp och ned mellan skakningarna och öppna kranen för att släppa ut eventuellt övertryck). Detta är själva extraktionen! Spara etylacetatfasen (organsfasen) i en kolv och häll tillbaka vattenfasen till separertratten. Extrahera en gång till genom att tillsätta ytterligare 100 mL etylacetat och upprepa extraktionen. Kombinera sedan organfaserna och spara vattenfasen i en annan kolv eller bägare. Torka organfasen genom att tillsätta MgSO4 som är ett torkmedel (låt stå i ca 20 min) och filtrera sedan bort torkmedlet. Dunsta bort etylacetaten i en evaporator. Ni har nu isolerat den del av pulvret som är löslig i etylacetat. Är det bensoesyra eller sulfametaxozole? Om ni hinner: Häll tillbaka vattenfasen till separertratten och surgör den genom att försiktigt tillsätta 100 mL 1M HCl (saltsyra). Kolla pH med indikatorpapper så att det verkligen blivit surt. Den sura vattenlösningen extraheras nu på samma sätt som tidigare genom att tillsätta 100 mL etylacetat, skaka ordentligt och separera de 2 faserna. Var noga med att släppa ut övertryck i separertratten genom att vända den upp och ned och öppna kranen med jämna mellanrum! Tillsätta MgSO4 till organfasen, låt stå i 20 min och dunsta bort etylacetat genom i en evaporator.Vilken av föreningarna har ni nu isolerat? 5 Biologisk testning Bakgrund: Användandet av “Kirby-Bauer disk diffusion”-metoden är en vanlig metod för att testa om en kemisk substans har antibakteriell effect. I detta test placeras små bitar filterpapper (6 mm diameter) som är impregnerade med en lösning av den intressanta substansen på en agarplatta med E. coli bakterier. Man låter sedan bakterierna växa över en natt och sedan kan man observera i fall det finns områden runt filterpapperen där bakterierna inte har växt vilket tyder på att substansen är antibakteriell. Stor ”död zon” kring filterpapperet tyder på hög aktivitet hos substansen medans lite eller ingen död zon tyder på att substansen inte har antibakteriell effekt. Utförande: Väg upp 2-4 mg av den sulfametaxozole ni isolerade i det föregående steget samt 2-4 mg av kommersiellt tillgänglig sulfametaxozole i sterila eppendorfrör. Lös upp substanserna i DMSO så ni får en koncentration på 20 mM. Tillsätt 50 µL av dessa lösningar till 950 µL PBS buffert i 2 nya eppendorfrör. Förbered även en ”blank”, dvs ett prov med endast 50 µL DMSO i 950 µL PBS buffert. Detta är ert referensprov som inte skall uppvisa någon antibakteriell effekt. Stryk ut 1-2 kolonier av E. coli på en Mueller-Hinton platta med en bomullstops. Börja med att göra ett kryss med bakterier över plattan och stryk sedan ut bakterierna över hela plattan genom att föra bomullstopsen fram och tillbaka över plattan. Placera 3 bitar av filterpapper jämnt utspridda på plattan. Droppa försiktigt 20 µL av era 3 lösningar på filterpapperen, en lösning på varje papper. Sätt på ett lock och låt plattan stå i rumstemperatur 30-40 min innan ni placerar plattan i en inkubator (37oC) 1-2 dagar. Obs! Skriv era namn på plattan och markera vilken substans som är på respektiva filterpapper. Jämför sedan hur bakterierna växt kring varje filterpapper. Om ni lyckats väl med extraktionen skall den ”döda zonen” kring båda filterpapperen med sulfametaxozole vara lika stor. Om så inte är fallet kan det tyda på att ni fortfarande har kvar en del bensoesyra i ert prov. 6