slutverion Barcoding av genen rbcL hos släktet Brassica

Institutionen för fysik, kemi och biologi
C-uppsats Lärarprogrammet 15 hp
Metodutveckling för användning av genen
rbcL för barcoding av arkeologiskt
material av Brassica sp. Utformande av laborationshandledning i bioteknik för gymnasieskolan
Malin Ottosson
LiTH-IFM- Ex--14/2959-SE
Handledare: Jenny Hagenblad, Linköpings universitet
Examinator: Thomas Östholm, Linköpings universitet
Institutionen för fysik, kemi och biologi
Linköpings universitet
581 83 Linköping
1 Datum/Date
Institutionen för fysik, kemi och biologi 2014-06-08
Department of Physics, Chemistry and Biology Språk/Language
Rapporttyp1
Report category
Svenska/Swedish
Examensarbete
C-uppsats
ISBN
LITH-IFM-G-EX—99/1111—SE
__________________________________________________
ISRN
__________________________________________________
Serietitel och serienummer
Title of series, numbering
ISSN
Handledare/Supervisor Jenny Hagenblad
Ort/Location: Linköping
Titel/Title:
Metodutveckling för användning av genen rbcL för barcoding av arkeologiskt material av Brassica sp. Utformande av laborationshandledning i bioteknik för gymnasieskolan
Författare/Author:
Malin Ottosson
Sammanfattning/Abstract:
För att ta reda på vad människor odlade och åt förr i tiden är arkeologer intresserade av en metod för att artbestämma
frön som är svåra att identifiera utifrån morfologi eller så pass nedbrutna att det är omöjligt.
En av de arter som är svårtidentifierade utifrån morfologi är Brassica sp.. (kål).
I denna rapport redovisas en början till metodframställning där barcoding används för kloroplastgenen rbcL på 22
arter/underarter av Brassica sp.. För att jobba med nedbrutet arkeologiskt DNA (aDNA) används istället för vanlig
sekvensering pyrosekvensering. Pyrosekvensering fungerar bättre eftersom den kan sekvensera mindre fragment som
t.ex. delvis nedbrutet aDNA.
Primers till PCR och pyrosekvensering designades för vissa intressanta sites i rbcL. Pyrosekvenseringen fungerade
som metod men genererade inget resultat. Referenssekvensen från genbanken matchade inte kålprovernas DNA.
Detta kan bero på inomartsvariation eller fel i genbanken.
RbcL kan användas som barcodingregion för Brassica sp. eftersom det finns variabla sites. Sekvenseringar på alla de
aktuella kålproverna kan vidare göras för att använda dessa som referenser i pyrosekvensering. En
laborationshandledning gjordes för gymnasieelever i bioteknik där extraktion, PCR och sekvensering av Brassica sp.
genomförs.
Nyckelord/Keyword:
pyrosekvensering barcoding Brassica sp. PCR rbcL laborationshandledning bioteknik
2 Innehållsförteckning
1. Inledning ....................................................................................... 4 1.1 Bakgrund: ...................................................................................... 4 1.2 Pedagogisk bakgrund .................................................................... 5 1.3 Målsättning .................................................................................... 5 2. 2.1 Material och metoder.................................................................... 6 Odling ....................................................................................... 6 2.2 Bioinformatik ................................................................................ 7 2.3 Extraktion ...................................................................................... 7 2.4 PCR ............................................................................................... 7 2.5 Pyrosekvensering .......................................................................... 9 2.6 Praktiskt pedagogiskt arbete.......................................................... 9 3. Resultat ......................................................................................... 9 3.1 Forskningsresultat ......................................................................... 9 3.2 Pedagogiskt resultat..................................................................... 12 4. 4.1 Diskussion .................................................................................. 12 Diskussion om metodutveckling ............................................. 12 4.2 Samhälleliga och etiska aspekter: ............................................... 13 4.3 Diskussion laborationshandledningsframställning...................... 14 5. Tack ............................................................................................ 15 6. Referenser ................................................................................... 15 7. Appendix .................................................................................... 17 7.1 Tabell A1 ..................................................................................... 17 7.2 Laborationshandledning .......................................................... 18 3 1. Inledning
1.1 Bakgrund:
Arkeologin kan ge oss kunskap om vår historia. En intressant aspekt av det är vad folk har
odlat och livnärt sig på. För att ta reda på detta samlar arkeologer in frön och växtdelar när de
gräver ut boplatser (Hansson M. C. 2008) I många fall kan man artbestämma frön utifrån
morfologi. Dock bryts fröna ner mer och mer ju äldre de är och blir därmed svårare att
identifiera och i vissa fall kan man inte bestämma art utan endast släkte eftersom fröna är för
lika.
Släktet kål (Brassica sp.), är en växt i familjen korsblommiga växter som har använts mycket
till matlagning. Det finns många olika underarter men några exempel är senap, raps, rovor,
vitkål, brysselkål och broccoli. Kål har troligen har odlats i Sverige ända sedan vikingatiden.
(Jens Heimdahl 2010). Det sägs att Gustaf Vasa var tokig i vitkål, men att andra former av kål
förmodligen odlades långt innan det (Israelsson 2000). Problemet är att kålfrön är väldigt
svåra, redan i färskt tillstånd, att artbestämma från frömorfologi även om olika typer av kål i
fullvuxet tillstånd ser väldigt olika ut. Att utveckla en metod för att kunna skilja dessa åt med
hjälp av DNA skulle därför vara värdefullt för arkeologer.
DNA-barcoding är en molekylärgenetisk metod där en region genotypas för att identifiera
olika arter (CBOL plant working group 2009). Finns det positioner i genomet där DNAt hos
olika arter konsekvent skiljer sig i form av olika kvävebaser går arter att särskilja och
identifiera. Vet man redan var i genen två arter skiljer sig kan man genotypa just den
regionen, detta görs med hjälp av jämförelse med DNA-sekvenser av samma art i genbanken
National Center for Biotechnology Information (NCBI 2014).
