SMIM1 som Vel blodgruppsprotein - upptäckt och

SMIM1 som Vel blodgruppsprotein upptäckt och betydelse för
transfusionmedicin
Jill R. Storry, Ph.D.
KIT, Medicinsk Service
Lund
Equalis
användarmöte
oktober
2014
Aktuell blodgruppsklassificering
339 antigener
297
ABO
P1PK
Lewis
FORS
GLOB
H
I
LW
Xg
Duffy
Lutheran
Indian
Scianna
Raph
JMH
Oka
42 ”orphans”
Högfrekvens
Kollektioner
Lågfrekvens
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Patientfall 141015
 Kvinna, född 1944 i OP för ablation
 Tx 2006 med 2 enheter B+ blod, negativ BAS-
test
 Fick också 4 enheter trc
 15/10 screening celler 3+ IAT-gel
 Blodgruppering:
Anti-A Anti-B Anti-D Anti-D
0
4+
4+
4+
A1c
Bc
4+
4+
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Antikroppsutredning (Akut)
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Ak. utredning forts.
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Att göra idag:
 Fenotypa för Vel (S/s, Fya/Fyb, Jka/Jkb)
 Ev. excludera andra antikroppar i samband med
en till Vel– prov
 (Kolla läget med patienten, förstås)
Slutsats hittills:
 Ovanligt stark anti-Vel som reagerar RT till 37C
 IgM och IgG
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Bakgrund – en 60-årig gåta
 Anti-Vel beskrevs år 1952 av Sussman och Miller
– Patient med antikroppar mot ett högfrekvent blodgruppsantigen
som fick en kraftigt hemolytisk reaktion
 I Sverige saknar 1 av ~1700 individer Vel medan
prevalensen i övrigt anges till 1 av ~5000
 Antikroppar oftast blandning av IgG och IgM
– Hemolytisk in vivo och in vitro
 Kliniskt viktigt vid transfusion och hemolytisk sjukdom
hos nyfödda
 ABTI är det andra antigenet i kollektionen –
(endast serologisk koppling)
– Vel– celler är svagt ABTI+
– ABTI– celler är svagt Vel+
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Bakgrund – en 60-årig gåta
 Svårt att hitta de få Vel– individerna i
populationen
– kommersiella reagens finns inte
– monoklonala antikroppar saknas
– Vel-uttrycket varierar
 Umeå har varit världens källa pga deras ”stora”
grupp av Vel– blodgivare
– Autosomalt recessiv nedärvning i familjer (Cedergren
et al. 1976)
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Hypotes….
Den Vel-negativa fenotypen orsakas av
homozygoti för en s.k. ”founder”
mutation som finns i ett kromosomområde med ett definitivt SNP-mönster
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Illumina HumanOmni 2.5M BeadChip
SNP-analys
Array 2
Array 1
Prov
nr.
Vel
fenotyp
Källa
1
Vel–
Lund givare
2
Vel–
3
Prov
nr.
