Institutionen för fysik, kemi och biologi C-uppsats Lärarprogrammet 15 hp Metodutveckling för användning av genen rbcL för barcoding av arkeologiskt material av Brassica sp. Utformande av laborationshandledning i bioteknik för gymnasieskolan Malin Ottosson LiTH-IFM- Ex--14/2959-SE Handledare: Jenny Hagenblad, Linköpings universitet Examinator: Thomas Östholm, Linköpings universitet Institutionen för fysik, kemi och biologi Linköpings universitet 581 83 Linköping 1 Datum/Date Institutionen för fysik, kemi och biologi 2014-06-08 Department of Physics, Chemistry and Biology Språk/Language Rapporttyp1 Report category Svenska/Swedish Examensarbete C-uppsats ISBN LITH-IFM-G-EX—99/1111—SE __________________________________________________ ISRN __________________________________________________ Serietitel och serienummer Title of series, numbering ISSN Handledare/Supervisor Jenny Hagenblad Ort/Location: Linköping Titel/Title: Metodutveckling för användning av genen rbcL för barcoding av arkeologiskt material av Brassica sp. Utformande av laborationshandledning i bioteknik för gymnasieskolan Författare/Author: Malin Ottosson Sammanfattning/Abstract: För att ta reda på vad människor odlade och åt förr i tiden är arkeologer intresserade av en metod för att artbestämma frön som är svåra att identifiera utifrån morfologi eller så pass nedbrutna att det är omöjligt. En av de arter som är svårtidentifierade utifrån morfologi är Brassica sp.. (kål). I denna rapport redovisas en början till metodframställning där barcoding används för kloroplastgenen rbcL på 22 arter/underarter av Brassica sp.. För att jobba med nedbrutet arkeologiskt DNA (aDNA) används istället för vanlig sekvensering pyrosekvensering. Pyrosekvensering fungerar bättre eftersom den kan sekvensera mindre fragment som t.ex. delvis nedbrutet aDNA. Primers till PCR och pyrosekvensering designades för vissa intressanta sites i rbcL. Pyrosekvenseringen fungerade som metod men genererade inget resultat. Referenssekvensen från genbanken matchade inte kålprovernas DNA. Detta kan bero på inomartsvariation eller fel i genbanken. RbcL kan användas som barcodingregion för Brassica sp. eftersom det finns variabla sites. Sekvenseringar på alla de aktuella kålproverna kan vidare göras för att använda dessa som referenser i pyrosekvensering. En laborationshandledning gjordes för gymnasieelever i bioteknik där extraktion, PCR och sekvensering av Brassica sp. genomförs. Nyckelord/Keyword: pyrosekvensering barcoding Brassica sp. PCR rbcL laborationshandledning bioteknik 2 Innehållsförteckning 1. Inledning ....................................................................................... 4 1.1 Bakgrund: ...................................................................................... 4 1.2 Pedagogisk bakgrund .................................................................... 5 1.3 Målsättning .................................................................................... 5 2. 2.1 Material och metoder.................................................................... 6 Odling ....................................................................................... 6 2.2 Bioinformatik ................................................................................ 7 2.3 Extraktion ...................................................................................... 7 2.4 PCR ............................................................................................... 7 2.5 Pyrosekvensering .......................................................................... 9 2.6 Praktiskt pedagogiskt arbete.......................................................... 9 3. Resultat ......................................................................................... 9 3.1 Forskningsresultat ......................................................................... 9 3.2 Pedagogiskt resultat..................................................................... 12 4. 4.1 Diskussion .................................................................................. 12 Diskussion om metodutveckling ............................................. 12 4.2 Samhälleliga och etiska aspekter: ............................................... 13 4.3 Diskussion laborationshandledningsframställning...................... 14 5. Tack ............................................................................................ 15 6. Referenser ................................................................................... 15 7. Appendix .................................................................................... 17 7.1 Tabell A1 ..................................................................................... 17 7.2 Laborationshandledning .......................................................... 