Genom att använda mitokondriegenen CO1 kan många djurgrupper artbestämmas (Herbert
PDN et al) 2003). Dock fungerar det inte att använda mitokondrieDNA i växter eftersom det
är för liten skillnad mellan olika arter på grund av låg evolutionshastighet (Chase et al) 2007).
Det behövs alltså en annan fungerande barcodingregion för dessa (CBOL plant working group
2009). Forskning har gjorts för att hitta den gen eller gener som skulle kunna vara det
universella barcodingverktyget för växtriket. T.ex. har växters plastid-genom undersökts.
Detta liknar mitokondrie-DNA såtillvida att det har ett högt antal kopior av genen i varje cell
vilket underlättar DNA-duplikationen i Polymerase Chain Reaktion (PCR) och sekvensering.
Problemet är att det är svårt att hitta tillräckligt variabla regioner i plastiden på grund av den
långsamma evolutionshastigheten (Chase et al) 2007). Det finns även förslag på att använda
internt transkriberade spacerdelar av nukleärt ribosomalt DNA (nrITS eller ITS). Dessa har
fungerat bra som fylogenteisk markör i många grupper av blommande växter. I de flesta fall
har den fungerat lika bra som plastid DNA men har upp till fyra gånger fler variabla sites
(Chase et al) 2007). Detta betyder att det är upp till fyra gånger lättare att särskilja arter med
ITS. Dock är ITS en gen där det evolveras multipla fungerande kopior vilket gör att den inte
går att använda som standardbarcode. (Chase et al 2007, Rapini et al 2006) Det finns ännu
ingen universell region som fungerar som barcode för alla landväxter. En annan lösning skulle
4 därför kunna vara en kombination av gener (Chase et al 2007). Generna rbcL och matK i en 2locus barcodekombination menas vara en realistisk kompromiss mellan universalitet (att de
finns i alla växter), sekvenskvalitet, diskriminering (att arter går att skilja genom en udda
kvävebas) och kostnad. Med denna kombination lyckades artspecificeringen till 72 % (CBOL
Plant Working Group 2009). Det har även forskats på genen matK själv, eller i kombination
med genen trnH-psbA fungerade i en studie att till 90 % urskilja orkidéer (Hollingsworth
2008). Ett annat alternativ skulle vara att forska fram olika specifika barcoding-gener för olika
familjer eller arter och föra in dessa i en databas. Eftersom genen rbcL har fått goda
barcoding-resultat tillsammans med andra gener används den ensam i denna studie för att se
om det är rätt gen för släktet Brassica sp.. RbcL är en kloroplastgen och eftersom kloroplaster
finns i så gott som alla landlevande växter är den intressant. Det finns även många exemplar
av den i varje cell vilket gör det lätt att amplifiera i PCR.
Vanligen sekvenseras större delar av gener och används till barcoding av färskt DNA som är
intakt. Dessa metoder kan inte användas vid arkeologiskt DNA, aDNA, eftersom det ofta är så
nedbrutet att endast små fragment av DNAt är intakt. Då finns det inte lika stor chans att
DNAt är sammanhängande så att både forward- och reverseprimer kan binda in för att bygga
nya DNA-kopior. Eftersom denna metod ska tas fram för arkeologiskt material med delvis
nedbrutna frön görs genotypingen på Brassica sp.-DNAt med hjälp av pyrosekvensering.
Pyrosekvensering är en bra metod eftersom den är noggrann och mycket lämpad för
sekvensering av korta (nedbrutna) DNA-fragment. I denna studie användes färskt Brassica
sp.-DNA men metoden utformas så att den sedan ska kunna användas på aDNA.
1.2 Pedagogisk bakgrund
Enligt skolverket (2014) säger läroplanen allmänt för ämnet biologi att: ”Undervisningen…
ska bidra till att eleverna utvecklar förmåga att arbeta teoretiskt och experimentellt…
Undervisningen i ämnet biologi ska ge eleverna förutsättningar att utveckla: förmåga att
planera, genomföra, tolka och redovisa fältstudier, experiment och observationer samt
förmåga att hantera material och utrustning.” Specifikt inriktat på kursen bioteknik är det
centrala innehållet bland annat: ” Experimentellt arbete inom bioteknik inklusive genteknik.
Sterilteknik...” (skolverket 2014). Målet med den didaktiska delen av detta arbete att utveckla en laborationshandledning för
elever där de ska få göra extraktion och PCR på olika arter av Brassica sp. som sedan skickas
iväg för sekvensering. Detta för att få pröva metoderna, hantera material och utrustning och
även för att förstå hur forskare jobbar i arbetslivet.
Det viktigt för elever att kunna ha användning sina kunskaper och de kunskaper som ska
läras behöver motiveras (Gustavsson 2002). Vetenskap ses ofta som något abstrakt som inte
hör till verkligheten (Gomez 2006). Om denna metod förklaras i ett större perspektiv så
eleverna förstår dels hur forskare arbetar och vad man kan åstadkomma med dessa metoder
kan eleverna motiveras inom ämnet och se en framtid inom det.
1.3 Målsättning Målsättningen med arbetet är att utveckla en arbetsmetod för att artbestämma arkeologiskt
material av Brassica sp. med hjälp av kloroplast-genen rbcL. Det är även att anpassa och
5 förenkla en del av detta arbete till en laborationshandledning för gymnasieelever i bioteknik.
De ska med hjälp av denna laboration få använda och lära sig hur metoder fungerar så som
DNA-extraktion, PCR och bioinformatik.
2. Material och metoder
2.1 Odling
Fem frön av varje sort (se tabell 1) planterades i växthus med uv-lampor på dygnet runt, i 2025oC och de vattnades var tredje dag. När första riktiga bladparet utvecklats togs prover, stora
som locket i eppendorfrör, från två individer per underart. Proverna förvarades i -80oC till
användning.
