Innehåll
• Allmän orientering
Prokaryot genexpression
• Transkriptionsreglering
• Produktionsstrategier
28/10-2008
• Chaperon/foldassystem
• Metabolbelastning
• Problem och lösningar
Centrala dogmat
Biologiska system för proteinexpression
replikation
• Escherichia coli
• Bacillus subtilis
• Saccharomyces
cerevisiae (jäst)
• Insektsceller
• Däggdjursceller
• Växtceller
DNA
transkription
RNA
translation
posttranslationella
Protein
• Transformationsmetoder
- CaCl2 + värme
- elektroporering
- ”gene-gun”
- virusmedierade
- liposomer
Funktionellt protein
förändringar
Modifiering av genexpression
Transkription
Genetiska strategier
Medel:
Att ta hänsyn till:
- promotorer
- terminatorer
- RBS-styrka
- antal genkopior
- genfusioner
- gensekvens (codon usage)
- etc
- transkription
- translation
- lokalisering
- proteinstabilitet
- metabola förhållanden
- reningsprocess etc
1. Initiering: RNA-polymeras binder promotor,
strukturella förändringar hos promotorpolymeraskomplexet (”bubbla”), initial
transkription
2. Elongering: konformationsförändringar (håller
hårdare om templatet), uppvindning av DNAt,
RNA-syntes, ”proof-reading”
3. Terminering: Rho-oberoende terminatorer
(inneboende terminatorer = hårnålsstrukturer),
Rho-beroende terminatorer
1
Transkription
Termination of transcription (E. coli)
Promoter
RNA polymeras: 2´+ (ca 465 kDa)
- sigmafaktorn påverkar DNA-bindande egenskaperna
hos polymeraset
- bindningsstyrkan till olika promotorer kan skilja 106 x
- transkription initieras utan primer
RNA polymerase
DNA
RNA
”Hairpin”
termination signal
5´
Promotor (consensus):
(-35)
TTGACA 16-19 bp
5´
(-10)
TATAAT 5-9 bp
Other mechanism:
Termination via
Rho protein (hexamer)
Pause-site
Rho
Promotorer
Promoter (Escherichia coli)
Start of
RNA
synthesis
• Startsignaler för RNA-syntes
-35
• Stark promotor: hög affinitet för RNA-polymeras
Start of
coding
sequence
-10
CCGGTTGACAGATAGTCGTGTATGCGATATAATCAGCCCGTAGTCGGAGGGTCCTGACATG…
GGCCAACTGTCTATCAGCACATACGCTATATTAGTCGGGCATCAGCCTCCCAGGACTGTAC…
"Pribnow box"
• Konstitutionell promotor: alltid påslagen
+ proteinproduktion
- cellen mår inte bra; borde växa till först
- energiförluster
- plasmidinstabilitet
P
Gene for protein
5´
Produced mRNA molecule
• Reglerbar promotor: går att slå på och stänga av
+ proteinproduktion bara under en viss fas av cellcykeln,
eller bara under en viss tid
Translation
Transkriptionsreglering
Sigmafaktorer () i E. coli
• Skiljer på positiv och negativ reglering
Gene
Factor
Use
-35
sep
-10
rpoD
70
general
TTGACA
16-19 bp
TATAAT
rpoH
32
heat shock
CCCTTGAA
13-15 bp
CCCGATNT
rpoN
54
N-metabolism
CTGGNA
6 bp
TTGCA
motility/chemotaxis
CTAAA
15 bp
GCCGATAA
fliA
28
( F )
rpoE
E
heat shock
rpoS
S
stress response
• Positiv reglering: transkriptionsfaktor (aktivator) måste binda in
till promotorn för att transkription skall ske
- hjälper RNA-polymeras att binda till DNAt (rekrytering)
- allosterisk verkan av steg efter polymerasinbindning
• Negativ reglering:repressorprotein binder till operator och
hindrar transkription
- hindrar RNA-polymeras att binda till promotorn
- alternativt håller kvar RNA-polymeraset
2
Vanligt använda promotorer
Genreglering efter transkriptionsinitiering
• Prematur transkriptionsterminering s.k. attenuering; ex. trp
• antiterminering = en typ av positiv transkriptionsreglering vid
vilken transkripionsfaktorer (proteiner) binder till RNApolymeras och modifierar det så att det kan läsa igenom
speciella termineringssites
- används av fager och i vissa operon
Promotor
Induktionsmedela
lac
tac
-35 trp -10 lac
trc
trp
T7
PL ()
lac(TS)
PSPA
IPTG
IPTG
IPTG
Trp-svält/-IAA
IPTG
Värme
Värme
Konstitutiv
Ett urval av promotorer använda för hög proteinexpression i E. coli
amest använda metod för inducering.