18 3 1. Inledning 1.1 Bakgrund: Arkeologin kan ge oss kunskap om vår historia. En intressant aspekt av det är vad folk har odlat och livnärt sig på. För att ta reda på detta samlar arkeologer in frön och växtdelar när de gräver ut boplatser (Hansson M. C. 2008) I många fall kan man artbestämma frön utifrån morfologi. Dock bryts fröna ner mer och mer ju äldre de är och blir därmed svårare att identifiera och i vissa fall kan man inte bestämma art utan endast släkte eftersom fröna är för lika. Släktet kål (Brassica sp.), är en växt i familjen korsblommiga växter som har använts mycket till matlagning. Det finns många olika underarter men några exempel är senap, raps, rovor, vitkål, brysselkål och broccoli. Kål har troligen har odlats i Sverige ända sedan vikingatiden. (Jens Heimdahl 2010). Det sägs att Gustaf Vasa var tokig i vitkål, men att andra former av kål förmodligen odlades långt innan det (Israelsson 2000). Problemet är att kålfrön är väldigt svåra, redan i färskt tillstånd, att artbestämma från frömorfologi även om olika typer av kål i fullvuxet tillstånd ser väldigt olika ut. Att utveckla en metod för att kunna skilja dessa åt med hjälp av DNA skulle därför vara värdefullt för arkeologer. DNA-barcoding är en molekylärgenetisk metod där en region genotypas för att identifiera olika arter (CBOL plant working group 2009). Finns det positioner i genomet där DNAt hos olika arter konsekvent skiljer sig i form av olika kvävebaser går arter att särskilja och identifiera. Vet man redan var i genen två arter skiljer sig kan man genotypa just den regionen, detta görs med hjälp av jämförelse med DNA-sekvenser av samma art i genbanken National Center for Biotechnology Information (NCBI 2014). Genom att använda mitokondriegenen CO1 kan många djurgrupper artbestämmas (Herbert PDN et al) 2003). Dock fungerar det inte att använda mitokondrieDNA i växter eftersom det är för liten skillnad mellan olika arter på grund av låg evolutionshastighet (Chase et al) 2007). Det behövs alltså en annan fungerande barcodingregion för dessa (CBOL plant working group 2009). Forskning har gjorts för att hitta den gen eller gener som skulle kunna vara det universella barcodingverktyget för växtriket. T.ex. har växters plastid-genom undersökts. Detta liknar mitokondrie-DNA såtillvida att det har ett högt antal kopior av genen i varje cell vilket underlättar DNA-duplikationen i Polymerase Chain Reaktion (PCR) och sekvensering. Problemet är att det är svårt att hitta tillräckligt variabla regioner i plastiden på grund av den långsamma evolutionshastigheten (Chase et al) 2007). Det finns även förslag på att använda internt transkriberade spacerdelar av nukleärt ribosomalt DNA (nrITS eller ITS). Dessa har fungerat bra som fylogenteisk markör i många grupper av blommande växter. I de flesta fall har den fungerat lika bra som plastid DNA men har upp till fyra gånger fler variabla sites (Chase et al) 2007). Detta betyder att det är upp till fyra gånger lättare att särskilja arter med ITS. Dock är ITS en gen där det evolveras multipla fungerande kopior vilket gör att den inte går att använda som standardbarcode. (Chase et al 2007, Rapini et al 2006) Det finns ännu ingen universell region som fungerar som barcode för alla landväxter. En annan lösning skulle 4 därför kunna vara en kombination av gener (Chase et al 2007). Generna rbcL och matK i en 2locus barcodekombination menas vara en realistisk kompromiss mellan universalitet (att de finns i alla växter), sekvenskvalitet, diskriminering (att arter går att skilja genom en udda kvävebas) och kostnad. Med denna kombination lyckades artspecificeringen till 72 % (CBOL Plant Working Group 2009). Det har även forskats på genen matK själv, eller i kombination med genen trnH-psbA fungerade i en studie att till 90 % urskilja orkidéer (Hollingsworth 2008). Ett annat alternativ skulle vara att forska fram olika specifika barcoding-gener för olika familjer eller arter och föra in dessa i en databas. Eftersom genen rbcL har fått goda barcoding-resultat tillsammans med andra gener används den ensam i denna studie för att se om det är rätt gen för släktet Brassica sp.. RbcL är en kloroplastgen och eftersom kloroplaster finns i så gott som alla landlevande växter är den intressant. Det finns även många exemplar av den i varje cell vilket gör det lätt att amplifiera i PCR. Vanligen sekvenseras större delar av gener och används till barcoding av färskt DNA som är intakt. Dessa metoder kan inte användas vid arkeologiskt DNA, aDNA, eftersom det ofta är så nedbrutet att endast små fragment av DNAt är intakt. Då finns det inte lika stor chans att DNAt är sammanhängande så att både forward- och reverseprimer kan binda in för att bygga nya DNA-kopior. Eftersom denna metod ska tas fram för arkeologiskt material med delvis nedbrutna frön görs genotypingen på Brassica sp.-DNAt med hjälp av pyrosekvensering. Pyrosekvensering är en bra metod eftersom den är noggrann och mycket lämpad för sekvensering av korta (nedbrutna) DNA-fragment. I denna studie användes färskt Brassica sp.