Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi
Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete 15 hp Våren 2012
MEASUREMENT OF C-REACTIVE PROTEIN IN CANINE SERUM ON KONELAB
AUTOANALYZER 20
Christina Sahlén
Abstract:
An inflammatory reaction is induced after release of proinflammatory mediators such as
interleukin 1 and 6 and tumour necrosis factor α. These mediators stimulate the liver to
suppress the syntheses of albumin and endure the syntheses of acute phase protein for
instance C-reactive protein. The aim of this paper was to perform a method validation on an
immune turbidimetric assay to quantify C-reactive protein in canine serum at the laboratory at
Skara Animals Hospital, Skara, Sweden. The validation involved evaluation of the assay
linearity, precision, stability and recovery.
The method was proved to be linear for both TruLab control and Medinor control. The
TruLab control is based on human C-reactive protein while the Medinor control is based on
canine C-reactive protein. The precision of the method had a CV of 2.26 % (n=40). The
method is considered stable and has good precision, under the circumstance that the TruLab
control is used. It was concluded that a Canine CRP-control is required and should be
included in routine analysis.
Keywords: Immunoturbidimetric, Serum-concentration, Canine, Inflammatory, Acutephaseprotein.
Handledare Kerstin Thorén Tolling.
Skara Djursjukhus laboratoriet. Klinisk kemi.
1
Introduktion
En inflammatorisk process initieras alltid lokalt och karaktäriseras av 5 kardinaltecken; tumor,
rubor, calor, dolor och functio laesa det vill säga svullnad, rodnad, värme, smärta och
funktionsnedsättning [1]. Är dessa tillräckligt omfattande kommer proinflammatoriska
mediatorer frisättas i kroppens cirkulation [1,2]. Inflammationen blir då systemisk. De
proinflammatoriska mediatorerna kommer att i sin tur leda till ett akutfassvar.
Akutfasproteiner (APP) är proteiner som kan påvisas i en individs serum från det akuta
skedet av en inflammation till dess att den är bekämpad av immunförsvaret och
inflammationen avstannat [1,2]. Akutfassvaret är responsen av de proinflammatoriska
cytokiner som frisätts vid en infektion eller ett vävnadstrauma vanligen från stimulerade
monocyter och makrofager i inflammationsområdet [1,2,3]. Cytokinerna är bland annat
interleukin 1 och 6 (IL1, IL6) och tumour necrosis factor α (TNFα) [1,2].
Cytokinerna i sin tur påverkar levern att antingen öka eller minska produktionen av APP.
Exempel på proteiner som hämmas är albumin och transferrin. Dessa nedprioriteras i förmån
till de dominerande, kraftigt ökande APP. Detta gäller framför allt C-reaktivt protein (CRP),
serumamyloid A (SAA) och haptoglobulin [1,2].
CRP och SAA räknas som två lämpliga akuta markörer för inflammation eftersom de båda
ökar mycket snabbt i koncentration redan inom några timmar efter inflammationens början
[1]. CRP kan fästa vid bakteriens kapsel och tillkalla makrofager för att destruera bakterien.
Därför måste den öka snabbt vid ett akut inflammationssvar [1]. På grund av sin korta
halveringstid kommer dessa även att försvinna ungefär i takt med inflammationen avslutas
[1,2].
På den humana sidan upptäcktes CRP år 1930 och då hos patienter med pneumoni där den
fanns bunden till C-polysackariden på pneumokockerna [5], 1947 karaktäriserades det som ett
akutfasprotein och 1950 användes markören för första gången inom diagnostiken och då för
övervakning av reumatiska patienter [1]. Inom veterinärmedicinen har kunskap om CRP länge
funnits men intresset för proteinet som en diagnostisk inflammationsmarkör initierades först
under 1980-talet [1]. Kunskapen kring biomarkörer och klinisk kemi hos veterinärer är
överlag relativt låg i Sverige idag men man vill främja vikten av dessa och således öka
användandet av dessa inom diagnostiken.