Tabell 1: Brassica sp. frölista
Fröbanksnummer
(accessionsnummer)
Sortnamn
Latinskt namn
NGB23253
Brassica sp. nigra
Brassica sp. nigra
NGB11164
BLACK MUSTARD
BRASSICA SP. NIGRA
SORT SENNEP
SORT SENNEP
ÖSTGÖTA II
NGB9911
HVAMMSROFA
NGB4408
LAITIALA AP0106
NGB599
HUGO
NGB10652
HANKKIJAN LAURI
NGB13596
HANSEN
NGB7796
BUDALSNEPE
NGB14490
HÄRJEDALSK
SKÅLROVA
KULTA
NGB21130
NGB21858
NGB11930
NGB600
RAPIDO I
NGB2700
KASPER
NGB1830
HØJ AMAGER AMA
NGB1837
HALVHØJ KRUSET,
HUNDERUP
NGB1835
LAV KRUSET INDU
NGB1878
AMAGER TIDLIG
VINTER, TOFTØ
NGB5014
ØYNA
6 Trivialnamn
Svart senap
Svart senap
Brassica sp. nigra
Brassica sp. napus ssp.
napoBrassica sp.
Brassica sp. napus ssp.
napoBrassica sp.
Brassica sp. napus ssp.
napoBrassica sp.
Svart senap
Kålrot
Brassica sp. napus ssp. oleifera
Brassica sp. napus ssp. oleifera
Brassica sp. napus ssp. oleifera
Brassica sp. rapa ssp. rapa
Brassica sp. rapa ssp. rapa
Raps
Raps
Raps
Rova
Rova
Brassica sp. rapa ssp. oleifera
Brassica sp. rapa ssp. oleifera
Brassica sp. rapa ssp. oleifera
Brassica sp. oleracea ssp.
sabellica
Brassica sp. oleracea ssp.
sabellica
Brassica sp. oleracea ssp.
sabellica
Brassica sp. oleracea var.
capitata
Brassica sp. oleracea var.
Rybs
Rybs
Rybs
Grönkål
Kålrot
Kålrot
Grönkål
Grönkål
Vitkål
Vitkål
NGB11996
BASTO
NGB11685
GREENIA
NGB12011
STOLTO F1
capitata
Brassica sp. oleracea var.
italica
Brassica sp. oleracea var.
italica
Brassica sp. oleracea var.
italica
Broccoli
Broccoli
Broccoli
2.2 Bioinformatik
DNA-sekvenser från genen rbcL hämtades för olika kålarter från genbank (NCBI 2014).
Arterna som sekvenserna hämtades för var B. napus, B. napus rape, B. nigra black mustard,
B. nigra, B. oleracea, B. oleracea capitata, B. oleracea italica, B. rapa oleifera, B. rapa rapa,
B. rapa rapa.
Sekvenserna alignades i programmet Geneious 7.1.5 (2014) för att se var i gensekvenserna
DNAt skiljer sig mellan de olika underarterna. Ställen där det gick att skilja ut en kålsort från
de andra på grund av variabla kvävebaser valdes ut. Den alignade sekvenserna lades ihop till
en sekvens för alla rbcL där de variabla kvävebaserna var utmärkta. Denna sekvens lades in i
programmet PyroMark Assay Design 2.0.1.15 (Qiagen, Hilden, Germany 2014) och primers
designades för positioner med variabla kvävebaser. Det designades primers till PCR och även
biotinylerad primer och sekvenseringsprimer designades till pyrosekvenseringen (Se tabell A1
i appendix).
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) kördes på de nydesignade primrarna i
genbank(NCBI 2014) för att se så att de inte skulle binda in någon annanstans i rbcLsekvenserna eller till genomet i övrigt. Primers beställdes för PCR (se tabell A1 i appendix).
2.3 Extraktion
DNA extraherades från alla 22 kålsorter (tabell 1) med hjälp av DNA-extraktion med Qiagen
DNeasy plant mini kit (2014). Det gjordes en nanodroppundersökning på alla prov för att se
om DNA-halterna var användbara.
2.4 PCR
PCR gjordes enligt standardiserad metod.
Mastermixreceptet som används för alla PCR-omgångar är beräknat för ett prov med
slutvolymen 20µl.
16 µl dubbeldestillerat vatten (dd H2O), 2 µl 10x dreamtaqbuffer (MgCl2), 0,4 µl
deoxynucleotide triphosphates (dNTP) (10µM), 0,2 µl forward primer 10µM, 0,2 µl reverse
primer 10µM och 0,2 µl dreamtaq DNApolymeras (5u/µl) blandades. Till varje prov tillsattes
sedan 1µl DNA-templat.
PCR på hela rbcL:
7 PCR kördes med en gradient för annealing-temperaturen (den temperatur där primer och
polymeras binder in till DNA) från 42-60oC på 8 prover av NGB2011. Den lägsta annnealingtemperaturen utan dubbelband var 53.9oC. PCR kördes därefter på alla 22 prover enl. tabell 2.
Tabell 2. Inställningar för PCR-program för hela rbcL.
Temperatur (oC)
94
94
53,9
72
72
4
Tid (min)
2:30
0:30
0:30
1:00
10:00
∞
Cykler
1
36
36
36
1
1
2.4.1 PCR med självdesignade primers
Primerparen pos.2 italica 4, pos.12 nigra 6, pos.16 raparapa 1, pos. 19 rapa rapa 3(se Tabell
A1 appendix) kördes i PCR med vissa av kålproverna (tabell 3). Primerparen kördes på
samma annealing-temperatur, 51oC och med mastermix enligt standardiserad metod.
Elongeringstiden var 15 sek. i övrigt var PCR-programmet som i tabell 2.
Tabell 3. Olika självdesignade primerpar som testades i PCR på de angivna kålaccessionerna.