Vel
fenotyp
Källa
17
Vel–
orelaterade givare Umeå
bror 1
18
Vel–
orelaterade givare Umeå
Vel+ svag
son
19
Vel–
orelaterade givare Umeå
4
Vel+ svag
dotter
20
Vel–
orelaterade givare Umeå
5
Vel–
syskon givare Umeå
21
Vel–
orelaterade givare Lund
6
Vel–
syskon givare Umeå
22
Vel+
orelaterade givare Umeå
7
Vel–
syskon givare Umeå
23
Vel–
Lund givare
8
Vel+ svag
syskon givare Umeå
24
Vel–
bror 1
9
Vel–
patient med anti–Vel
25
Vel+
bror 2
10
Vel–
patient med anti–Vel
26
Vel+ svag
son
11
Vel–
orelaterade givare Lund
27
Vel+ svag
dotter
12
Vel+
orelaterade givare Umeå
28
Vel–
orelaterade givare Detroit
13
Vel–
orelaterade givare Umeå
29
Vel–
orelaterade givare Minneapolis
14
Vel–
15
Vel–
orelaterade givare Umeå
31
Vel+ svag
orelaterade givare HoustonAnvändaremöte
16
Vel–
orelaterade givare Umeå
32
Vel+ svag
orelaterade givare Lund
DNA från
20givare
Vel–
familjer
orelaterade
Umeå individer,
30
Vel–inkl. 2
orelaterade
givare Minneapolis
Equalis
16 oktober
2014
Vel-uttrycket med flödecytometri på
celler från Lund och Umeå familjer
5
1,2
Dotter 4
Bröder
Son
3 Vel- syskon
Lund
Kontroll
Umeå
Kontroll
(pp celler)
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
SNP analys resultat med
Illumina HumanOmni 2.5M BeadChip
CEP104
LRRC47
CCDC27
DFFB
SMIM1
Chromosome 1
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Kandidatgener
Candidate
AA
(kDa)
Protein product
Function/localisation
CCDC27
656
(75.4)
Coiled-coil domain-containing protein
27
Unknown
SMIM1
78
(8.7)
Uncharacterised protein
Type 1 transmembrane protein
LRRC47
583
(63.4)
Leucine-rich repeat-containing
protein 47
RNA-binding, phenylalanine-tRNA ligase
CEP104
925
(104.4)
Centrosomal protein 104kDa
Centriole; cytoskeleton
DFFB
338
(39.1)
DNA fragmentation factor, 40 kDa,
beta polypeptide
Nucleus, apoptosis factor
CCDC27
SMIM1
LRRC47
CEP104
DFFB
Equalis
Användaremöte
oktober
2014
SMIM1 består av 4 exoner med en
öppen läsram i exon 3 och 4
Icke-kodande
Kodande
SMIM1-mRNA detekterades i:
- perifert blod
- erytroleukemi-cellinjer av KML-natur (t.ex. K562, HEL)
- Primär benmärg från friska frivilliga odlades i erytroid riktning
Equalis
Användaremöte
oktober
2014
Sekvensanalys av SMIM1 i
Vel-negativa individer
 Upptäckte samma 17-bp deletion (c. 64-80) i alla Vel– prover som
sekvenserats hittills (n=43)
– Mest svenskt ursprung men också från bl. a. USA, Israel, England,
Schweiz
– Mutationen ger upphov till ett läsramskifte (förlängs med >500bp)
 mRNA detekteras med qPCR i Vel– individer
– Dock: Inget fångades på 5’- eller 3’-RACE
– Degradering?
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Vad kodar SMIM1 för?
 NCBI = okarakteriserat protein = nytt humant protein!
– Ensembl = ingen proteinprodukt
 Kort typ 1 protein
 Ingen homologi med andra proteiner
– Inga funktionella motiv
 Hög homologi mellan alla däggdjur; 56% homologi i
zebrafisk
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Small integral membrane protein 1
 78 aminosyror
 Type 1 transmembran-
protein
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Polyklonala kanin-antikroppar
 4 peptider syntetiserades mot den extracellulära delen
– Inhiberingsförsök
 Polyklonala antikroppar gjordes mot peptider 1 & 3
– Hög specificitet och sensitivitet i Western blotting
41
A.
Anti-GAPDH
Anti-Peptid 1
1:5000
B.