Hundens CRP-respons liknar i många avseenden människans, vid homeostas är
serumkoncentrationerna låga, man ser en snabb ökning och maximala koncentrationer redan
efter 24 timmar efter inflammatorisk stimulans [1,4]. Hundar drabbas, som människor av
systemiska inflammatoriska sjukdomar och sjukdomar som visat sig förhöja CRP-nivåerna
hos hundar är bland annat parvovirusinfektion, pyometrios akut pancreatit, immunmedierad
hemolytisk anemi, reumatisk artrit och glomerulonefrit [5]. Andra autoimmuna sjukdomar
och bakteriella infektioner så som lunginflammationer har också visat sig ge upphov till
förhöjda koncentrationer av CRP [1,4,5,6]. För att monitorera hundens skov vid kronisk
inflammatorisk sjukdom har CRP visat sig vara till stor hjälp [1,7]. Hos hundar med
postoperativa infektioner används CRP för att ställa diagnos och följa upp verkningsgraden av
behandling med antibiotika [1].
Det ska dock sägas att det har utförts sparsamt med undersökningar och studier för att utreda
sjukdomarnas individuella påverkning på CRP-värdena hos hunden. Det som mestadels
2
utförts är fåtalet undersökningar med avseende leukocyter, neutrofiler och CRP i förhållande
till varandra vid det uttalade sjukdomsfallet [5]. Med ökad förståelse för klinisk kemi hos
veterinärer förväntas också ökat antal publicerade undersökningar kring CRP och hundars
inflammationssjukdomar.
Huruvida CRP skulle fungera som cancermarkör och användningen har diskuterats inom
human- såväl som veterinärmedicinen. På djursidan och framförallt hos hundar har det visat
sig att neoplastiska sjukdomar i sig inte påverkar CRP-nivåerna i blodet. Detta under
förutsättning att cancern inte förorsakar nekros eller vävnadstrauma. Därmed blir ökningen av
CRP endast en sekundärmarkör vid tumörsjukdom [1,5,6,8]. Detta redskap används även i
humandiagnostiken och då i syfte att avgöra överlevnadsprognosen vid neoplastiska
sjukdomar då det visat sig att CRP-nivåerna är en betydande faktor i sjukdomsbild.
Det finns en större risk att det finns en spridning av neoplastiska celler, malignitet,
metastasering om en inflammation, blödning uppstått nära modertumören [9].
Den har visat sig vara en framgångsrik markör vad gäller övervakning av hundar med
immunmedierad hemolytisk anemi. Markören kan dock inte tala om hur hundens
överlevnadschanser ser ut [9]. Hundar såväl som människor kan ses med ökad CRP-nivå vid
artheoskleros, hundar som verkar predisponerade för detta är av rasen minischnauzer [10]
Patologiska nivåer av CRP kan ses hos hundar med en systemisk inflammationsbild.
Hundar med lokala infektioner så som ytliga bölder eller dylikt har en moderat eller låg
koncentration av CRP [1]. Den förhöjda CRP-koncentrationen kan inte indikera vilket agens
som förorsakat inflammationen. Förhöjningen kan endast svara på att inflammationen
föreligger och med hjälp av CRP-övervakning kan man följa inflammationens förlopp [1,5].
För bestämning av CRP finns ett antal metoder beskrivna i litteraturen [3,4,6,8,11,12,13].
