SMIM1 som Vel blodgruppsprotein upptäckt och betydelse för transfusionmedicin Jill R. Storry, Ph.D. KIT, Medicinsk Service Lund Equalis användarmöte oktober 2014 Aktuell blodgruppsklassificering 339 antigener 297 ABO P1PK Lewis FORS GLOB H I LW Xg Duffy Lutheran Indian Scianna Raph JMH Oka 42 ”orphans” Högfrekvens Kollektioner Lågfrekvens Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Patientfall 141015 Kvinna, född 1944 i OP för ablation Tx 2006 med 2 enheter B+ blod, negativ BAS- test Fick också 4 enheter trc 15/10 screening celler 3+ IAT-gel Blodgruppering: Anti-A Anti-B Anti-D Anti-D 0 4+ 4+ 4+ A1c Bc 4+ 4+ Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Antikroppsutredning (Akut) Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Ak. utredning forts. Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Att göra idag: Fenotypa för Vel (S/s, Fya/Fyb, Jka/Jkb) Ev. excludera andra antikroppar i samband med en till Vel– prov (Kolla läget med patienten, förstås) Slutsats hittills: Ovanligt stark anti-Vel som reagerar RT till 37C IgM och IgG Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Bakgrund – en 60-årig gåta Anti-Vel beskrevs år 1952 av Sussman och Miller – Patient med antikroppar mot ett högfrekvent blodgruppsantigen som fick en kraftigt hemolytisk reaktion I Sverige saknar 1 av ~1700 individer Vel medan prevalensen i övrigt anges till 1 av ~5000 Antikroppar oftast blandning av IgG och IgM – Hemolytisk in vivo och in vitro Kliniskt viktigt vid transfusion och hemolytisk sjukdom hos nyfödda ABTI är det andra antigenet i kollektionen – (endast serologisk koppling) – Vel– celler är svagt ABTI+ – ABTI– celler är svagt Vel+ Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Bakgrund – en 60-årig gåta Svårt att hitta de få Vel– individerna i populationen – kommersiella reagens finns inte – monoklonala antikroppar saknas – Vel-uttrycket varierar Umeå har varit världens källa pga deras ”stora” grupp av Vel– blodgivare – Autosomalt recessiv nedärvning i familjer (Cedergren et al. 1976) Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Hypotes…. Den Vel-negativa fenotypen orsakas av homozygoti för en s.k. ”founder” mutation som finns i ett kromosomområde med ett definitivt SNP-mönster Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Illumina HumanOmni 2.5M BeadChip SNP-analys Array 2 Array 1 Prov nr. Vel fenotyp Källa 1 Vel– Lund givare 2 Vel– 3 Prov nr. Vel fenotyp Källa 17 Vel– orelaterade givare Umeå bror 1 18 Vel– orelaterade givare Umeå Vel+ svag son 19 Vel– orelaterade givare Umeå 4 Vel+ svag dotter 20 Vel– orelaterade givare Umeå 5 Vel– syskon givare Umeå 21 Vel– orelaterade givare Lund 6 Vel– syskon givare Umeå 22 Vel+ orelaterade givare Umeå 7 Vel– syskon givare Umeå 23 Vel– Lund givare 8 Vel+ svag syskon givare Umeå 24 Vel– bror 1 9 Vel– patient med anti–Vel 25 Vel+ bror 2 10 Vel– patient med anti–Vel 26 Vel+ svag son 11 Vel– orelaterade givare Lund 27 Vel+ svag dotter 12 Vel+ orelaterade givare Umeå 28 Vel– orelaterade givare Detroit 13 Vel– orelaterade givare Umeå 29 Vel– orelaterade givare Minneapolis 14 Vel– 15 Vel– orelaterade givare Umeå 31 Vel+ svag orelaterade givare HoustonAnvändaremöte 16 Vel– orelaterade givare Umeå 32 Vel+ svag orelaterade givare Lund DNA från 20givare Vel– familjer orelaterade Umeå individer, 30 Vel–inkl. 2 orelaterade givare Minneapolis Equalis 16 oktober 2014 Vel-uttrycket med flödecytometri på celler från Lund och Umeå familjer 5 1,2 Dotter 4 Bröder Son 3 Vel- syskon Lund Kontroll Umeå Kontroll (pp celler) Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 SNP analys resultat med Illumina HumanOmni 2.5M BeadChip CEP104 LRRC47 CCDC27 DFFB SMIM1 