Förkortningar: SPA, Staphylococcus aureus protein A;
IPTG, isopropyl--D-thiogalactopyranoside; -IAA, -indolakrylsyra.
Test av promotorstyrka
His6ABPGFP
Reglering av laktos-operonet (E. coli)
Catabolite
Activator
Protein
(CAP)
Promotor
-35
CAP
-10
Lac I
S.D.
5´
mRNA
Lac I
mRNA-start
RNA-pol.
-35
DNA
-10
Lac Z
Lac I
T7
Trc
LacUV5
Cykliskt
Promotor=
AMP ”Landningsplats” för
(cAMP)
RNA-polymeras
cAMP/CAPbindningsställe
Operatorsekvens
S.D.
5´
3´
Lac Y
S.D.
Lac Z
Lac A
mRNA
S.D.
Lac Y
Lac A
3´
SPA
Lac-repressor
(Lac I)
Negative
control
-galaktosidas:
Spjälkar laktos till
galaktos och glukos
Laktos eller
IPTG
(syntetisk analog)
Laktos-permeas:
Reglerar införsel
av laktos
Thio-galaktosid-acetylas:
Bryter ned
ej klyvbara laktos-analoger
Frånvaro av laktos:
• Lac-repressorn binder till operator-sekvensen
• Transkriptionen blockeras; inget -galaktosidas-enzym (eller något av de andra enzymerna) produceras
Närvaro av laktos (eller IPTG):
• Lac-repressorn kan inte binda till operator-sekvensen
• Transkriptionsker; -galaktosidas-enzym (och alla de andra enzymerna) produceras
Fluorescence intensity
Red = T7
Green = Trc
Blue = LacUV5
Närvaro av laktos (eller IPTG) samt låga halter av glukos:
• Halten av cAMP stiger
• cAMP-CAP-komplex bildas som kan binda uppströms om promotorn
• cAMP-CAP-komplex främjar transkriptionen (vägleder RNA-polymeraset)
• Mer -galaktosidas-enzym produceras
Yellow = SPA
H. Tegel, unpublished
T7-systemet och PL
T7-systemet
Trp
repressor
Trp-operonet
Lac-promotor
operator
trpL
trpE trpD trpC trpB trpA
promotor
Tryptofan-svält
LacT7 RNAoperator polymerasgen
T7-promotor
gen
mRNA
mRNA
repressor
trpL
T7 RNA-polymeras
trpE trpD trpC trpB trpA
mRNA
PL-promotorn
repressorprotein från bakteriofag Odling 28-30°C aktiv repressor
Inducering 42 °C inaktiv repressor ger genexpression
3
Transcription: regulation
Translation
Amino acid
• Promoter strength:
- degree of ”consensus” sequence
• Sigma factor availability:
- growth condition dependent
• Positive/negative regulation
• Enhancer/silencer regions
Ribosome
Transfer RNA (tRNA)
Anticodon loop
5’
3’
mRNA
Translation
COOH
NH2
Protein
Translationsmaskineriet
•
•
•
•
•
•
•
mRNA
tRNA
aminoacyl tRNA syntetaser
ribosomen
IF-1, IF-2, IF-3
EF (EF-Tu, EF-G)
RF
Bacterial 16S RNA (T. thermophilus)
Translationsinitiering
• RBS-sekvensberoende
UAAGGAGG mRNA
AUUCCUCC 16S-RNA
• Avstånd RBS-ATG
• Sekundärstruktur hos mRNAt
• ”Codon usage”
Formation of the translation initiation complex
Bacteria
N-formylmethionine (fMet)
Always the first aminoacid
in bacterial proteins
fMet
Initiation
factors (IF)
Specific tRNA for
N-formylmethionine
IF1
tRNAf
S.D.