1:10000
Vel+sv
Vel+
Vel–
Vel–
Vel–
21
15
6,5
1:20000
28
21
15
6,4
27
1:50000
41
Anti-Peptid 1
Vel+
KDa
Std
28
21
15
6,4
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
SMIM1 uttrycksförsök i K562-celler
• cDNA från Vel+ eller Vel–
klonades i uttrycksvektorn
pEF1α-IRES-ZsGreen1
• Transfekterade i K562 celler
• Analyserade med
flödescytometri vid 48 timmar
• Celler analyserade med kanin
anti-peptid 1 i WB
mut. cDNA wt cDNA
Anti-pept. 1
• Resulten räknade som
relative ratio (RR) mot mocktransfektion med töm vektorn
Mock
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
w/w
w/w
m/m
m/m
m/m
w/m
Utveckling av olika metoder för
DNA-screening
m/m
w/m
H2O
m/m
m/m
w/w
w/w
w/w
m/m
w/m
H2O
m/m
w/w
m/m
w/w
A. ASP
w/w
B. RFLP
Kontroll band
Allel-specifik band
Vel+
Vel–
H2O
mutant
m/m
m/m
w/m
w/m
C. GSP
w/w
w/w
wild type
520 Skåne blodgivare testade:
30 heterozygoter
0 homozygot mutant
1/17 heterozygot – frekvens av
Vel–: 1/1250
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
DNA markör
Normal blodgivare
H2O
m/mVatten kontroll
m/m
w/mSc:–1
w/mCo(a–)
C. GSP
w/wVel–
HPA-1a–
w/wYt(a–)
Kp(b–)
Ingår i enkel screening metod för högfrekvens alleler
Vel+
Vel–
493 bp
352 bp
303 bp
266 bp
164 bp
138 bp
Modifierade efter Wagner et al.
Transfusion 2008;48:1169-73
TVÅ nya Vel– blodgivare har hittats i första 1800 blodgivare!
Bekräftade med serologi.
Equalis
Användaremöte
oktober
2014
Relativt ration jämförde med Vel– celler
Korrelation av zygositet med
antigenuttrycket
***
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
B
w/m
w/w
m/m
m/m
n=1
w/m
w/m
n=16
Anti-Vel
w/w
w/w
n=21
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
VEL
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Sammanfattning
 Vi har upptäckt en gen som innehåller en
mutation hittades i alla Vel– prover testade
hittills
 Uttrycksförsök i K562 celler visade att proteinet
på cellytan
 För första gång kan Vel– screenas av en enkelt
genomisk metod
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
May 2013
Equalis
Användaremöte
oktober
2014
På en brusig telefonlinje från
Japan förklarar professor
Martin L. Olsson…
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Andra variationer som påverkar Vel
antigen uttryck
 152 T>A/G
Met51Lys/Arg
Cvejic et al. Nat. Genet 2013;45:542-5
Storry et al. Transfusion 2013;53:40A
van der Schoot et al. Vox Sang 2014;107 (Suppl):16
 Svagare Vel antigen uttryck, bekräftade in vitro
med transfektions försök i HEK-293T celler (van
der Schoot)
 Rs1175550, i SMIM1 intron 2
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
SNP variation i SMIM1 intron 2
- van der Haarst et al, Nature 2012
SMIM1 gene: 3,187bp
C/A
G/A
A/G
C/A
C/A
ChIP-seq Transcription Factor binding sites (ENCODE)
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
qPCR och flödescytometri visar hög
uttryck kopplade till rs1175550G
Relative Quantitation (2 -DDCT)
120%
100%
80%
GGG
AG
A/G
AAA
60%
40%
20%
0%
Relative Mean Fluorescence Intensity
SMIM1 transkript nivåer i blod
120%
Vel antigen uttryck på erytrocyter
100%
80%
60%
40%
20%
R2=0.6366, n= 141
0%
GG
AG
AA
 rs1175550G => högst transkript nivå och anti-Vel reaktivitet
 rs1175550A => lågst transkript nivå och anti-Vel reaktivitet
 63% av variationen i anti-Vel reaktivitet kopplade till rs1175550G
(i prover utan 17-bp deletionen)
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
På gång i labbet…
Kliniken:
 Fortsätta screena…
Forskningslabbet:
 Titta närmare på polymorfismer i intron 2 som påverkar
Vel-antigenets uttryck (MKC)
 Utreda transmembran GXXXG-motivets roll och
extracellulära cysteiner (AN bl.a.)