Human CRP-bestämning grundar sig ibland på monoklonala antikroppar mot humant CRP
[4]. Detektionsmetoderna som används är Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA),
immunoturbidimetri och en modernare metod som innefattar magnetiska nanopartiklar
coatade med antikroppar [1,3,4,6,8,11,12,13,14]. De antikroppsklädda magnetiska
nanopartiklarna reagerar sedan med CRP i patientprovet och kvantifieras med hjälp av en
specifik nanopartikelmätare som mäter bindningsgraden mellan antikropp och CRP. Tidigare
referensmetoder har baserat sig på ELISA-teknik [8,10]. Denna metod har varit svår att
adoptera till automatiska kemiinstrument och kostnadseffektivt kunna konkurrera med till
exempel turbidimteriska metoder. ELISA metoden är betydligt mer kostsam och krävande per
prov. Laboratorier som använder sig av automatiserade kemiinstrument brukar därför använda
sig av immunoturbidimetriska metoder för bestämning av bildat antikropp-antigenkomplex.
Vid bestämning av CRP med immunoturbidimetrisk metod hos hund används polyklonala
antikroppar mot humant CRP [2]. Korsreaktiviteten mellan human antikropp och hund-CRP
är oftast god och reagenset blir betydligt billigare än användandet av en monoklonal hundCRP-antikropp och används därför i större utsträckning [2]. Det finns även nackdelar med
monoklonala antikroppar och deras höga specificitet kan resultera i obalans i bindningen
mellan antigen och antikropp som i sin tur ger en för låg aggregatbildning vilket ger en
försvagad turbulens [2]. I dagsläget utarbetas metoder med polyklonala antikroppar mot hundCRP för ökad specificitet och kvalitet då efterfrågan på detta sannolikt kommer att öka [2].
Syftet med projektet är att validera en kvantitativ bestämningsmetod för CRP-koncentration
i hundserum för rutinanalys. Valideringen som kommer att köras in på kemiinstrumentet
Konelab autoanalyzer 20 kommer att innefatta linearitet, repeterbarhet, hållbarhet hos prover
och kontroll, och riktighet hos metoden genom analys av dubbelprover. Ett referensintervall
för friska djur framarbetas för instrumentet.
3
Specificitet och sensitivitet hos CRP som inflammatorisk markör vid olika
sjukdomstillstånd har utvärderats i olika studier och där framkommer att CRP är en markör
med hög sensitivitet vid inflammatoriska sjukdomstillstånd [1,2,5,6]. Ålder, kön eller ras hos
hunden saknar signifikans i enlighet med studier som tidigare publicerats [5]. Därför togs
ingen hänsyn till detta i undersökningen
Material och metoder
Prover och provhantering:
Venösa blodprover från hundar samlades in, efter medgivande av djurägare, från rutinprover
vid djursjukhuset i Skara. Insamlat material fanns också att tillgå från BioVet,
veterinärmedicinskt laboratorium i Stockholm, detta material bestod av blodprover tagna på
hundar som var positiva för reumatoid faktor dvs. inflammatorisk sjukdom några under ett
reumatiskt skov. Prover från en frisk djurgrupp samlades in från Skara djursjukhus
personaldjur. Totalt samlades 39 prover från sjuka inskrivna hundar på Skaras djursjukhus, 18
prover från BioVet på hundar med känd reumatisk artrit och 12 prover på friska normala
hundar.
Rutinproverna var tagna i serumrör utan antikoagulantiatillsats av djursjukvårdare och
veterinärer. Proverna centrifugerades och hälldes av i ellermanrör. Prover från externa enheter
var frysta. Dessa tinades upp och blandades noggrant före analys. Proverna märktes med
provnummer. Efter analys frystes proverna in i -20 frys.
En mindre undersökning av leukocytnivån jämfört med koncentrationen av CRP gjordes med
hjälp av manuell differentialräkning av blodutstryk på 15 av de under projektet körda
proverna.
