DNA isolering från faeces

DNA isolering från faeces
Liselotte Onelöv, sjukhuskemist
Klinisk Kemi, Karolinska Universitetslaboratoriet, Stockholm
Humant DNA i faeces
Finns det?
Främst från epitelceller
Bakgrund av mikrobiellt DNA
DNA degraderas och efterföljande reaktioner inhiberas av
polysackarider, billirubin och gallsalter
2 DNA isolering från faeces
Upparbetning av faeces
Helt automatiserat på en robot från Tecan
Protokoll 1
Protokoll 2
ca 400 mg
ca 400 mg
späds i ca 4 ml buffert
500 uL PBS
sonikeras med ultraljud
sonikeras med ultraljud
ta 100 uL + 130 uL lysis buffer
inkubera 65C (inkubera 95C)
centrifugeras
3 DNA isolering från faeces
centrifugeras
Protokoll 1: QIAamp DNA Stool
1. Lysering i ASL buffert
2. Störande/nedbrytande ämnen adsorberas till
InhibitEX matrix
3. DNA isoleras på QIAamp Mini spin columns
4. Konc.bestämning på NanoDrop
4 DNA isolering från faeces
För efterföljande analys
Rekommendation från tillverkaren:
1. Tillsätt BSA 0,1 ug/ul i efterföljande PCR
2. Använd HotStart polymeras för att öka specificiteten (liten
andel humant DNA)
Inget av detta har vi gjort vid våra genotypningar men ändå har vi
fått tydliga resultat
5 DNA isolering från faeces
Protokoll 2: MagNA Pure LC DNA
Isolation Kit III (Bacteria, Fungi)
1. DNA isoleras via magnetkulor på MagNA Pure
2. Konc.bestämning på NanoDrop
6 DNA isolering från faeces
Erhållet DNA
Metod
Prov
mängd
kvot
Metod
Prov
mängd
kvot
Qiagen
F1
30
1,8
Roche
1A
42
1,57
F2
185
1,7
1B
29
1,44
F3
30
1,9
2A
55
1,77
F4
180
2,2
2B
59
1,81
7 DNA isolering från faeces
Genotypning
Metodik
Qiagen
Roche
Smältpunktsanalys (FV)
G/G samt G/A
-
Alleldiskriminering (LCT)
C/C samt C/T
Fungerar ej
8 DNA isolering från faeces
Slutsats
Protokoll från Qiagen fungerar bäst i våra händer.
DNA som går att amplifiera erhålls.
9 DNA isolering från faeces
Metoden finns – finns det intresse?
10 DNA isolering från faeces
Vad vi egentligen tänkt göra
Användbart vid coloncancer?
-KRAS, BRAF, PIK3CA* Array (Randox)
-KRAS Strip Assay (ViennaLab)
Isolera DNA från plasma?
-Metylerat Septin 9 (Abbott)
-KRAS, BRAF, PIK3CA* Array (Randox)
-KRAS Strip Assay (ViennaLab)
11 DNA isolering från faeces
Tack!
Aleksandra Mandic-Havelka
upparbetning av faeces
Raha Riazi mfl
genotypning med
smältpunktsbestämning
Mikaela Bodell-Davoody
Christin Sisowath
DNA isolering på MagNaPure
samt genotypning med TaqMan
prober
12 DNA isolering från faeces