Chromosome 1 Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Kandidatgener Candidate AA (kDa) Protein product Function/localisation CCDC27 656 (75.4) Coiled-coil domain-containing protein 27 Unknown SMIM1 78 (8.7) Uncharacterised protein Type 1 transmembrane protein LRRC47 583 (63.4) Leucine-rich repeat-containing protein 47 RNA-binding, phenylalanine-tRNA ligase CEP104 925 (104.4) Centrosomal protein 104kDa Centriole; cytoskeleton DFFB 338 (39.1) DNA fragmentation factor, 40 kDa, beta polypeptide Nucleus, apoptosis factor CCDC27 SMIM1 LRRC47 CEP104 DFFB Equalis Användaremöte oktober 2014 SMIM1 består av 4 exoner med en öppen läsram i exon 3 och 4 Icke-kodande Kodande SMIM1-mRNA detekterades i: - perifert blod - erytroleukemi-cellinjer av KML-natur (t.ex. K562, HEL) - Primär benmärg från friska frivilliga odlades i erytroid riktning Equalis Användaremöte oktober 2014 Sekvensanalys av SMIM1 i Vel-negativa individer Upptäckte samma 17-bp deletion (c. 64-80) i alla Vel– prover som sekvenserats hittills (n=43) – Mest svenskt ursprung men också från bl. a. USA, Israel, England, Schweiz – Mutationen ger upphov till ett läsramskifte (förlängs med >500bp) mRNA detekteras med qPCR i Vel– individer – Dock: Inget fångades på 5’- eller 3’-RACE – Degradering? Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Vad kodar SMIM1 för? NCBI = okarakteriserat protein = nytt humant protein! – Ensembl = ingen proteinprodukt Kort typ 1 protein Ingen homologi med andra proteiner – Inga funktionella motiv Hög homologi mellan alla däggdjur; 56% homologi i zebrafisk Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Small integral membrane protein 1 78 aminosyror Type 1 transmembran- protein Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Polyklonala kanin-antikroppar 4 peptider syntetiserades mot den extracellulära delen – Inhiberingsförsök Polyklonala antikroppar gjordes mot peptider 1 & 3 – Hög specificitet och sensitivitet i Western blotting 41 A. Anti-GAPDH Anti-Peptid 1 1:5000 B. 1:10000 Vel+sv Vel+ Vel– Vel– Vel– 21 15 6,5 1:20000 28 21 15 6,4 27 1:50000 41 Anti-Peptid 1 Vel+ KDa Std 28 21 15 6,4 Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 SMIM1 uttrycksförsök i K562-celler • cDNA från Vel+ eller Vel– klonades i uttrycksvektorn pEF1α-IRES-ZsGreen1 • Transfekterade i K562 celler • Analyserade med flödescytometri vid 48 timmar • Celler analyserade med kanin anti-peptid 1 i WB mut. cDNA wt cDNA Anti-pept. 1 • Resulten räknade som relative ratio (RR) mot mocktransfektion med töm vektorn Mock Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 w/w w/w m/m m/m m/m w/m Utveckling av olika metoder för DNA-screening m/m w/m H2O m/m m/m w/w w/w w/w m/m w/m H2O m/m w/w m/m w/w A. ASP w/w B. RFLP Kontroll band Allel-specifik band Vel+ Vel– H2O mutant m/m m/m w/m w/m C. GSP w/w w/w wild type 520 Skåne blodgivare testade: 30 heterozygoter 0 homozygot mutant 1/17 heterozygot – frekvens av Vel–: 1/1250 Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 DNA markör Normal blodgivare H2O m/mVatten kontroll m/m w/mSc:–1 w/mCo(a–) C. GSP w/wVel– HPA-1a– w/wYt(a–) Kp(b–) Ingår i enkel screening metod för högfrekvens alleler Vel+ Vel– 493 bp 352 bp 303 bp 266 bp 164 bp 138 bp Modifierade efter Wagner et al. Transfusion 2008;48:1169-73 TVÅ nya Vel– blodgivare har hittats i första 1800 blodgivare! Bekräftade med serologi. Equalis Användaremöte oktober 2014 Relativt ration jämförde med Vel– celler Korrelation av zygositet med antigenuttrycket *** 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 B w/m w/w m/m m/m n=1 w/m w/m n=16 Anti-Vel w/w w/w n=21 Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 