Turbidimetrisk kvantifiering av CRP
Reagens 1: Anti-human CRP antikroppar från get tillsammans med TRIS pH 8,0 och
stabilisatorer (DiaSystem Scandinavia AB, Sverige). Reagens 2: Buffert innehållandes TRIS
pH 7,5, polyethylenglykol (PEG), detergenter och stabilisatorer, dessa är ej närmare beskrivna
i produktbeskrivning (DiaSystem Scandinavia AB, Sverige). Internkontroll med humanserum
som innehöll CRP-koncentrationer på 130mg/L (TruLab CRP som tillhandahölls av av
DiaSystem Scandinavia AB, Sverige) användes. Metoden kalibrerades med hjälp av kitets
medföljande kalibrator
Metoden som utvärderades var immunoturbidimetrisk och det innebar att antiserum från
get innehållande antikroppar mot human-CRP reagerade med CRP i provet (från hund). Detta
gav upphov till en grumling av provet. Därefter mättes grumlingen, provets turbulens, med
spektrofotometri vid 340 nanometer. Den uppmätta absorbansen är direkt proportionell mot
mängden antikropp-antigenkomplex som bildats och därmed mängden CRP mätt i mg/L.
Metodens linearitet och beräkning av metodfel
En internkontroll med den kända koncentrationen 130mg/L späddes i sju steg; 1:2, 1:4, 1:8,
1:16, 1:25, 1:32 och 1:64. Ett nollprov kördes också. Alla prover kördes i duplikat. De
beräknade, väntade koncentrationerna jämfördes med de faktiskt uppmätta värden som erhölls
efter körning av standardkurvan. Värdena plottades i en graf och reaktionens linearitet kunde
åskådliggöras. En överensstämmelse mellan beräknat och uppmätt värde på +/- 10 %
bedömdes som acceptabelt för metoden.
4
Referensvärdet för metoden beräknades genom körningar på serum från en
normalpopulation. Prover kördes dubbelt på ett annat djursjukhus för att åskådliggöra hur
metoden ligger i förhållande till ett annat sjukhus metod och instrument.
Metodens precision
Proverna kördes i duplikat och därigenom erhölls metodens repeterbarhet och
inomserieprecision via beräkning av variationskoefficieten (CV). Det användes 40
provresultat körda i duplikat för beräkningen.
Metodens känslighet
Metodens lägsta detektionsgräns beräknades genom att den kända kontrollen späddes i en
serie på 5 steg. 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 och 1:32. Spädningarna kördes 2 gånger i triplikat med 2
timmars mellanrum. Detektionsgränserna hos analysmetoden är beroende av reagenset och
det analysinstrument man valt att använda. Rent teoretiskt kan man använda leverantörens
uppgifter om detektionsgränser, men i praktiken uppstår markanta skillnader mellan olika
analysinstrument trots användning av samma reagens. Därför bör detektionsgränsernas
riktighet på det aktuella analysinstrumentet alltid utvärderas. Detektionsintervallet på detta
laboratorium bestäms till det högsta och lägsta värde som kunnat bestämmas inom metodens
linjära mätintervall.
Hållbarhet
Stabiliteten hos prover och reagens testades genom att två eller tre kända prov, ett prov med
hög CRP-koncentration ett med låg koncentration och den kända kontrollen analyserades
upprepade gånger över den tidsperiod provet förvarats i kylskåp. Parallellt evaluerades även
reagensets hållbarhet. Detta utvärderades med kontrollen som referens. Kontrollen
utvärderades under en längre period än de utvalda proverna.
Resultat
Metodens linearitet och beräkning av metodfel
Metoden visade god linearitet inom intervallet 6 – 200 mg/L med Trulab kontroll på 130
mg/L figur 1A och med kalibrering figur 1B av instrumentet med DiaSystems kalibrator
inkluderad i reagenskitet. En god linearitet kunde ses med Medinors kontroll på 60 mg/L
analyserad i olika spädningar figur 1C. Samma reagens och samma kalibrator användes vid
båda utvärderingarna. En förskjutning i koncentration sågs vid utvärdering av Medinors
kontroll.
Normalpopulationens värden låg alla under lägsta detektionsnivån. Ett referensområde för
metoden bestämdes till 3 mg/L. Ett övre referensområde kan inte bestämmas på populationen.