-DNA men metoden utformas så att den sedan ska kunna användas på aDNA. 1.2 Pedagogisk bakgrund Enligt skolverket (2014) säger läroplanen allmänt för ämnet biologi att: ”Undervisningen… ska bidra till att eleverna utvecklar förmåga att arbeta teoretiskt och experimentellt… Undervisningen i ämnet biologi ska ge eleverna förutsättningar att utveckla: förmåga att planera, genomföra, tolka och redovisa fältstudier, experiment och observationer samt förmåga att hantera material och utrustning.” Specifikt inriktat på kursen bioteknik är det centrala innehållet bland annat: ” Experimentellt arbete inom bioteknik inklusive genteknik. Sterilteknik...” (skolverket 2014). Målet med den didaktiska delen av detta arbete att utveckla en laborationshandledning för elever där de ska få göra extraktion och PCR på olika arter av Brassica sp. som sedan skickas iväg för sekvensering. Detta för att få pröva metoderna, hantera material och utrustning och även för att förstå hur forskare jobbar i arbetslivet. Det viktigt för elever att kunna ha användning sina kunskaper och de kunskaper som ska läras behöver motiveras (Gustavsson 2002). Vetenskap ses ofta som något abstrakt som inte hör till verkligheten (Gomez 2006). Om denna metod förklaras i ett större perspektiv så eleverna förstår dels hur forskare arbetar och vad man kan åstadkomma med dessa metoder kan eleverna motiveras inom ämnet och se en framtid inom det. 1.3 Målsättning Målsättningen med arbetet är att utveckla en arbetsmetod för att artbestämma arkeologiskt material av Brassica sp. med hjälp av kloroplast-genen rbcL. Det är även att anpassa och 5 förenkla en del av detta arbete till en laborationshandledning för gymnasieelever i bioteknik. De ska med hjälp av denna laboration få använda och lära sig hur metoder fungerar så som DNA-extraktion, PCR och bioinformatik. 2. Material och metoder 2.1 Odling Fem frön av varje sort (se tabell 1) planterades i växthus med uv-lampor på dygnet runt, i 2025oC och de vattnades var tredje dag. När första riktiga bladparet utvecklats togs prover, stora som locket i eppendorfrör, från två individer per underart. Proverna förvarades i -80oC till användning. Tabell 1: Brassica sp. frölista Fröbanksnummer (accessionsnummer) Sortnamn Latinskt namn NGB23253 Brassica sp. nigra Brassica sp. nigra NGB11164 BLACK MUSTARD BRASSICA SP. NIGRA SORT SENNEP SORT SENNEP ÖSTGÖTA II NGB9911 HVAMMSROFA NGB4408 LAITIALA AP0106 NGB599 HUGO NGB10652 HANKKIJAN LAURI NGB13596 HANSEN NGB7796 BUDALSNEPE NGB14490 HÄRJEDALSK SKÅLROVA KULTA NGB21130 NGB21858 NGB11930 NGB600 RAPIDO I NGB2700 KASPER NGB1830 HØJ AMAGER AMA NGB1837 HALVHØJ KRUSET, HUNDERUP NGB1835 LAV KRUSET INDU NGB1878 AMAGER TIDLIG VINTER, TOFTØ NGB5014 ØYNA 6 Trivialnamn Svart senap Svart senap Brassica sp. nigra Brassica sp. napus ssp. napoBrassica sp. Brassica sp. napus ssp. napoBrassica sp. Brassica sp. napus ssp. napoBrassica sp. Svart senap Kålrot Brassica sp. napus ssp. oleifera Brassica sp. napus ssp. oleifera Brassica sp. napus ssp. oleifera Brassica sp. rapa ssp. rapa Brassica sp. rapa ssp. rapa Raps Raps Raps Rova Rova Brassica sp. rapa ssp. oleifera Brassica sp. rapa ssp. oleifera Brassica sp. rapa ssp. oleifera Brassica sp. oleracea ssp. sabellica Brassica sp. oleracea ssp. sabellica Brassica sp. oleracea ssp. sabellica Brassica sp. oleracea var. capitata Brassica sp. oleracea var. Rybs Rybs Rybs Grönkål Kålrot Kålrot Grönkål Grönkål Vitkål Vitkål NGB11996 BASTO NGB11685 GREENIA NGB12011 STOLTO F1 capitata Brassica sp. oleracea var. italica Brassica sp. oleracea var. italica Brassica sp. oleracea var. italica Broccoli Broccoli Broccoli 2.2 Bioinformatik DNA-sekvenser från genen rbcL hämtades för olika kålarter från genbank (NCBI 2014). Arterna som sekvenserna hämtades för var B. napus, B. napus rape, B. nigra black mustard, B. nigra, B. oleracea, B. oleracea capitata, B. oleracea italica, B. rapa oleifera, B. rapa rapa, B. rapa rapa. Sekvenserna alignades i programmet Geneious 7.1.5 (2014) för att se var i gensekvenserna DNAt skiljer sig mellan de olika underarterna. Ställen där det gick att skilja ut en kålsort från de andra på grund av variabla kvävebaser valdes ut. Den alignade sekvenserna lades ihop till en sekvens för alla rbcL där de variabla kvävebaserna var utmärkta. Denna sekvens lades in i programmet PyroMark Assay Design 2.0.1.15 (Qiagen, Hilden, Germany 2014) och primers designades för positioner med variabla kvävebaser. Det designades primers till PCR och även biotinylerad primer och sekvenseringsprimer designades till pyrosekvenseringen (Se tabell A1 i appendix). Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) kördes på de nydesignade primrarna i genbank(NCBI 2014) för att se så att de inte skulle binda in någon annanstans i rbcLsekvenserna eller till genomet i övrigt. Primers beställdes för PCR (se tabell A1 i appendix). 2.3 Extraktion DNA extraherades från alla 22 kålsorter (tabell 1) med hjälp av DNA-extraktion med Qiagen DNeasy plant mini kit (2014). Det gjordes en nanodroppundersökning på alla prov för att se om DNA-halterna var användbara. 