Flöden och drivkrafter Kontinuitetsekvationen Tidig metod för affinitetsbestämning: jämviktsdialys Koncentrationen av FRI ligand lika i de båda utrymmena! Ur detta, samt ursprungskoncentrationen av protein och ligand, kan man beräkna hur mycket ligand som bundits upp av proteinet, och därmed hur stark bindningskonstanten är (grovt uppskattat). Men vad händer om vi tar bort membranet och låter komponenterna flöda fritt? Följande ekvationer ger oss möjlighet att skapa analytiska uttryck för diffusion: Ficks första lag: Vilket kan formuleras om som: Och som tillsammans med Ficks första lag ger Ficks Andra Lag: ’Drunken Sailor-model’ Hur kan vi använda detta analytiskt? • Det är besvärligt att analysera ett spontant flöde kvantitativt: lättstört (vibrationer mm), gravitationen påverkar, olika tidsskalor etc • Vi behöver applicera en yttre kraft på flödet så att vi kan experimentera reproducerbart! Vi kan applicera ett elektriskt fält! I fältet drivs molekylernas migration av spänningsskillnaden och molekylerna kommer att migrera beroende på sin laddning: motkraften är friktionen gånger hastigheten på förflyttningen. SDS-PAGE, agarosgeler mm är diffusion av molekyler som drivs av en kraft. I en SDS-page gel får alla proteiner en negativ laddning proportionell mot storleken genom association med SDS. I en agarosgel är alla DNA negativt laddade. Isoelektrisk fokussering •En pH-gradient används som drivande kraft. •Då proteinet är oladdat upphör migrationen. Vi kan använda en stark centrifugalkraft för att separera olika molekyler preparativt. Kan vi använda centrifugalkraften som drivkraft för att analysera molekylers massa? Vi behöver se hur fort någonting sedimenterar för att bestämma sedimentationskoefficienten! Om vi börjar med en kyvett med homogen koncentration, vad händer när vi centrifugerar? Analytical Ultracentrifugation (AUC) Studies of Phage ϕ29 Protein p6 Binding to DNA Två komponenter: 11 kDa protein samt 170 kDa DNA. Vilken är vilken? Vad ser vi? (körningarna gjordes vid 42,000 rpm) Men vad händer när jämvikt bildas? Phage ϕ29 Protein p6 Binding to DNA – cont’d Vad ser vi här, och varför? Övre/undre figuren? Fortfarande har vi samma komponenter i systemet! Interaktionsstudier med AUC Även svaga bindningar kan studeras om bara koncentrationer kan uppnås där komplexet bildas stabilt. Interaktionsstudier med AUC Vilka komplex bildas: KID, KIX, TAX? Hur sitter KIX-KID-TAX ihop? Sammanfattning: • Flödestekniker kräver drivkraft för att vara analytiskt tillämpliga • AUC: höga massor, generell metod • Matematiskt och fysiskt rigorösa tolkningsmodeller krävs • Massor och komplexbildning kan analyseras Flöden och reaktioner • Hur kan vi mixa reaktanter för att studera snabba reaktioner som funktion av tid? • Vilka tekniska hänsyn måste vi ta? • Vad kan vi studera? • Hur kan vi koppla ihop det med tekniker vi redan kan? Continuous flow Vilka nackdelar har metoden? Stopped-flow Hur fungerar denna metod i jämförelse m CF? Vilka fördelar/nackdelar har metoden? Vilket fel har denna figur som representant för Stopped Flow? Quenched-flow Vissa reaktioner kan inte mätas spektroskopiskt utan behöver analyseras batchvis vid olika tidsdelayer. Quenched-flow för multireaktant-reaktioner Hur snabbt veckar sig ett protein? Vilken roll spelar proliner i folding? Vilken roll spelar proliner i folding? Prolin – till - Alanin-mutationer Stopped/quenced flow: sammanfattning • Mängder av tillämpningar, begränsas bara av detektionssätten! • Medger mångsidig design av experiment • Tekniskt och molekylärt pilligt…. • ….men någorlunda enkelt att tolka • Folding, reaktionskinetik, snabba processer