Sex prover skickades till Universitetsdjursjukhuset vid SLU i Uppsala för kontrollanalys.
Prover under detektionsgränsen svarades ut som <5 mg/L. För 3 prover kunde resultat
urskiljas. SLU har överlag något lägre analysvärden än Skara djursjukhus.
5
FIGUR 1
Linearitet för mätning av CRP i serum hos hund med metod från TruLab, R2 0,9972 (A), DiaSystem R2
0,9997 (B) och Medinor R2 0,9996 (C).
De sex prover som kördes dubbelt med SLU i Uppsala visade på en avvikelse som varierade
mellan 7 till 11 procent. Skara djursjukus värden låg generellt högre än SLUs resultat. Antalet
prover var inte tillräckligt många för en statistisk beräkning. Tre av sex prover hade värden
över 5 respektive 6 mg/L vilket är metodens nedersta detektionsgräns.
Metodens precision
För beräkning av inomkörningsvariationen användes 40 provresultat av den totala mängden
körda prover i duplikat. Variationskoefficienten (CV) beräknades till 2,26 %. För variation
över tid uppmättes CV för TruLab kontrollen till 3,16 %
Metodens känslighet
Efter körning av kontrollen och spädningar av denna i triplikat 2 gånger med 2 timmars
mellanrum och sammanställning av den totala mängd körda prover fastställdes metodens
lägsta detekterbara nivå till 3 mg/L.
Hållbarhet
Koncentrationen hos ett serum innehållande CRP ökade långsamt med tiden figur 2.
Resultatet på prov innehållande hög koncentration CRP varierade från 179 mg/L upp till 196
mg/L över 5 dagar. Kontrollen låg relativt stabilt med ett spann på 128,2 mg/L upp till 143,1
mg/L över 11 dagar. Kontrollen kunde utvärderas längre eftersom mer volym fanns att tillgå
av denna. Resultatet för prov med låg koncentration CRP visade endast negativa värden.
6
FIGUR 2 Hållbarheten över tid räknat i dagar visar en ökning av koncentration hos provet. både
högkoncentrationsprovet (blå) och kontrollprovet(röd) visar att CRP är stabilt men ökar något över tid.
Diskussion
CRP hos hund har i många publikationer visats ha goda förutsättningar för att kunna användas
för diagnostik och monitorering av inflammatoriska sjukdomar [1,2,7]. Stegrade CRPkoncentrationer ses hos hundar med systemiska sjukdomar då en kronisk inflammatorisk
process föreligger [1,10]. Markören indikerar huruvida en inflammation existerar och i vilken
grad [1,10].
Resultaten som presenteras talar för att metoden är linjär och stabil från 3 mg/L till 200
mg/L. Det nedre detektionsvärdet grundar sig i en genomgång av körda prover och en
spädning av TruLab-kontrollen och Medinor-kontrollen.
Samtliga 12 värden för den friska populationen och även värden i populationen för
inskrivna djur på Skara Djursjukhus föll under detektionsgränsen på 3 mg/L. Rent
instrumentmässigt är ett nedre detektionsvärde på 6 förinställt. Värden under detta svaras ut
som <6 automatiskt av instrumentet. Det övre gränsvärdet har bestämts till 200 mg/L dels
eftersom för få prover med en CRP-koncentration över detta värde fanns att tillgå vid
utvärderingen och dels eftersom högsta standardpunkten för kalibreringskurvan är 200 mg/L.
Ett CRP-värde på 3 mg/L och därunder har samma kliniska relevans som ett värde på 5 mg/L
[15]. En säkerhetsmarginal finns med förprogrammeringen i instrumentet. Rent biologiskt har
hunden alltid en viss koncentration CRP i sitt blod. Därför kan inte analytiska resultat rent
teoretiskt vara noll eller underskrida noll. Men eftersom instrumentet beräknar
koncentrationen av CRP i provet rent matematiskt efter uppmätt absorbans är det i praktiken
möjligt med negativa värden. Att man sedan reflekterat över hur fysiologiskt riktigt dessa
värden är ses som relevant. Man kan anta att alla matematiskt beräknade negativa resultat har
ett reellt värde på 0<x<6.