2.4 PCR PCR gjordes enligt standardiserad metod. Mastermixreceptet som används för alla PCR-omgångar är beräknat för ett prov med slutvolymen 20µl. 16 µl dubbeldestillerat vatten (dd H2O), 2 µl 10x dreamtaqbuffer (MgCl2), 0,4 µl deoxynucleotide triphosphates (dNTP) (10µM), 0,2 µl forward primer 10µM, 0,2 µl reverse primer 10µM och 0,2 µl dreamtaq DNApolymeras (5u/µl) blandades. Till varje prov tillsattes sedan 1µl DNA-templat. PCR på hela rbcL: 7 PCR kördes med en gradient för annealing-temperaturen (den temperatur där primer och polymeras binder in till DNA) från 42-60oC på 8 prover av NGB2011. Den lägsta annnealingtemperaturen utan dubbelband var 53.9oC. PCR kördes därefter på alla 22 prover enl. tabell 2. Tabell 2. Inställningar för PCR-program för hela rbcL. Temperatur (oC) 94 94 53,9 72 72 4 Tid (min) 2:30 0:30 0:30 1:00 10:00 ∞ Cykler 1 36 36 36 1 1 2.4.1 PCR med självdesignade primers Primerparen pos.2 italica 4, pos.12 nigra 6, pos.16 raparapa 1, pos. 19 rapa rapa 3(se Tabell A1 appendix) kördes i PCR med vissa av kålproverna (tabell 3). Primerparen kördes på samma annealing-temperatur, 51oC och med mastermix enligt standardiserad metod. Elongeringstiden var 15 sek. i övrigt var PCR-programmet som i tabell 2. Tabell 3. Olika självdesignade primerpar som testades i PCR på de angivna kålaccessionerna. Primerpar Pos.2 Italica 4 Accessioner som användes NGB 11996, NGB 21858, NGB14490 Pos.12 Nigra 6 NGB 21858, NGB 600, NGB 11930 Pos.16 Raparapa 1 NGB 11930, NGB 14490, NGB 600 PCR på Pos.2 italica 1 kördes på annealing-temperatur 55.5oC och PCR på Pos.16 raparapa 2 kördes på annealing-temperatur 49.5oC. Annars i övrigt enligt PCR för de andra självdesignade primrarna med samma variation av accessioner. 2.4.2. PCR med biotinylerad primer: Biotinylerad version av Pos 2 Italica 4 och även sekvenseringsprimer beställdes från SigmaAlrich (Sverige). PCR med dessa kördes på de 22 Brassica sp.-proverna. Annealingtemperaturen var 51oC, annealing-tiden 1 min och det kördes 39 cykler. Mängden PCRprodukt för varje prov var 25µl. Mastermixen kördes enligt receptet men då omräknat till 25µl. Alla PCR- omgångar kontrollerades med gelelektrofores. Gelen förbereddes med 1,5 g agaros, 100ml tris-borate-EDTA (TBE) och 4µl Cybersafe till de hela rbcL-fragmenten och till de korta fragmenten från de egendesignade primerparen användes 2,5 g agaros. I 8 brunnarna lades en blandning av1.5 µl loading dye och 5µl PCRprodukt. En low range-stege användes och körtiden var ca 1 timme på 90v. PCR-produkterna med hela rbcL-sekvenserna exotap-renades från dNTP (oinkorporerade nukleotider) och primers. För 15 µL PCR-produkt tillsattes 0,015 µL 20 U/µL Exonukleas 1, 0,150 µL 1 U/µLThermosensitive alkaline phosphatase och 5,835 µL ddH2O. För att kunna skicka iväg proverna på sekvensering tillsattes Forward och Reverse primers i separata prover av varje sort och dessa skickades sedan till sekvenseringsföretaget Macrogen (Sverige). 2.5 Pyrosekvensering Pyrosekvensering kördes på alla PCR-produkterna med biotinylerade primers enligt. standardprogram. Pyrosekvensering är en metod där korta DNA-sekvenser kan sekvenseras i realtid. PCRresultat från den barcodingregion som ska undersökas blandas med de fyra enzymerna DNApolymeras I (Klenow fragment), ATP Sulfurylas, Luciferas och Apyras. Först sker DNA-polymerisation då tillsatt nukleotid som antas binda in formar ett baspar med templatet och börjar bygga på den växande DNA-strängen. DNA-polymeraset frisätter då pyrofosfat som fungerar som substrat åt ATP-sulfurylas. Genom ett par reaktioner frisätts ATP som görs om till ljus av Luciferaset. Apyraset tar bort oanvända nukleotider och ATP för att nästa nukleotid-typ ska kunna tillsättas. Ljuset som sänds ut kan detekteras och analyseras medan det händer. Tillsätts endast en kvävebastyp i taget detekterar maskinen om det sänds ut ljus eller inte och visar om denna typ av kvävebas binder in eller ej och därmed fås sekvenseringen (Ahmadian et al 2006). 2.6 Praktiskt pedagogiskt arbete Det framställdes en laborationshandledning för gymnasieelever. De ska med hjälp av denna laboration få använda och lära sig hur metoder fungerar så som DNA-extraktion, PCR och bioinformatik. 3. Resultat 3.1 Forskningsresultat Extraktion av DNA från kålproverna lyckades med hjälp av Qiagen DNeasy plant mini kit. För resultat av nanodrop-undersökning se tabell 4. Medelvärde på DNA-halt låg på 29,11ng/µl. Tabell 4: DNA-halten i extraktionerna av de olika kålproverna(tabell 1). Även renheten av provet visas under 260/280. Accessesionsnr. NGB7706 NGB4408 NGB10652 NGB11930 DNA-halt ng/µl 32,96 11,97 8,71 24,14 260/280 1,87 2,31 1,83 1,68 9 NGB11996 NGB 2700 NGB 5014 NGB 1835 NGB 11685 NGB blank 2 NGB 1830 NGB 21130 NGB1837 NGB 599 NGB 23253 NGB blank 1 NGB 21858 NGB14490 NGB 12011 NGB 1878 NGB 13596 NGB 600 NGB 11164 NGB 9911 27,89 87,75 29,06 52,10 29,68 3,82 19,70 23,76 38,55 50,91 26,34 0,57 37,09 27,05 19,87 17,87 9,54 29,97 12,32 23,23 1,93 2,61 4,00 1,44 3,70 -2,80 1,27 1,96 1,88 1,91 1,98 -0,88 1,91 1,68 2,98 6,39 3,71 3,55 12,05 3,18 Primers designades (se tabell A1 i appendix) utifrån sammanslagning av sekvenser från genbanken (NCBI 2014) (se tabell 