Primerpar
Pos.2 Italica 4
Accessioner som användes
NGB 11996, NGB 21858, NGB14490
Pos.12 Nigra 6
NGB 21858, NGB 600, NGB 11930
Pos.16 Raparapa 1
NGB 11930, NGB 14490, NGB 600
PCR på Pos.2 italica 1 kördes på annealing-temperatur 55.5oC och PCR på Pos.16 raparapa 2
kördes på annealing-temperatur 49.5oC. Annars i övrigt enligt PCR för de andra
självdesignade primrarna med samma variation av accessioner.
2.4.2. PCR med biotinylerad primer:
Biotinylerad version av Pos 2 Italica 4 och även sekvenseringsprimer beställdes från SigmaAlrich (Sverige). PCR med dessa kördes på de 22 Brassica sp.-proverna. Annealingtemperaturen var 51oC, annealing-tiden 1 min och det kördes 39 cykler. Mängden PCRprodukt för varje prov var 25µl. Mastermixen kördes enligt receptet men då omräknat till
25µl.
Alla PCR- omgångar kontrollerades med gelelektrofores. Gelen förbereddes med 1,5 g
agaros, 100ml tris-borate-EDTA (TBE) och 4µl Cybersafe till de hela rbcL-fragmenten och
till de korta fragmenten från de egendesignade primerparen användes 2,5 g agaros. I
8 brunnarna lades en blandning av1.5 µl loading dye och 5µl PCRprodukt. En low range-stege
användes och körtiden var ca 1 timme på 90v.
PCR-produkterna med hela rbcL-sekvenserna exotap-renades från dNTP (oinkorporerade
nukleotider) och primers. För 15 µL PCR-produkt tillsattes 0,015 µL 20 U/µL Exonukleas 1,
0,150 µL 1 U/µLThermosensitive alkaline phosphatase och 5,835 µL ddH2O.
För att kunna skicka iväg proverna på sekvensering tillsattes Forward och Reverse primers i
separata prover av varje sort och dessa skickades sedan till sekvenseringsföretaget Macrogen
(Sverige).
2.5 Pyrosekvensering
Pyrosekvensering kördes på alla PCR-produkterna med biotinylerade primers enligt.
standardprogram.
Pyrosekvensering är en metod där korta DNA-sekvenser kan sekvenseras i realtid. PCRresultat från den barcodingregion som ska undersökas blandas med de fyra enzymerna DNApolymeras I (Klenow fragment), ATP Sulfurylas, Luciferas och Apyras.
Först sker DNA-polymerisation då tillsatt nukleotid som antas binda in formar ett baspar med
templatet och börjar bygga på den växande DNA-strängen. DNA-polymeraset frisätter då
pyrofosfat som fungerar som substrat åt ATP-sulfurylas. Genom ett par reaktioner frisätts
ATP som görs om till ljus av Luciferaset. Apyraset tar bort oanvända nukleotider och ATP för
att nästa nukleotid-typ ska kunna tillsättas. Ljuset som sänds ut kan detekteras och analyseras
medan det händer. Tillsätts endast en kvävebastyp i taget detekterar maskinen om det sänds ut
ljus eller inte och visar om denna typ av kvävebas binder in eller ej och därmed fås
sekvenseringen (Ahmadian et al 2006).
2.6 Praktiskt pedagogiskt arbete
Det framställdes en laborationshandledning för gymnasieelever. De ska med hjälp av denna
laboration få använda och lära sig hur metoder fungerar så som DNA-extraktion, PCR och
bioinformatik.
3. Resultat
3.1 Forskningsresultat Extraktion av DNA från kålproverna lyckades med hjälp av Qiagen DNeasy plant mini kit.
För resultat av nanodrop-undersökning se tabell 4. Medelvärde på DNA-halt låg på
29,11ng/µl.
Tabell 4: DNA-halten i extraktionerna av de olika kålproverna(tabell 1). Även renheten av
provet visas under 260/280.
Accessesionsnr.
NGB7706
NGB4408
NGB10652
NGB11930
DNA-halt ng/µl
32,96
11,97
8,71
24,14
260/280
1,87
2,31
1,83
1,68
9 NGB11996
NGB 2700
NGB 5014
NGB 1835
NGB 11685
NGB blank 2
NGB 1830
NGB 21130
NGB1837
NGB 599
NGB 23253
NGB blank 1
NGB 21858
NGB14490
NGB 12011
NGB 1878
NGB 13596
NGB 600
NGB 11164
NGB 9911
27,89
87,75
29,06
52,10
29,68
3,82
19,70
23,76
38,55
50,91
26,34
0,57
37,09
27,05
19,87
17,87
9,54
29,97
12,32
23,23
1,93
2,61
4,00
1,44
3,70
-2,80
1,27
1,96
1,88
1,91
1,98
-0,88
1,91
1,68
2,98
6,39
3,71
3,55
12,05
3,18
Primers designades (se tabell A1 i appendix) utifrån sammanslagning av sekvenser från
genbanken (NCBI 2014) (se tabell 6) där de intressanta variabla positionerna är markerade
röda:
GCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCACCTGAAGAAGCAGGGGCTGCG
GTAGCTGCTGAATCTTCTA[C/T]TGGTACATGGACAACTGTGTGGACCG[A/G]TGGGCT
TACCAGCCTTGA[T/C]CGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTCCAGGA
GAAGAAA[C/A]TCAATTTATTGC[G/T]TATGTAGCTTACCC[C/T/A]TTAGACCTTTTTGA
AGAAGG[G/T]TC[G/T]GTTACTAACATGTTTAC[C/T]TC[A/G]ATTGTGGGTAA[C/T]GTA
TTTGGGTTCAAAGCCCT[A/G]GCTGCTCTACGTCTAGAGGATCTGCGAAT[C/T]CCTCC[
T/G]GCTTATACT[A/C]AAACTTTCCAGGGACCACCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAG
A[T/G]AAATTGAACAAGTATGGACGTCCCCTATTAGGATGTACTATTAAACCTAA[A/G]
TTGGG[T/G]TTATCCGCGAAGAACT[A/G]TGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTACGTGG
TGGACTTGATTTTACCAAAGATGATGAGAATGTGAACTC[C/T]CAACCATTT
BLAST kördes på de nydesignade primrarna i genbanken (NCBI 2014) för att se så de inte
skulle binda in någon annanstans i rbcL-sekvenserna eller till genomet i övrigt. Detta för att
undvika andra PCR-produkter som skulle störa resultatet. Det fanns likheter med vissa
mitokondrie-DNA-sekvenser men detta ansågs inte vara någon risk.