VEL Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Sammanfattning Vi har upptäckt en gen som innehåller en mutation hittades i alla Vel– prover testade hittills Uttrycksförsök i K562 celler visade att proteinet på cellytan För första gång kan Vel– screenas av en enkelt genomisk metod Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 May 2013 Equalis Användaremöte oktober 2014 På en brusig telefonlinje från Japan förklarar professor Martin L. Olsson… Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Andra variationer som påverkar Vel antigen uttryck 152 T>A/G Met51Lys/Arg Cvejic et al. Nat. Genet 2013;45:542-5 Storry et al. Transfusion 2013;53:40A van der Schoot et al. Vox Sang 2014;107 (Suppl):16 Svagare Vel antigen uttryck, bekräftade in vitro med transfektions försök i HEK-293T celler (van der Schoot) Rs1175550, i SMIM1 intron 2 Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 SNP variation i SMIM1 intron 2 - van der Haarst et al, Nature 2012 SMIM1 gene: 3,187bp C/A G/A A/G C/A C/A ChIP-seq Transcription Factor binding sites (ENCODE) Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 qPCR och flödescytometri visar hög uttryck kopplade till rs1175550G Relative Quantitation (2 -DDCT) 120% 100% 80% GGG AG A/G AAA 60% 40% 20% 0% Relative Mean Fluorescence Intensity SMIM1 transkript nivåer i blod 120% Vel antigen uttryck på erytrocyter 100% 80% 60% 40% 20% R2=0.6366, n= 141 0% GG AG AA rs1175550G => högst transkript nivå och anti-Vel reaktivitet rs1175550A => lågst transkript nivå och anti-Vel reaktivitet 63% av variationen i anti-Vel reaktivitet kopplade till rs1175550G (i prover utan 17-bp deletionen) Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 På gång i labbet… Kliniken: Fortsätta screena… Forskningslabbet: Titta närmare på polymorfismer i intron 2 som påverkar Vel-antigenets uttryck (MKC) Utreda transmembran GXXXG-motivets roll och extracellulära cysteiner (AN bl.a.) Uttrycka löslig Vel för struktur-bedömning/ inhibitionsmedel Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Varför bryr vi oss om Vel? Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Fallbeskrivning Antikroppsscreen reagerar positivt på 72-årig kvinna (B RhD neg) inkom för planerad operation Tidigare utredd på annat regionsjukhus i samband med ortopediskt trauma för ~8 år sedan Det tidigare serologiska mönstret tolkades som AIHA: – DAT-positiv – Egna celler reaktiva – Hemolys med papainbehandlade celler Patienten har aldrig fått blod Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Fallbeskrivning Pågående utredning: Stark reaktivitet med papainbehandlade celler i gel – Egna celler negativa 8 av 9 panelceller reaktiva med gel-IAT – Reaktivitet från +w till 2+ – Egna celler negativa Myntrullar i koksalt-rörmetod i 4oC och RT DAT var negativ 6 av 10 erytrocytenheter förenliga i gel-IAT Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 AK-identifiering panel D C E c e M N S s P K 1 k Fya Fyb Jka Jkb Gel IAT Pap37C 1 + + + + + + 0 + 0 0 0 + 0 + + + 2+ 3+ 2 0 0 0 + + + 0 0 + + + 0 + + 0 + 2+ 3+ 3 0 + 0 + + + 0 0 + 0 0 + + 0 + + 1+ 3+ 4 0 0 + + + + 0 + + + 0 + 0 + + 0 2+ 3+ 5 + + 0 0 + + + 0 + + 0 + + 0 + 0 2+ 3+ 6 + 0 + + 0 0 + 0 + + 0 + + + 0 + 1+sv 3+ 7 0 0 0 + + + 0 + + 0 + + 0 + + + 1+sv 3+ 8 + 0 0 + + 0 + 0 + + 0 + + + 0 + 0 3+ 9 0 0 0 + + 0 + 0 + + + + + 0 + 0 1+sv 3+ 0 0 Egna Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Vidare utredning Papain autoadsorbering gav ingen effekt, dvs kvarstående positiva reaktioner – Gjort baserat på tidigare undersökning Ingen inhibering med poolad plasma – AK8 känd som Rg- och Kn(a-) Operationen påbörjades, trots icke slutförd ak-utredning, med relativt lågt Hb – kirurgi med liten risk för blödning Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Vidare utredning Enzym- och DTT-behandlade celler: Gel-IAT Papain 3+ Trypsin 3+ α-chymotrypsin 2+ Pronas 4+ 200mM DTT 1+w ? Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Enzymtolkning Papain Trypsin -ct Pronas DTT Möjligt specificitet 0 0 0 0 + Ch/Rg, Xga 0 0 0 0 0 In, JMH 0 0 + 0 + MN, EnaTS, Ge2, Ge4 0/+ + 0 0 + ‘N’, Ss, Fya/Fyb, Fy6 0/+ + 0 0 0 Yta 0 + + 0 + EnaFS + 0 0 0 +w Lu, MER2 + 0 0 + +w Knops + + + + 0 Kell + + + +w/0 0 Sc + 0 +w 0 0 Do, Ge3 + + 0 0 0 Cromer, + + +w 0 0 LW + + + + + Jk3, Fy3, Dib ,Coa, Ge3; Oka, P, LKE, Ata, Csa, Emm, Era, Jra, Lan, Vel, PEL + + + + ++ Kx Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Reid, Lomas Francis & Olsson: The blood group antigen factsbook 3rd ed. 2012 Academic Press Patienten transfunderades… Postop dag 1: patienten drabbades av hjärtinfarkt – Transfusion påbörjades med en av de korstestnegativa enheterna Efter ~50 mL reagerade patienten med frossa och kräkning Transfusionen avbröts och prover skickades till labbet Serologisk mönster tillsammans med kliniska reaktionen ser ut som misstänkt anti-Vel? Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Varför anti-Vel? Tankar i efterhand… Patientens plasma svagare med DTT-behandlade celler Rainer T. et al. The effects of dithiothreitol-treated red blood cells with anti-Vel. Transfusion 2004;44:122A (Suppl.) – 4/10 anti-Vel visade försvagade reaktioner mot DTT-behandlade celler Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Bekräftat i Lund: flera anti-Vel reagerar svagare med DTT-behandlade celler I Lund: Ej behandlade DTT-behandlade Vel+, K- Vel-, K+ Vel-, K- Vel+, K- Vel-, K+ Vel-, K- 1.Vel + K 3+ 2+ 0 3+ 0 0 2.Vel 3+ 0 0 2+ 0 0 3.Vel + K 1+ 3+ 0 0 1+ 0 4.Vel 2+ 0 0 2+ 0 0 5.Vel 3+ 0 0 1+w 0 0 Antikropp Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Fortsatt undersökning Patientens celler typades som Vel-neg Plasman var förenlig med 3 Vel-neg testerytrocyter Antikroppar mot HLA-antigener också påvisbara Trots tillgång på fruset kompatibelt blod, nekade patienten ytterligare transfusioner Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Sammanfattning Utredningen visade ett svårtolkat mönster: Vel-antigenuttrycket på våra panelceller varierar Antikropp reagerade från RT till 37oC – Var det verkligen myntrullar? Fanns anti-Vel även vid 1:a undersökningen? Vel-antigen kan påverkas av DTT-behandling Anti-Vel är en lömsk serologisk specificitet som kan ge svåra transfusions-komplikationer om den inte upptäcks Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Varierar Vel-uttrycket så mycket som visats på den första panel? D C E c e M N S s P K 1 k Fya Fyb Jka Jkb Pt Känd antiVel 1 + + + + + + 0 + 0 0 0 + 0 + + + 2+ 3+ 2 0 0 0 + + + 0 0 + + + 0 + + 0 + 2+ 3+ 3 0 + 0 + + + 0 0 + 0 0 + + 0 + + 1+ 2+ 4 0 0 + + + + 0 + + + 0 + 0 + + 0 2+ 2+st 5 + + 0 0 + + + 0 + + 0 + + 0 + 0 2+ 2+ 6 + 0 + + 0 0 + 0 + + 0 + + + 0 + 1+sv 2+ 7 0 0 0 + + + 0 + + 0 + + 0 + + + 1+sv 2+st 8 + 0 0 + + 0 + 0 + + 0 + + + 0 + 0 1+ 9 0 0 0 + + 0 + 0 + + + + + 0 + 0 1+sv 2+ Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 En av ARDPs mest efterfrågade fenotyper Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Aktuell blodgruppsklassificering 2014 342 antigener 303 ABO P1PK Lewis FORS GLOB H I LW Xg Duffy Lutheran Indian Scianna Raph JMH Oka 39 ”orphans” Högfrekvens Kollektioner Lågfrekvens Equalis Användaremöte 16 oktober 2014 Tack… Samarbetspartners: Blodgruppen, Lund Johan Malmström, Lund Joyce Poole, Bristol Jan Hamilton, Detroit Hein Hustinx, Bern Vered Yahalom, Tel Aviv Er… för att ni lyssnade! ALF Equalis Användaremöte 16 oktober 2014