Gruppen normala friska djur med en population på 12 djur låg alla under gränsvärdet med
negativa resultat. Detta försvårade införandet av ett referensvärde för friska hundar. I samråd
med ansvarig laboratorieveterinär Kerstin Thorén Tolling kommer koncentrationsnivåer under
6 att betraktas som normala. Detta är i likhet med hur man ofta hanterar låga CRP svar hos
människa. Där använder man sig ofta av beslutsgränser på < 5 mg/L eller <10 mg/L även om
ett sant referensvärde är <3 mg/L, beroende lite på ålder och sammansättning av
referenspopulationen. Den övre gränsen för normala hundar har varit svår att arbeta fram.
Medelvärde och standarddeviation för sjuka djur positiva för reumatoid faktor hjälpte till föga
eftersom medelvärdet understeg standarddeviationen så det undre gränsvärdet, det vill säga
det övre normalvärdet blev negativt.
7
Denna studie innefattade prover från hundar med positiv reumatoid faktor. Många av dessa
hundar hade förhöjda CRP-koncentrationer. Förekomst av enstaka låga, normalvärden kunde
ses men detta kan förklaras med att dessa hundar inte var mitt i en akut inflammationsperiod.
Vid sjukhuset, inskrivna patienter med varierande anamnes hade också varierande
koncentrationer av CRP. I och med detta gjordes en jämförelse med CRP kontra leukocyter.
Inget signifikant samband kunde ses. Många värden av CRP var negativa eller normala
samtidigt som antalet leukocyter kunde variera kraftigt.
Valideringen har utförts med ett begränsat antal prover och därmed blir studiens
tillförlitlighet svår att uttala sig om något som grundar sig på dessa resultat. Men utredningar
har gjorts med avseende på detta och även där syns inget signifikant samband [3].
En god repeterbarhet uppvisades och de 40 prover körda i duplikat gav ett CV på <3,5 %.
Använder man samma reagens och samma kontroll och utför alltsammans med samma
kalibrering kan man se att metoden har en acceptabel repeterbarhet.
Hållbarheten hos serum är god inom 5 dagar, därefter stiger koncentrationen av CRP.
Det öppnar möjligheter för transport av prover. Transporter inom Sverige skall ej ta längre än
1-2 dygn varför man skall kunna ta emot skickade prover från hela Sverige. Serumproverna
skall gärna vara avhällda om dessa skickas över helg för att undvika hemolys under
transporten vilket kan störa analysen. Ett serumrör skall hällas av inom 48 timmar. Eftersom
ingen hållbarhetsundersökning gjordes i avseende på frysta prover går man på laboratoriets
riktlinjer. Proverna sparas i kylskåp en vecka efter ankomst och därefter en månad i frysen.
Huruvida proverna går att analysera efter längre frystider återstår att utvärdera. I princip skall
en månads frystid vara mer än tillräckligt för alla rutinprover.
Ser man till internkontrollen är lineariten god. TruLabs kontroll distribueras av DiaSystem
Scandinavia AB. Den externa kontrollen från Medinor visade på en god linearitet. Värdena
var förskjutna och visade på en förhöjning av det observerade värdet kontra det beräknade
förväntade värdet men eftersom Medinors kontroll är framtagen för magnetisk nanoteknik och
inte immunoturbidimetri [10]. Variationer metoder emellan uppstår alltid. Den externa
kontrollen visar på en förskjutning av analysresultaten. Skillnaden mellan Medinors kontroll
och TruLab är också den att TruLab är humankontroll, Medinor är en kontroll baserad på
hundserum.