De PCR-primerpar som designats är Pos.2 Italica 4, Pos.12 Nigra, 6 Pos.16 Raparapa, 1 Pos.2
italica 1 Pos.16 raparapa 2. (se tabell A1).
Tabell 5. Vilka sorter primerparen detekterar och vid vilken annealing-temperatur de fungerar.
Primerpar
Pos.2 Italica 4
Detekterar ut från de andra sorterna I tabell 1 Annealing-temperatur
Broccoli
51oC
10 Pos.12 Nigra 6
Pos.16 Raparapa 1
Pos.2 italica 1
Pos.16 raparapa 2
Svart senap
Rova
Broccoli
Rova
51oC
51oC
55.5oC
49.5oC
Alla primerpar visade bra resultat i gelelektrofores.
Pos 2 Italica 4 som detekterar broccoli gav en bra produkt och beställdes i biotinylerad form.
PCR kördes med det biotinylerade primerpar på samtliga prover (tabell 1) med annealingtemperaturen 51oC. Gelen visade att storleken stämde på alla prover och gav ett bra resultat
(Se figur 1).
Figur 1: Gelelektrofores av PCR på alla 22 Brassica sp.-prover med den egendesignade
biotinylerade primern Pos 2 Italica 4. Banden ligger på storleken mellan 50 och 75 bp. Enligt
designprogrammet ska sekvenserna var 62bp.
Pyrosekvenseringen som metod fungerade men resultat uteblev eftersom inte kvävebasordningen från referenssekvenserna stämde med provsekvenserna.
För PCR av hela rbcL blev den lägsta annealing-temperaturen utan dubbelband 53.9o. Alla 22
prover (tabell 1) kördes i PCR med denna temperatur. Dessa följande prover fungerade enligt
gelelektrofores och skickades på sekvensering: NGB12011, NGB11930, NGB7796,
NGB1835, NGB600, NGB14490. Resultaten såg bra ut och jämfördes därför med sekvenser
för samma art hämtade från genbanken (NCBI 2014), se tabell 6. Resultaten för detta visar att
sekvenseringarna var mycket lika genbanksekvenserna men inte identiska.
11 Tabell 6. Sekvenseringsresultat för likhet i jämförelse med de sekvenser som hämtades från
genbanken (NCBI 2014) för rbcL.
Fröbanknr.
NGB12011
Genbanknr.
gi|247893165|gb|GQ184380.1
NGB
11930
NGB 7796
gi|30959084|gb|AY167977.1
NGB 1835
NGB 600
NGB
14490
Genbanksartnamn
Brassica sp. Oleracea var.
Italica
Brassica sp. Rapa
Brassica sp. Rapa subsp. Rapa
voucher Wenpan
gi|167156|gb|M88342.1
Brassica sp. Oleracea
gi|30959084|gb|AY167977.1
Brassica sp. Rapa
gi|247893147|gb|GQ184371.1 Brassica sp. Rapa subsp. Rapa
voucher Wenpan
gi|247893147|gb|GQ184371.1
Identiskhet
99,1%
97,5%
95,7%
99,4%
98,9%
99,5%
3.2 Pedagogiskt resultat En laborationshandledning till gymnasieelever i bioteknik har utformats (se DNA från
Brassica sp. i appendix).
4. Diskussion
4.1 Diskussion om metodutveckling
Syftet med den här studien var att utveckla en metod för barcoding av arkeologisk Brassica
sp. med genen rbcL. Förr fick arkeologer förlita sig på de få lämningar av mat man kunde
hitta för att spekulera i vad som åts och handlades med i forntiden. Nu finns barcoding med
aDNA som är en mycket användbar metod (Hansson 2007; Schlumbaum et al 2008; Foley et
al 2011). Med denna forskning är det visat att rbcL går att använda till barcoding av Brassica
sp. tack vare de variabla positionerna. Chase et al (2007) skriver att en ideal barcodingregion
ska vara så pass kort att den går att amplifiera utifrån nedbrutet DNA, men att de inte lyckats
designa ett universellt primerpar ännu. Det har visat att korta aDNA-sekvenser på ca 100 bp
kan skrapas av från insidan av 2400 år gamla förvaringskärl som tagits upp ur skeppsvrak i
medelhavet. Även om inget synligt spår finns av innehållet har man ändå lyckats ta reda på
vad som förvarades däri (Hansson M.C.2007; Foley B.P. et al 2011). Primerparen i detta
forskningsprojekt designades utifrån dessa förutsättningar.
Chase et al (2007) skriver vidare att de inte lyckats designa ett universellt primerpar ännu.
RbcL är svår att få till som standardbarcode pga. bristande variabilitet men den är tillräckligt
variabel för att särskilja på artnivå inom vissa familjer. Genen har använts till att identifiera
dieten hos djur genom prover från maginnehåll och avföring (Schlumbaum A. et al 2008).
Detta forskningsprojekt visar att rbcL kan användas till barcoding av Brassica sp. av angivna
arter. Att det nu finns ett paket med färdigdesignade primerpar och biotinylerade primerpar
för intressanta variabla positioner gör att det dock enkelt att forska vidare och optimera dem.
Vidare forskning skulle leda till en färdig metod för att artbeststämma kålarter utifrån aDNA.