6) där de intressanta variabla positionerna är markerade röda: GCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCACCTGAAGAAGCAGGGGCTGCG GTAGCTGCTGAATCTTCTA[C/T]TGGTACATGGACAACTGTGTGGACCG[A/G]TGGGCT TACCAGCCTTGA[T/C]CGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTCCAGGA GAAGAAA[C/A]TCAATTTATTGC[G/T]TATGTAGCTTACCC[C/T/A]TTAGACCTTTTTGA AGAAGG[G/T]TC[G/T]GTTACTAACATGTTTAC[C/T]TC[A/G]ATTGTGGGTAA[C/T]GTA TTTGGGTTCAAAGCCCT[A/G]GCTGCTCTACGTCTAGAGGATCTGCGAAT[C/T]CCTCC[ T/G]GCTTATACT[A/C]AAACTTTCCAGGGACCACCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAG A[T/G]AAATTGAACAAGTATGGACGTCCCCTATTAGGATGTACTATTAAACCTAA[A/G] TTGGG[T/G]TTATCCGCGAAGAACT[A/G]TGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTACGTGG TGGACTTGATTTTACCAAAGATGATGAGAATGTGAACTC[C/T]CAACCATTT BLAST kördes på de nydesignade primrarna i genbanken (NCBI 2014) för att se så de inte skulle binda in någon annanstans i rbcL-sekvenserna eller till genomet i övrigt. Detta för att undvika andra PCR-produkter som skulle störa resultatet. Det fanns likheter med vissa mitokondrie-DNA-sekvenser men detta ansågs inte vara någon risk. De PCR-primerpar som designats är Pos.2 Italica 4, Pos.12 Nigra, 6 Pos.16 Raparapa, 1 Pos.2 italica 1 Pos.16 raparapa 2. (se tabell A1). Tabell 5. Vilka sorter primerparen detekterar och vid vilken annealing-temperatur de fungerar. Primerpar Pos.2 Italica 4 Detekterar ut från de andra sorterna I tabell 1 Annealing-temperatur Broccoli 51oC 10 Pos.12 Nigra 6 Pos.16 Raparapa 1 Pos.2 italica 1 Pos.16 raparapa 2 Svart senap Rova Broccoli Rova 51oC 51oC 55.5oC 49.5oC Alla primerpar visade bra resultat i gelelektrofores. Pos 2 Italica 4 som detekterar broccoli gav en bra produkt och beställdes i biotinylerad form. PCR kördes med det biotinylerade primerpar på samtliga prover (tabell 1) med annealingtemperaturen 51oC. Gelen visade att storleken stämde på alla prover och gav ett bra resultat (Se figur 1). Figur 1: Gelelektrofores av PCR på alla 22 Brassica sp.-prover med den egendesignade biotinylerade primern Pos 2 Italica 4. Banden ligger på storleken mellan 50 och 75 bp. Enligt designprogrammet ska sekvenserna var 62bp. Pyrosekvenseringen som metod fungerade men resultat uteblev eftersom inte kvävebasordningen från referenssekvenserna stämde med provsekvenserna. För PCR av hela rbcL blev den lägsta annealing-temperaturen utan dubbelband 53.9o. Alla 22 prover (tabell 1) kördes i PCR med denna temperatur. Dessa följande prover fungerade enligt gelelektrofores och skickades på sekvensering: NGB12011, NGB11930, NGB7796, NGB1835, NGB600, NGB14490. Resultaten såg bra ut och jämfördes därför med sekvenser för samma art hämtade från genbanken (NCBI 2014), se tabell 6. Resultaten för detta visar att sekvenseringarna var mycket lika genbanksekvenserna men inte identiska. 11 Tabell 6. Sekvenseringsresultat för likhet i jämförelse med de sekvenser som hämtades från genbanken (NCBI 2014) för rbcL. Fröbanknr. NGB12011 Genbanknr. gi|247893165|gb|GQ184380.1 NGB 11930 NGB 7796 gi|30959084|gb|AY167977.1 NGB 1835 NGB 600 NGB 14490 Genbanksartnamn Brassica sp. Oleracea var. Italica Brassica sp. Rapa Brassica sp. Rapa subsp. Rapa voucher Wenpan gi|167156|gb|M88342.1 Brassica sp. Oleracea gi|30959084|gb|AY167977.1 Brassica sp. Rapa gi|247893147|gb|GQ184371.1 Brassica sp. Rapa subsp. Rapa voucher Wenpan gi|247893147|gb|GQ184371.1 Identiskhet 99,1% 97,5% 95,7% 99,4% 98,9% 99,5% 3.2 Pedagogiskt resultat En laborationshandledning till gymnasieelever i bioteknik har utformats (se DNA från Brassica sp. i appendix). 4. Diskussion 4.1 Diskussion om metodutveckling Syftet med den här studien var att utveckla en metod för barcoding av arkeologisk Brassica sp. med genen rbcL. Förr fick arkeologer förlita sig på de få lämningar av mat man kunde hitta för att spekulera i vad som åts och handlades med i forntiden. Nu finns barcoding med aDNA som är en mycket användbar metod (Hansson 2007; Schlumbaum et al 2008; Foley et al 2011). Med denna forskning är det visat att rbcL går att använda till barcoding av Brassica sp. tack vare de variabla positionerna. Chase et al (2007) skriver att en ideal barcodingregion ska vara så pass kort att den går att amplifiera utifrån nedbrutet DNA, men att de inte lyckats designa ett universellt primerpar ännu. Det har visat att korta aDNA-sekvenser på ca 100 bp kan skrapas av från insidan av 2400 år gamla förvaringskärl som tagits upp ur skeppsvrak i medelhavet. Även om inget synligt spår finns av innehållet har man ändå lyckats ta reda på vad som förvarades däri (Hansson M.C.2007; Foley B.P. et al 2011). Primerparen i detta forskningsprojekt designades utifrån dessa förutsättningar. Chase et al (2007) skriver vidare att de inte lyckats designa ett universellt primerpar ännu. RbcL är svår att få till som standardbarcode pga. bristande variabilitet men den är tillräckligt variabel för att särskilja på artnivå inom vissa familjer. Genen har använts till att identifiera dieten hos djur genom prover från maginnehåll och avföring (Schlumbaum A. et al 2008). Detta