För initiering av metoden i rutinverksamhet bör laboratoriet överväga att använda sig av en
internkontroll av framställd med hundserum alternativt använda två polade serum med kända
koncentrationer, ett högkoncentrations- och ett lågkoncentrationsserum.
Grundar sig kontrollen på humant CRP ökar risken för felaktiga analysresultat framförallt i
samband med batchbyten. Eftersom reagenset är utvecklat mot humant CRP och man
utnyttjar korsreaktiviteten mellan CRP från de två arterna så finns det en risk att batchbytet
också innebär byte av antikroppar som använts för att producera reagenset. Det finns en risk
att korsreaktiviteten varierar mellan antikroppsbatcher och det kan påverka analysresultatet.
Har man en humankontroll så kommer man inte upptäcka skillnaden i korsreaktivitet och
risken är att man bibehåller ett bra antikroppsvar mot humant CRP men att reaktiviteten mot
hund CRP förändras. Det är därför viktigt att inkludera kontrollmaterial från hund för att
upptäcka denna typ av förändringar. Hundkontrollmaterialet måste åtminstone analyseras vid
batchbyten för att kontrollera ovanstående. Det finns också fördelar med att analysera
kontrollmaterialet från hund regelbundet även mellan batchbytena. Problemet med
hundkontrollmaterial är att de kan vara svårare att få tag på och de kan vara dyrare. En
kompromiss kan därför vara att ha både ett humant och ett hundkontrollmaterial som man
analyserar enligt förutbestämda schema.
8
Internkontrollens syfte är att se till metodens riktighet och om det går att applicera på de
prover som skall analyseras under dagen. Ligger kontrollen mer än 2 SD förskjutet
underkänns kontrollen och instrumentet kalibreras om.
Prover kördes dubbelt med SLU Uppsala och dessa låg något under Skara Djursjukhus
analyssvar. Detta kan förklaras med att SLU använder Randox human CRP immunoassay, det
vill säga samma metod men ett annat reagens av en större fabrikör. Om instrumentet är
detsamma framkommer ej. Därför bör man inte jämföra resultaten. Det finns heller ingen
säkerställd vetskap om deras internkontroll eller huruvida denna är human- eller hundbaserad.
Målet var att utföra en metodvalidering för att införa bestämning på CRP-koncentration i
serum från hundar och konklusionen av detta projekt är att metoden är linjär. Kontrollen som
valideringen är baserad på är av human basis därmed kan man endast avgöra om metoden
ligger instrumentellt rätt, men huruvida proverna som körs i daglig rutin är riktiga går inte att
svara på. En kontroll som körs dagligen bör tala om mer än bara om metoden i sig är stabil.
Den borde fastställa hur riktiga värden man erhåller. I dagsläget saknas en kommersiell
kontroll baserad på hundserum, därmed får man hålla tillgodo med humankontrollen.
Eventuellt att man poolar ett eget serum med en känd koncentration för att se så att
laboratoriets värden stämmer överens även med hundbaserade serum. Andra mindre
djursjukhuslaboratorier använder snabbtester för CRP-mätning och om en kommersiell
hundkontroll erhålls kommer det löna sig för mindre djursjukhus att skicka sina prover till
större djursjukhus med stora kemiinstrument eftersom snabbtestinstrumenten både är osäkra
och dyra [15].
Sammanfattningsvis visar valideringen av C-reaktivt protein på Konelab Autoanalyzer 20 ett
tillförlitligt resultat och metoden kommer att introduceras för rutinanalys i framtiden.
Acknowledgement
Först och främst vill jag tacka Skara Djursjukhus för deras stöd och hjälpsamhet i detta
projekt. Utan deras goda samarbetsvilja hade jag aldrig fått ihop alla prover som behövdes för
att genomföra valideringen.
Jag vill tacka Kerstin Thorén Tolling som hjälpt mig med sitt goda handledarskap, stöd och
breda kunskap. Det har alltid funnits svar att få när jag har frågat.