Denna metod att undersöka aDNA kan i framtiden medverka till kunskap om forntida
12 naturmediciner, mat och dess konserveringsmetoder, vad man handlade med och vilka varor
som var extra värdefulla. (Hansson M.C.2007; Foley B.P. et al 2011). Den kan även användas
till att spåra ätbara växters ursprung, bevara förlorad genetiskt mångfaldsinformation,
undersöka för att få information om utdöda arter och testa om fakta i historiska skrifter
stämmer (Schlumbaum A. et al 2008). RbcL kan identifiera Brassica sp. som odlats mycket i
norden men metoden skulle även kunna vidareutvecklas till att användas på andra släkten.
På grund av bristande forskartid utfördes projektet så att primers designades utifrån redan
gjorda sekvenseringar hämtade från genbaken (NBCI 2014). Hade mer tid funnits hade PCR
på hela rbcL för de 22 proverna (tabell 1) gjorts först och skickats iväg på sekvensering.
Sekvenseringsresultatet hade använts för att designa primers för att få ett korrekt
pyrosekvenseringsresultat anpassat efter kålindividerna. I resultatet från pyrosekvenseringen
var det en bas i referenssekvensen som inte stämde med kålsekvenserna som undersöktes.
Detta gjorde att ingen av sekvenserna stämde med referensen och därmed stämde inte
ordningen på tillsättningen av förväntade kvävebaser. Detta beror på att prov-kålplantornas
DNA inte riktigt matchar det som finns upplagt i genbanken (NBCI 2014). Inomartsvariation
kan vara en förklaring. Dock är rbcL är en rätt stor gen (1300 bp) och det kan då vara svårt att
få precis alla kvävebaser korrekt, vilket kan göra att databasen inte stämmer exakt med dessa
prover. Sangersekvenseringen visar att likheten med de sekvenser från genbanken som har
använts till primerdesignen är väldigt hög men inte exakt 100 %. Detta ger en förklaringen till
varför pyrosekvenseringen inte fungerade med genbankens referenssekvens men vidare
forskning skulle behöva göras. Även i annan litteratur finns det över 10 000 rbcL-sekvenser
inlagda i genbanker där många är felaktigt identifierade och inte visar hur de är utförda vilket
gör att de borde göras om (Chase et al 2007). Det är alltså inte bara denna forskning som
drabbas av felaktiga genbanksekvenser.
Optimering av PCR för sekvensering skulle behöva göras för att kunna skicka alla 22 prover
på sekvensering och sedan jämföra med referenseskvensen och pyrosekvenseringsresultat för
att få en korrekt förklaring. Detta skulle även kunna användas till en ny pyrosekvensering med
referenssekvenser från de egna proverna. Det är svårt att jämföra med tidigare färdiga resultat
där rbcL ensam eller tillsammans med andra gener använts eftersom inte pyrosekvenseringen
gav förväntade resultat. Dock visar tidigare forskning att rbcL är en användbar gen (CBOL
Plant Working Group 2009) och detta projekt understyrker detta.
4.2 Samhälleliga och etiska aspekter:
Barcoding kan även enligt CBOL plant working group (2009) vara till hjälp inom biologin vid
studerande av växt-djurinteraktioner och i skogsindustrin för att upptäcka handel med
produkter tillverkade av skyddade arter eller när det behövs göras stora
biodiversitetsundersökningar men det är brist på taxonomisk expertis. Metoder för att kunna
artbestämma forntida och fragmenterat aDNA skulle vara till hjälp för arkeologin när det är
svårt att artbestämma inom olika släkten. T.ex. för att se vad medeltidsmänniskor odlade och
åt till middag. Det finns inga etiska aspekter att ta hänsyn till i denna forskning.
13 4.3 Diskussion laborationshandledningsframställning
Laborationen är till för att eleverna ska få laborationsvana och att på ytterligare ett sätt få
temat DNA presenterat för sig. Växters DNA kommer ofta i skymundan i undervisning i
skolan och därför kan detta ämnesområde belysa att även växter har DNA. Elever lär sig på
olika sätt och vissa lär sig bäst av att få göra eller se. Att använda teoretiska kunskaper i
praktiken för att få minnesbilder kan öka lärandet hos elever (Gustavsson 2002)
Laborationshandledningen är utformad så att eleverna får arbeta själva med att räkna ut
mängder av de kemikalier de ska använda och tänka ut vilka extra verktyg de ska använda
utöver maskinerna. Jag upplever att lång text ofta kan göra elever omotiverade att läsa
noggrant. Därför är det en balansgång att ange rätt mängd information för att få eleverna att
jobba så självständigt som möjligt. Läraren kan även själv välja hur noggrant laborationen gås
igenom innan start, beroende på klassen. Dock ingår många okända moment och vikten av att
jobba sterilt är stor så att oönskat DNA inte amplifieras i proverna. Det används även små
koncentrationer, dyra maskiner och micropipetter. Därför är laborationshandledningen gjord
för bioteknikelever som redan läst biologi 1 och 2 och därför bör ha viss laborationsvana
(skolverket 2014). Dock krävs även en lämplighets- och riskbedömning av klassen, både för
om de skulle klara av laborationen och om de klarar det riskmässigt både ur maskinskade- och
säkerhetssynpunkt. Vid de olika maskinerna är det dock lättare att läraren visar i praktiken hur
det används. Läraren kan få räkna med att hjälpa till mycket under dessa lektioner men det är
viktigt att eleverna och deras inlärningsprocess är i fokus (Fuglestad 1999). När man som
lärare är med aktivt i arbetet är det lättare att observera när elever har svårt att förstå, och
hjälpa dem.
Frågan är även om laborationen är genomförbar i alla skolor? Det krävs en sal där sterilt
arbete kan utföras, dragskåp och en del dyra maskiner. Alla skolor erbjuder inte ens bioteknik,
men om man kan satsa på PCR- och gelelektroforesmaskiner skulle det kunna leda till att man
kan profilera skolan. Laborationen skulle även kunna ingå i ett tema tillsammans med
matematik och kemi och då skulle resurser kunna användas från alla ämnen.