forskningsprojekt visar att rbcL kan användas till barcoding av Brassica sp. av angivna arter. Att det nu finns ett paket med färdigdesignade primerpar och biotinylerade primerpar för intressanta variabla positioner gör att det dock enkelt att forska vidare och optimera dem. Vidare forskning skulle leda till en färdig metod för att artbeststämma kålarter utifrån aDNA. Denna metod att undersöka aDNA kan i framtiden medverka till kunskap om forntida 12 naturmediciner, mat och dess konserveringsmetoder, vad man handlade med och vilka varor som var extra värdefulla. (Hansson M.C.2007; Foley B.P. et al 2011). Den kan även användas till att spåra ätbara växters ursprung, bevara förlorad genetiskt mångfaldsinformation, undersöka för att få information om utdöda arter och testa om fakta i historiska skrifter stämmer (Schlumbaum A. et al 2008). RbcL kan identifiera Brassica sp. som odlats mycket i norden men metoden skulle även kunna vidareutvecklas till att användas på andra släkten. På grund av bristande forskartid utfördes projektet så att primers designades utifrån redan gjorda sekvenseringar hämtade från genbaken (NBCI 2014). Hade mer tid funnits hade PCR på hela rbcL för de 22 proverna (tabell 1) gjorts först och skickats iväg på sekvensering. Sekvenseringsresultatet hade använts för att designa primers för att få ett korrekt pyrosekvenseringsresultat anpassat efter kålindividerna. I resultatet från pyrosekvenseringen var det en bas i referenssekvensen som inte stämde med kålsekvenserna som undersöktes. Detta gjorde att ingen av sekvenserna stämde med referensen och därmed stämde inte ordningen på tillsättningen av förväntade kvävebaser. Detta beror på att prov-kålplantornas DNA inte riktigt matchar det som finns upplagt i genbanken (NBCI 2014). Inomartsvariation kan vara en förklaring. Dock är rbcL är en rätt stor gen (1300 bp) och det kan då vara svårt att få precis alla kvävebaser korrekt, vilket kan göra att databasen inte stämmer exakt med dessa prover. Sangersekvenseringen visar att likheten med de sekvenser från genbanken som har använts till primerdesignen är väldigt hög men inte exakt 100 %. Detta ger en förklaringen till varför pyrosekvenseringen inte fungerade med genbankens referenssekvens men vidare forskning skulle behöva göras. Även i annan litteratur finns det över 10 000 rbcL-sekvenser inlagda i genbanker där många är felaktigt identifierade och inte visar hur de är utförda vilket gör att de borde göras om (Chase et al 2007). Det är alltså inte bara denna forskning som drabbas av felaktiga genbanksekvenser. Optimering av PCR för sekvensering skulle behöva göras för att kunna skicka alla 22 prover på sekvensering och sedan jämföra med referenseskvensen och pyrosekvenseringsresultat för att få en korrekt förklaring. Detta skulle även kunna användas till en ny pyrosekvensering med referenssekvenser från de egna proverna. Det är svårt att jämföra med tidigare färdiga resultat där rbcL ensam eller tillsammans med andra gener använts eftersom inte pyrosekvenseringen gav förväntade resultat. Dock visar tidigare forskning att rbcL är en användbar gen (CBOL Plant Working Group 2009) och detta projekt understyrker detta. 4.2 Samhälleliga och etiska aspekter: Barcoding kan även enligt CBOL plant working group (2009) vara till hjälp inom biologin vid studerande av växt-djurinteraktioner och i skogsindustrin för att upptäcka handel med produkter tillverkade av skyddade arter eller när det behövs göras stora biodiversitetsundersökningar men det är brist på taxonomisk expertis. Metoder för att kunna artbestämma forntida och fragmenterat aDNA skulle vara till hjälp för arkeologin när det är svårt att artbestämma inom olika släkten. T.ex. för att se vad medeltidsmänniskor odlade och åt till middag. Det finns inga etiska aspekter att ta hänsyn till i denna forskning. 13 4.3 Diskussion laborationshandledningsframställning Laborationen är till för att eleverna ska få laborationsvana och att på ytterligare ett sätt få temat DNA presenterat för sig. Växters DNA kommer ofta i skymundan i undervisning i skolan och därför kan detta ämnesområde belysa att även växter har DNA. Elever lär sig på olika sätt och vissa lär sig bäst av att få göra eller se. Att använda teoretiska kunskaper i praktiken för att få minnesbilder kan öka lärandet hos elever (Gustavsson 2002) Laborationshandledningen är utformad så att eleverna får arbeta själva med att räkna ut mängder av de kemikalier de ska använda och tänka ut vilka extra verktyg de ska använda utöver maskinerna. Jag upplever att lång text ofta kan göra elever omotiverade att läsa noggrant. Därför är det en balansgång att ange rätt mängd information för att få eleverna att jobba så självständigt som möjligt. Läraren kan även själv välja hur noggrant laborationen gås igenom innan start, beroende på klassen. Dock ingår många okända moment och vikten av att jobba sterilt är stor så att oönskat DNA inte amplifieras i proverna. Det används även små koncentrationer, dyra maskiner och micropipetter. Därför är