 Uttrycka löslig Vel för struktur-bedömning/
inhibitionsmedel
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Varför bryr vi oss om Vel?
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Fallbeskrivning
 Antikroppsscreen reagerar positivt på 72-årig kvinna
(B RhD neg) inkom för planerad operation
 Tidigare utredd på annat regionsjukhus i samband med
ortopediskt trauma för ~8 år sedan
 Det tidigare serologiska mönstret tolkades som AIHA:
– DAT-positiv
– Egna celler reaktiva
– Hemolys med papainbehandlade celler
 Patienten har aldrig fått blod
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Fallbeskrivning
Pågående utredning:
 Stark reaktivitet med papainbehandlade celler i gel
– Egna celler negativa
 8 av 9 panelceller reaktiva med gel-IAT
– Reaktivitet från +w till 2+
– Egna celler negativa
 Myntrullar i koksalt-rörmetod i 4oC och RT
 DAT var negativ
 6 av 10 erytrocytenheter förenliga i gel-IAT
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
AK-identifiering panel
D
C
E
c
e
M
N
S
s
P
K
1
k
Fya
Fyb
Jka
Jkb
Gel
IAT
Pap37C
1
+
+
+
+
+
+
0
+
0
0
0
+
0
+
+
+
2+
3+
2
0
0
0
+
+
+
0
0
+
+
+
0
+
+
0
+
2+
3+
3
0
+
0
+
+
+
0
0
+
0
0
+
+
0
+
+
1+
3+
4
0
0
+
+
+
+
0
+
+
+
0
+
0
+
+
0
2+
3+
5
+
+
0
0
+
+
+
0
+
+
0
+
+
0
+
0
2+
3+
6
+
0
+
+
0
0
+
0
+
+
0
+
+
+
0
+
1+sv
3+
7
0
0
0
+
+
+
0
+
+
0
+
+
0
+
+
+
1+sv
3+
8
+
0
0
+
+
0
+
0
+
+
0
+
+
+
0
+
0
3+
9
0
0
0
+
+
0
+
0
+
+
+
+
+
0
+
0
1+sv
3+
0
0
Egna
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Vidare utredning
 Papain autoadsorbering gav ingen effekt, dvs
kvarstående positiva reaktioner
– Gjort baserat på tidigare undersökning
 Ingen inhibering med poolad plasma
– AK8 känd som Rg- och Kn(a-)
 Operationen påbörjades, trots icke slutförd ak-utredning,
med relativt lågt Hb
– kirurgi med liten risk för blödning
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Vidare utredning
Enzym- och DTT-behandlade celler:
Gel-IAT
Papain
3+
Trypsin
3+
α-chymotrypsin
2+
Pronas
4+
200mM DTT
1+w
?
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Enzymtolkning
Papain
Trypsin
-ct
Pronas
DTT
Möjligt specificitet
0
0
0
0
+
Ch/Rg, Xga
0
0
0
0
0
In, JMH
0
0
+
0
+
MN, EnaTS, Ge2, Ge4
0/+
+
0
0
+
‘N’, Ss, Fya/Fyb, Fy6
0/+
+
0
0
0
Yta
0
+
+
0
+
EnaFS
+
0
0
0
+w
Lu, MER2
+
0
0
+
+w
Knops
+
+
+
+
0
Kell
+
+
+
+w/0
0
Sc
+
0
+w
0
0
Do, Ge3
+
+
0
0
0
Cromer,
+
+
+w
0
0
LW
+
+
+
+
+
Jk3, Fy3, Dib ,Coa, Ge3; Oka, P, LKE, Ata,
Csa, Emm, Era, Jra, Lan, Vel, PEL
+
+
+
+
++
Kx
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Reid, Lomas Francis & Olsson: The blood group antigen factsbook 3rd ed. 2012 Academic Press
Patienten transfunderades…
 Postop dag 1: patienten drabbades av hjärtinfarkt
– Transfusion påbörjades med en av de korstestnegativa
enheterna
 Efter ~50 mL reagerade patienten med frossa och
kräkning
 Transfusionen avbröts och prover skickades till labbet
Serologisk mönster tillsammans med kliniska reaktionen
ser ut som misstänkt anti-Vel?