Tidsplanen för laborationen får delas upp på ett flertal laborationer, förslagsvis ett tillfälle för
extraktion, ett för PCR, ett för gelelektrofores plus förberedelse för sekvensering och ett för
bioinformatik. Det kan även behövas ett par extra tillfällen om eleverna inte är färdiga med
sin inlämning eller om extraktion/PCR misslyckats på första försöket.
Att eleverna ska försöka få sekvenseringsresultaten att stämma med de kålsorter de
extraherade är ett resultat som inte processas vidare. Syftet är istället att lära sig metoderna för
DNA-identifiering. Som Gustavsson (2002) skriver så kan det vara viktigare för elever att få
göra insikter under processen än att nå ett mål eller ny upptäckt.
Att jobba med laborationer inom bioteknik där eleverna sterilt får jobba med gener möter
kursplanen på ett bra sätt (Skolverket 2014). Efter denna laboration har eleverna
förhoppningsvis insikt i och förståelse av DNA-extraktion, PCR och bioinformatik.
14 5. Tack Ett stort tack till Jenny Hagenblad, Maria Lundström, Matti Leino, Thomas Östholm, Anders Hargeby
och Karin Karlsson för hjälp, stöd och uppmuntran.
6. Referenser
Ahmadian A. Ehn M. Hober S. (2006) Pyrsosequencing: History, biochemistry and future.
Clinica Chimica Acta 363, 83-94
CBOL plant working group: Peter M. Hollingswortha,2, Laura L. Forresta, John L.
Spougeb, Mehrdad Hajibabaeic, Sujeevan Ratnasinghamc, Michelle van der Bankd, Mark W.
Chasee, Robyn S. Cowane, David L. Ericksonf, Aron J. Fazekasg, Sean W. Grahamh, Karen E.
Jamesi, Ki-Joong Kimj, W. John Kressf, Harald Schneideri, Jonathan van
AlphenStahle, Spencer C.H. Barrettk, Cassio van den Bergl, Diego Bogarinm, Kevin S.
Burgessk,n, Kenneth M. Camerono, Mark Carinei, Juliana Chacónp, Alexandra Clarka, James J.
Clarksone, Ferozah Conradq, Dion S. Deveye, Caroline S. Fordr, Terry A.J.
Heddersons, Michelle L. Hollingswortha, Brian C. Husbandg, Laura J. Kellya,e, Prasad R.
Kesanakurtig, Jung Sung Kimj, Young-Dong Kimt, Renaud Lahayed, Hae-Lim Leej, David G.
Longa, Santiago Madriñánp, Olivier Maurind, Isabelle Meusnierc, Steven G.
Newmasterg, Chong-Wook Parku, Diana M. Percyh, Gitte Petersenv, James E.
Richardsona, Gerardo A. Salazarw, Vincent Savolainene,x, Ole Sebergv, Michael J.
Wilkinsonr, Dong-Keun Yij and Damon P. Littley (2009) A DNA barcode for land plants.
PNAS 106 (31), 12794–12797
Chase M.W., Cowan R.S., Hollingsworth P.M., Van den Berg C., Madrinán S., Petersen G.,
Seberg O., Jörgensen T., Cameron K.M., Carine M., Pedersen N., Hedderson T.A.J., Conrad
F.,Salazar G.A., Richardson J.E., Hollingsworth M.L., Barraclough T.G., Wilkinson L.K.,
Wilkinson M. (2007) A proposal for a standardized protocol to barcode all land plants. Taxon
56 (2), 295-299
DNA-extraktion med Qiagen DNeasy plant mini kit (2014) beställt från www.qiagen.com 2014 Foley B.P., Hansson M.C.,Kourkoumelis D.P.,Theodoulou T.A. (2011) Aspects of ancient
Greek trade re-evaluated with amphora DNA evidence. Journal of archaeological science 39,
389-398.
Fuglestad O.L. (1999) Pedagogiska processer. Studentlitteratur AB, Lund
Geneious 7.1.5 (2014) www.geneious.com hämtad 2014-05-16
Gomez Md.C. (2006) ”Biologi är äckligt, fysik tråkigt och kemi svårt” – att lära sig
naturvetenskap i dagens grund- och gymnasieskola. Magisteruppsats, Lunds universitet
Gustavsson B (2002) Vad är kunskap? En diskussion om praktiskt och teoretisk kunskap.
Lenanders Grafiska AB, Kalmar
15 Hansson M.C., Foley B.P. (2007) Acient DNA fragments inside Classical Greek amphoras
reveal cargo of 2400-year old shipwreck. Journal of archaeological science 35, 1169-1176
Heimdahl J. (2010) Barbariska trädgårdsmästare nya perspektiv på hortikulturen ibgm Sverige
fram till1200-talets slut. Fornvännen 105, 265-280
Herbert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR (2003) Biological identifications through
DNA barcodes. Proc R Soc Biol SCI SerB 270:313-321
Hollingsworth PM (2008) progress and outstanding questions. Heredity 101, 1-2
Isaralesson L. (2000) Handbok för köksträdgården. Wahlström & Widstrand. Italien
National Center for Biotechnology Information (NBCI) (2014) Brasscia-sekvenser.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ hämtad 2014-05-21 10:16
Rapini A., Chase M.W. & Konno T.U.P. (2006) Phylogenetics of the new world Asclepiadeae
(Apocynaceae). Taxon 55:119-124
Schlumbaum A. Tensen M. Jaenicke-Després V. (2008) Ancient plant DNA in
archaeobotany. Veget Hist archaeobot 17, 233-244
Skolverket (2014) Läroplan bioteknik. http://www.skolverket.se/laroplaner-amnen-ochkurser/gymnasieutbildning/gymnasieskola/bio?tos=gy&subjectCode=BIO&lang=sv hämtad
2014-06-08
16 7. Appendix
7.1 Tabell A1
Tabell A1: namngivning av primerpar: position x (i genen), xxxxx (vilken art den urskiljer
från resten), x (vilken av de designade primrarna som designats på den positionen).