laborationshandledningen gjord för bioteknikelever som redan läst biologi 1 och 2 och därför bör ha viss laborationsvana (skolverket 2014). Dock krävs även en lämplighets- och riskbedömning av klassen, både för om de skulle klara av laborationen och om de klarar det riskmässigt både ur maskinskade- och säkerhetssynpunkt. Vid de olika maskinerna är det dock lättare att läraren visar i praktiken hur det används. Läraren kan få räkna med att hjälpa till mycket under dessa lektioner men det är viktigt att eleverna och deras inlärningsprocess är i fokus (Fuglestad 1999). När man som lärare är med aktivt i arbetet är det lättare att observera när elever har svårt att förstå, och hjälpa dem. Frågan är även om laborationen är genomförbar i alla skolor? Det krävs en sal där sterilt arbete kan utföras, dragskåp och en del dyra maskiner. Alla skolor erbjuder inte ens bioteknik, men om man kan satsa på PCR- och gelelektroforesmaskiner skulle det kunna leda till att man kan profilera skolan. Laborationen skulle även kunna ingå i ett tema tillsammans med matematik och kemi och då skulle resurser kunna användas från alla ämnen. Tidsplanen för laborationen får delas upp på ett flertal laborationer, förslagsvis ett tillfälle för extraktion, ett för PCR, ett för gelelektrofores plus förberedelse för sekvensering och ett för bioinformatik. Det kan även behövas ett par extra tillfällen om eleverna inte är färdiga med sin inlämning eller om extraktion/PCR misslyckats på första försöket. Att eleverna ska försöka få sekvenseringsresultaten att stämma med de kålsorter de extraherade är ett resultat som inte processas vidare. Syftet är istället att lära sig metoderna för DNA-identifiering. Som Gustavsson (2002) skriver så kan det vara viktigare för elever att få göra insikter under processen än att nå ett mål eller ny upptäckt. Att jobba med laborationer inom bioteknik där eleverna sterilt får jobba med gener möter kursplanen på ett bra sätt (Skolverket 2014). Efter denna laboration har eleverna förhoppningsvis insikt i och förståelse av DNA-extraktion, PCR och bioinformatik. 14 5. Tack Ett stort tack till Jenny Hagenblad, Maria Lundström, Matti Leino, Thomas Östholm, Anders Hargeby och Karin Karlsson för hjälp, stöd och uppmuntran. 6. Referenser Ahmadian A. Ehn M. Hober S. (2006) Pyrsosequencing: History, biochemistry and future. Clinica Chimica Acta 363, 83-94 CBOL plant working group: Peter M. Hollingswortha,2, Laura L. Forresta, John L. Spougeb, Mehrdad Hajibabaeic, Sujeevan Ratnasinghamc, Michelle van der Bankd, Mark W. Chasee, Robyn S. Cowane, David L. Ericksonf, Aron J. Fazekasg, Sean W. Grahamh, Karen E. Jamesi, Ki-Joong Kimj, W. John Kressf, Harald Schneideri, Jonathan van AlphenStahle, Spencer C.H. Barrettk, Cassio van den Bergl, Diego Bogarinm, Kevin S. Burgessk,n, Kenneth M. Camerono, Mark Carinei, Juliana Chacónp, Alexandra Clarka, James J. Clarksone, Ferozah Conradq, Dion S. Deveye, Caroline S. Fordr, Terry A.J. Heddersons, Michelle L. Hollingswortha, Brian C. Husbandg, Laura J. Kellya,e, Prasad R. Kesanakurtig, Jung Sung Kimj, Young-Dong Kimt, Renaud Lahayed, Hae-Lim Leej, David G. Longa, Santiago Madriñánp, Olivier Maurind, Isabelle Meusnierc, Steven G. Newmasterg, Chong-Wook Parku, Diana M. Percyh, Gitte Petersenv, James E. Richardsona, Gerardo A. Salazarw, Vincent Savolainene,x, Ole Sebergv, Michael J. Wilkinsonr, Dong-Keun Yij and Damon P. Littley (2009) A DNA barcode for land plants. PNAS 106 (31), 12794–12797 Chase M.W., Cowan R.S., Hollingsworth P.M., Van den Berg C., Madrinán S., Petersen G., Seberg O., Jörgensen T., Cameron K.M., Carine M., Pedersen N., Hedderson T.A.J., Conrad F.,Salazar G.A., Richardson J.E., Hollingsworth M.L., Barraclough T.G., Wilkinson L.K., Wilkinson M. (2007) A proposal for a standardized protocol to barcode all land plants. Taxon 56 (2), 295-299 DNA-extraktion med Qiagen DNeasy plant mini kit (2014) beställt från www.qiagen.com 2014 Foley B.P., Hansson M.C.,Kourkoumelis D.P.,Theodoulou T.A. (2011) Aspects of ancient Greek trade re-evaluated with amphora DNA evidence. Journal of archaeological science 39, 389-398. Fuglestad O.L. (1999) Pedagogiska processer. Studentlitteratur AB, Lund Geneious 7.1.5 (2014) www.geneious.com hämtad 2014-05-16 Gomez Md.C. (2006) ”Biologi är äckligt, fysik tråkigt och kemi svårt” – att lära sig naturvetenskap i dagens grund- och gymnasieskola. Magisteruppsats, Lunds universitet Gustavsson B (2002) Vad är kunskap? En diskussion om praktiskt och teoretisk kunskap. Lenanders Grafiska AB, Kalmar 15 Hansson M.C., Foley B.P. (2007) Acient DNA fragments inside Classical Greek amphoras reveal cargo of 2400-year old shipwreck. Journal of archaeological science 35, 1169-1176 Heimdahl J. (2010) Barbariska trädgårdsmästare nya perspektiv på hortikulturen ibgm Sverige fram till1200-talets slut. Fornvännen 105, 265-280 Herbert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR (2003) Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc Biol SCI SerB 270:313-321 Hollingsworth PM (2008) progress and outstanding questions. Heredity 101, 1-2 Isaralesson L. (2000) Handbok för köksträdgården. Wahlström & Widstrand. Italien National Center for Biotechnology Information (NBCI) (2014) Brasscia-sekvenser. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ hämtad 2014-05-21 10:16 Rapini A., Chase M.W. & Konno T.U.P. (2006) Phylogenetics of the new world Asclepiadeae (Apocynaceae). Taxon 55:119-124 Schlumbaum A. Tensen M. Jaenicke-Després V. (2008) Ancient plant DNA in archaeobotany. Veget Hist archaeobot 17, 233-244 Skolverket (2014) Läroplan bioteknik. http://www.skolverket.se/laroplaner-amnen-ochkurser/gymnasieutbildning/gymnasieskola/bio?tos=gy&subjectCode=BIO&lang=sv hämtad 2014-06-08 16 7. Appendix 7.1 Tabell A1 Tabell A1: namngivning av primerpar: position x (i genen), xxxxx (vilken art den urskiljer från resten), x (vilken av de designade primrarna som designats på den positionen). primerparnamn Position 2 Italica 1 kvalitet primers 90 PCR F1 ACATGGACAACTGTGTGG PCR R1 TAGCATCGTCCTTTGTAAC Sequencing S1 AAGGCTGGTAAGCCC Position 2 Italica 4 87 PCR F1 TACATGGACAACTGTGTG PCR R2 AGCATCGTCCTTTGTA Sequencing S1 GGACAACTGTGTGGACC Position 12 Nigra 6 90 PCR F4 GTATTTGGGTTCAAAGC PCR R5 ATTCGCAGATCCTCTAG Sequencing S3 TGGGTTCAAAGCCCT Position 16 rapa rapa 1 95 PCR F1 CACCTCATGGTATCCA PCR R1 ACGTCCATACTTGTTCA Sequencing S1 CGTCCATACTTGTTCAAT Position 16 rapa rapa 2 94 PCR F3 GACCACCTCATGGTAT PCR R3 GACGTCCATACTTGTTC Sequencing S2 TGGTATCCAAGTTGAAAG 17 7.2 Laborationshandledning Laborationshandledning: DNA från Brassica sp. DNA är den mall i cellerna som bestämmer hur en organism ska se ut. Därför kan man kartlägga t.ex. en växts DNA och se vilken art det är utan att ha sett hela växten. Det kan räcka med att kartlägga en gen för att kunna särskilja organismen. Ni får i varje laborationsgrupp tre prover från olika arter av släktet Brassica sp. - kål. Här ska ni ta ut kloroplast-genen rbcL och låta den sekvenseras. Syftet med denna laboration är att lära känna och förstå metoderna. 1. Läs igenom denna riskbedömning: Vid alla steg ska labbrock, skyddsglasögon och handskar användas. DNA-extraktion med Qiagen DNeasy plant mini kit: Buffert AW1 innehåller guanidin hydrochlorid som kan bilda starkt reaktiva ämnen tillsammans med blekmedel. Låg risk PCR: Inga kända risker vid korrekt hantering. Låg risk Gelelektrofores och infärgning av gel med Sybersafe: Sybersafe Bör betraktas som cancerogen. Måttligt riskfylld (här kommer en i gruppen till läraren för gemensam gjutning av gel). 2. Ni ska extrahera DNA från tre Brassica sp.-prover med instruktioner från Qiagen DNeasy plant mini kit. Börja på steg 7. Lägg era prover på is när de är klara. 3. Beräkna hur mycket mastermix som behövs till era prover och ett kontrollprov för PCR. Tänk på att ta med i beräkningen så ni får ut 10 % extra mastermix för ev. spill. Mastermixreceptet som används för alla PCR-omgångar är beräknat för ett prov (en art kål) med slutvolymen 20µl. 16 µl ddH2O, 2 µl 10x dreamtaqbuffer (mgcl2), 0,4 µl dNTP (10µM), 0,2 µl forward primer 10µM, 0,2 µl reverse primer 10µM och 0,2 µl dreamtaqDNApolymeras (5u/µl) 4. Blanda er mastermix i ett Eppendorfrör. 5. Fyll PCR-rören med 19 µl mastermix och 1 µl prov, sammanlagt fyra rör, tre rör med prov och ett med 1µl ddH2O som kontroll för att se så mastermix och eppendorfrör är rena. 6. Sätt igång en PCR. Kör samtidigt som era klasskompisar. 18 Inställningar för PCRprogrammet: 1 2 3 4 5 6 Temp (oC) 94 94 53,9 oC 72 72 4 Tid (min) 2:30 0:30 0:30 1:00/kb 10:00 ∞ Cykler 1 36 1 1 7. När PCR-omgången är färdig ska resultatet testas i gelelektrofores för att se om rätt produkt extraherats utan kontamination av andra proteiner. Gjut gel tillsammans med lärare. Gelektroforesrecept: Gel: 1.5g agaros, 100 ml TBE, 4µl cybersafe (obs! i dragskåp med hanskar och angivet avfall!) Prov: 5µl PCR-produkt + 1.5µl loading dye x6 per brunn Stege: 100 bp Styrka: 90 V 8. Har resultatet rätt storlek jämfört med stegen, inga dubbelband och visas tydligt ska PCRprodukten exotap-renas från dNTP(oinkorporerade nukleotider) och primers. För 15 µL PCRprodukt som ni nu har för varje prov tillsätts 0,015 Exonukleas 1, 0,150 µLT. alkaline phosphatase och 5,835 µL ddH2O. Sedan sätts 5 µL av de renade PCR-produkterna i två brunnar vardera. I den ena sätts 5 µL 5 µM forward primer och i den andra 5 µL 5 µM reverse primers. 9. Glöm inte att fylla i schemat över brunnarna tydligt så ni vet vad ni har placerat var. Läraren visar hur. 10. Vänta otåligt på att få tillbaka sekvenseringsresultaten! 11. När resultaten kommit jämförs de med sekvenser från genbank och ser om det är den kålarten ni extraherade (fråga lärare om genomgång av databas). Redovisning: Alla grupper redovisar sitt resultat (stämde era sekvenseringsresultat med era kålsorter?) inför klassen och ev. felkällor vid sämre resultat. Ni ska även i gruppen skriva en sammanfattande förklaring på metoderna ni arbetat med: extraktion, PCR, gelelektrofores och Sanger-sekvensering. (max 2 sidor, fakta ska hämtas från vetenskaplig litteratur.) 19