Ett varmt tack till Helena Skallström och Catharina Johansson som gjort mitt examensarbete
till ett nöje, samt hjälpt mig med alla laborationsrelaterade frågor jag behövt få svar på.
Referenser
[1] Kjelgaard-Hansen M: Användning av C-reaktivt protein hos hund i klinisk praxis. Svensk
Veterinärtidning, 14: 19-24 2009.
[2] Eckersall PD, Conner JG and Harvie J: An Immunoturbidimetric Assay for Canine
C-reactive Protein. Veterinary Research and Communications, 15: 17-24 1991.
[3] Kjelgaard-Hansen M, Friis-Mikkelsen L, Kristensen AT and Lundorff-Jensen A: Study on
biological variability of five acute-phase reactants in dogs. Compromiced Clinical Pathology,
12: 69-74 2003.
9
[4] Ridker PM, Hennekens CH, Buring JE and. Rifai N: C-reactive protein and other markers
in the prevention of cardiovascular disease in women. The New England Journal of Medicine,
342: 836-843 2000.
[5] Nakamura M, Takahashi M, Ohno K, Koshino A, Nakashima K, Setoguchi A, Fujino Y
and Tsujimoto H: C-reactive protein Concentration in Dogs with Various Diseases. Journal of
Veterinary Medical Science, 70: 127-131 2008.
[6] Tecles F, Spiranelli E, Bonfanti U, Cero´n JJ and Paltrinieri S: Preliminary Studies of
Serum Acute-Phase Protein Concentrations in Hematologic and Neoplastic Disease of the
Dog. Journal of Veterinary International Medicine, 19: 865-870 2005.
[7] Bathen-Noethen A, Carlson R, Menzel D, Mischke R and. Tipold A: Concentration of
Acute-Phase Proteins in Dogs with Steroid Responsive Meningitis-Artritis. Journal of
Veterinary International Medicin, 22: 1149-1156 2008.
[8] Kjelgaard-Hansen M, Kristensen AT and Lundorff Jensen A: Evaluation of a
commercially available ELISA for the determination of CRP in Canine serum. Journal of
Veterinary medicine. America, 50: 164-168 2003.
[9] Griebsch C, Arndt G, Ralia J, Schweigert FJ and Kohn B: C-reactive protein concentration
in dogs with primary immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Clinical Pathology, 38:
421-425 2009.
[10] Wong VM, Kidney BA, Snead ECR, Myers SL and Jackson ML: Serum C-Reactive
protein concentrations in healthy Miniature Schnauzer dogs. Veterinary Clinical Pathology,
40: 380-383 2011.
[11] Fransson BA, Bergström A, Wirdrop KJ and Hagman R: Assessment of three automated
assays for CRP determination in dogs, American Journal in Veterinary research, 68:1281
2007.
[12] Klenner S, Bauer N and Moritz A: Evaluation of three automated human
immunoturbidimetric assays for detection of C-reactive protein in dogs. Journal of Veterinary
Diagnostic Investigation, 22: 544-552 2010.
[13] Gan N, Hou J, Cao Y, Li T, Guo Z and Wang J: A renewable and ultrasensitive
electrochemiluminescence immunosenor based on magnetic RuL@SiO2-Au~RuL-Ab2
sandwich-type nano-immunocomplexes. Sensors Basel, 11: 7749–776 2011.
[14] Kjelgaard-Hansen M, Lundorff Jensen A and Kristensen AT: Evaluation of a
Commercially Available Human C-Reactive Protein (CRP) Turbidometric Immunoassay for
10
Determination of Canine Serum CRP Concentration. Veterinary Clinical Pathology, 32: 8187 2003.
[15] Pickert HD, Einspanier R, Arndt G, Brunnberg L and Kohn B: Evaluation of a point-ofcare test for canine C-reactive protein. Veterinary Clinical Pathology, 40: 384-388 2011.
11