primerparnamn
Position 2 Italica 1
kvalitet primers
90
PCR F1 ACATGGACAACTGTGTGG
PCR R1 TAGCATCGTCCTTTGTAAC
Sequencing S1 AAGGCTGGTAAGCCC
Position 2 Italica 4
87
PCR F1 TACATGGACAACTGTGTG
PCR R2 AGCATCGTCCTTTGTA
Sequencing S1 GGACAACTGTGTGGACC
Position 12 Nigra 6
90
PCR F4 GTATTTGGGTTCAAAGC
PCR R5 ATTCGCAGATCCTCTAG
Sequencing S3 TGGGTTCAAAGCCCT
Position 16 rapa
rapa 1
95
PCR F1 CACCTCATGGTATCCA
PCR R1 ACGTCCATACTTGTTCA
Sequencing S1 CGTCCATACTTGTTCAAT
Position 16 rapa
rapa 2
94
PCR F3 GACCACCTCATGGTAT
PCR R3 GACGTCCATACTTGTTC
Sequencing S2 TGGTATCCAAGTTGAAAG
17 7.2 Laborationshandledning
Laborationshandledning: DNA från Brassica sp.
DNA är den mall i cellerna som bestämmer hur en organism ska se ut. Därför kan man
kartlägga t.ex. en växts DNA och se vilken art det är utan att ha sett hela växten. Det kan
räcka med att kartlägga en gen för att kunna särskilja organismen. Ni får i varje
laborationsgrupp tre prover från olika arter av släktet Brassica sp. - kål. Här ska ni ta ut
kloroplast-genen rbcL och låta den sekvenseras. Syftet med denna laboration är att lära känna
och förstå metoderna.
1. Läs igenom denna riskbedömning:
Vid alla steg ska labbrock, skyddsglasögon och handskar användas.
DNA-extraktion med Qiagen DNeasy plant mini kit: Buffert AW1 innehåller guanidin
hydrochlorid som kan bilda starkt reaktiva ämnen tillsammans med blekmedel. Låg risk
PCR: Inga kända risker vid korrekt hantering. Låg risk
Gelelektrofores och infärgning av gel med Sybersafe: Sybersafe Bör betraktas som
cancerogen. Måttligt riskfylld (här kommer en i gruppen till läraren för gemensam gjutning
av gel).
2. Ni ska extrahera DNA från tre Brassica sp.-prover med instruktioner från Qiagen DNeasy
plant mini kit. Börja på steg 7. Lägg era prover på is när de är klara.
3. Beräkna hur mycket mastermix som behövs till era prover och ett kontrollprov för PCR.
Tänk på att ta med i beräkningen så ni får ut 10 % extra mastermix för ev. spill.
Mastermixreceptet som används för alla PCR-omgångar är beräknat för ett prov (en art kål)
med slutvolymen 20µl.
16 µl ddH2O, 2 µl 10x dreamtaqbuffer (mgcl2), 0,4 µl dNTP (10µM), 0,2 µl forward primer
10µM, 0,2 µl reverse primer 10µM och 0,2 µl dreamtaqDNApolymeras (5u/µl)
4. Blanda er mastermix i ett Eppendorfrör.
5. Fyll PCR-rören med 19 µl mastermix och 1 µl prov, sammanlagt fyra rör, tre rör med prov
och ett med 1µl ddH2O som kontroll för att se så mastermix och eppendorfrör är rena.
6. Sätt igång en PCR. Kör samtidigt som era klasskompisar.
18 Inställningar för PCRprogrammet:
1
2
3
4
5
6
Temp (oC)
94
94
53,9 oC
72
72
4
Tid (min)
2:30
0:30
0:30
1:00/kb
10:00
∞
Cykler
1
36
1
1
7. När PCR-omgången är färdig ska resultatet testas i gelelektrofores för att se om rätt produkt
extraherats utan kontamination av andra proteiner. Gjut gel tillsammans med lärare.
Gelektroforesrecept:
Gel: 1.5g agaros, 100 ml TBE, 4µl cybersafe (obs! i dragskåp med hanskar och angivet
avfall!)
Prov: 5µl PCR-produkt + 1.5µl loading dye x6 per brunn
Stege: 100 bp
Styrka: 90 V
8. Har resultatet rätt storlek jämfört med stegen, inga dubbelband och visas tydligt ska PCRprodukten exotap-renas från dNTP(oinkorporerade nukleotider) och primers. För 15 µL PCRprodukt som ni nu har för varje prov tillsätts 0,015 Exonukleas 1, 0,150 µLT. alkaline
phosphatase och 5,835 µL ddH2O.
Sedan sätts 5 µL av de renade PCR-produkterna i två brunnar vardera. I den ena sätts 5 µL 5
µM forward primer och i den andra 5 µL 5 µM reverse primers.
9. Glöm inte att fylla i schemat över brunnarna tydligt så ni vet vad ni har placerat var.
Läraren visar hur.
10. Vänta otåligt på att få tillbaka sekvenseringsresultaten!
11. När resultaten kommit jämförs de med sekvenser från genbank och ser om det är den
kålarten ni extraherade (fråga lärare om genomgång av databas).
Redovisning: Alla grupper redovisar sitt resultat (stämde era sekvenseringsresultat med era
kålsorter?) inför klassen och ev. felkällor vid sämre resultat.
Ni ska även i gruppen skriva en sammanfattande förklaring på metoderna ni arbetat med:
extraktion, PCR, gelelektrofores och Sanger-sekvensering. (max 2 sidor, fakta ska hämtas från
vetenskaplig litteratur.)
19