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Varför anti-Vel?
Tankar i efterhand…
 Patientens plasma svagare med DTT-behandlade celler
 Rainer T. et al. The effects of dithiothreitol-treated red
blood cells with anti-Vel. Transfusion 2004;44:122A
(Suppl.)
– 4/10 anti-Vel visade försvagade reaktioner mot
DTT-behandlade celler
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Bekräftat i Lund: flera anti-Vel reagerar
svagare med DTT-behandlade celler
I Lund:
Ej behandlade
DTT-behandlade
Vel+, K-
Vel-, K+
Vel-, K-
Vel+, K-
Vel-, K+
Vel-, K-
1.Vel + K
3+
2+
0
3+
0
0
2.Vel
3+
0
0
2+
0
0
3.Vel + K
1+
3+
0
0
1+
0
4.Vel
2+
0
0
2+
0
0
5.Vel
3+
0
0
1+w
0
0
Antikropp
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Fortsatt undersökning
 Patientens celler typades som Vel-neg
 Plasman var förenlig med 3 Vel-neg testerytrocyter
 Antikroppar mot HLA-antigener också påvisbara
 Trots tillgång på fruset kompatibelt blod, nekade
patienten ytterligare transfusioner
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Sammanfattning
Utredningen visade ett svårtolkat mönster:
 Vel-antigenuttrycket på våra panelceller varierar
 Antikropp reagerade från RT till 37oC
– Var det verkligen myntrullar?
 Fanns anti-Vel även vid 1:a undersökningen?
 Vel-antigen kan påverkas av DTT-behandling
 Anti-Vel är en lömsk serologisk specificitet som kan ge
svåra transfusions-komplikationer om den inte upptäcks
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Varierar Vel-uttrycket så mycket som
visats på den första panel?
D
C
E
c
e
M
N
S
s
P
K
1
k
Fya
Fyb
Jka
Jkb
Pt
Känd
antiVel
1
+
+
+
+
+
+
0
+
0
0
0
+
0
+
+
+
2+
3+
2
0
0
0
+
+
+
0
0
+
+
+
0
+
+
0
+
2+
3+
3
0
+
0
+
+
+
0
0
+
0
0
+
+
0
+
+
1+
2+
4
0
0
+
+
+
+
0
+
+
+
0
+
0
+
+
0
2+
2+st
5
+
+
0
0
+
+
+
0
+
+
0
+
+
0
+
0
2+
2+
6
+
0
+
+
0
0
+
0
+
+
0
+
+
+
0
+
1+sv
2+
7
0
0
0
+
+
+
0
+
+
0
+
+
0
+
+
+
1+sv
2+st
8
+
0
0
+
+
0
+
0
+
+
0
+
+
+
0
+
0
1+
9
0
0
0
+
+
0
+
0
+
+
+
+
+
0
+
0
1+sv
2+
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
En av ARDPs mest efterfrågade
fenotyper
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Aktuell blodgruppsklassificering 2014
342 antigener
303
ABO
P1PK
Lewis
FORS
GLOB
H
I
LW
Xg
Duffy
Lutheran
Indian
Scianna
Raph
JMH
Oka
39 ”orphans”
Högfrekvens
Kollektioner
Lågfrekvens
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014
Tack…
Samarbetspartners:
Blodgruppen, Lund
Johan Malmström, Lund
Joyce Poole, Bristol
Jan Hamilton, Detroit
Hein Hustinx, Bern
Vered Yahalom, Tel Aviv
Er… för att ni lyssnade!
ALF
Equalis
Användaremöte
16 oktober
2014