5´
AUG
30S
IF2
IF3
+ GTP
mRNA
Peptidyl
Exit (E) (P) site
site
30S initiation complex
Aminoacyl
(A) site
fMet
50S
mRNA binding (to S.D. sequence)
5´
AUG
30S
XXX
mRNA
Next codon to
be translated
70S initiation complex
4
Elongation phase of translation
3-5 aa/sec
100-200 aa in 1 min
30 000 aa (titin protein in muscles) in 2-3 h
(Bacteria: ca. 15-20 aa/sec)
C
A
B
Critical moment for insertion
of the correct amino acid
Termination phase of translation
A
C
One of the three
STOP codons
D
B
D
"Slow" GTP cleavage assures that
only the correct tRNA is allowed to
stay and deliver its amino acid
Translation: Regulation
Prokaryota expressionsvärdar
• Position and sequence of Shine-Dalgarno sequence
• Codon usage
- Different codons for the same aminoacid are read with different
efficiences
• mRNA binding proteins
- Proteins bind to SD sequence and block ribosomal binding
• Antisense regulation
- "Mirror image" of mRNA binds complementary to mRNA and
prevents translation
• Stability of mRNA against degradation
• RNA interference (RNAi)
micro RNA (miRNA)
silencing RNA (siRNA)
• Escherichia coli
- Gram-negativ stav
- rörlig
- ickepatogen
- generationstid ca 25 min
- genetiskt och fysiologiskt karaktäriserad
- många specialstammar tillgängliga
Nobelprize in Medicine 2006 to
Andrew Fire and Craig Mello
Prokaryota expressionsvärdar
• E. coli-promotorer fungerar i de flesta Gram-negativa
bakterier. ”Universalplasmider” kan användas.
• Salmonella spp., Cholera spp., Shigella spp. m.fl.
används bl.a. i vaccinforskning p.g.a immunogena
egenskaper
• Bacillus spp.- hög proteasaktivitet vilket ofta skapar
problem
• Coryonebacterium glutamicum
• Trichoderma reesei
• Pseudomonas spp.
• Staphylococcus spp.
• Streptococcus spp.
Produktionsstrategier
Extracellulär sekretion
Periplasmatiskt
Intracellulärt, lösligt
Intracellulärt, olösligt
Ytexpression
5
Intracellulära proteiner
Sekreterade proteiner
Lösliga
Inget behov av solubilisering och refolding
Löslighetsförhöjande fusionspartners
Thioredoxin
MBP
Kan vara skadliga för cellen
Proteolys
Komplex rening
• Extracellulärt
- signalpeptid behövs
- enklare rening
- inte alla proteiner är sekretionskomp.
• Periplasmatiskt
- signalpeptid behövs
- disulfidbindningar möjliga
- proteolysproblem
- osmotisk chock
Inklusionskroppar
Hög produktion
Lätta att isolera
Skyddar mot proteolys
Solubilisering och refolding krävs
Ytexpression
Cytoplasmic chaperones
Family
Name
Function
Substrate specificity
Hsp100
Clp
Disaggregase
Regions rich in aromatic and
bacic aa
Hsp90
HtpG
Folding/secretory
chap.?
Unknown
+
Hsp70
DnaK
DnaJ, GrpE
Folding chaperone
+
• Gram+ bakterier:
- cellväggs’ankare’, ex. SpA
Segm. of four to five
hydrophobic aa, enriched in
leucine and flanked by basic
residues
Hsp60
GroEL
GroES
Folding chap.
/ folds enriched in
hudrophobic and basic
residues
+
Hp33
Hsp33
Holding chap.
Unknown
-
• Bibliotek för screening
- slumpmässiga DNA-snuttar i OmpA-gen
DJ-1
superfam.
Hsp31
Holding chap.
Unknown
-
Small
Hsps
IbpA, IbpB
Holding chap.
Unknown
-
PPIase
TF
Hold. chap., PPIase
Eight aa motif enriched in
aromatic and basic residues
-
SecB
SecB
Secretory chap.
Nine aa motif enriched in
aromatic and basic residues
-
• Gram- bakterier:
- fusioner till bakteriella
yttermembranproteiner, ex. OmpA
• Vaccinapplikationer
- immunogena peptider/proteiner
Chaperone-assisted protein folding (cytoplasm)
Cofactors
ATP
requirement
+
Periplasmic chaperones
Classification
Protein
Substrates
Generic chaperones
Skp (OmpH)
FkpA
Outer membr. proteins and misfolded periplasmic
proteins
Broad substrate range
Specialized chap.
SurA
LolA
PapD
FimC
Outer membrane proteins
Outer membrane lipoproteins
Proteins involved in P Pili biosynthesis
Proteins involved in type 1 pili biosynthesis
PPIases
SurA
PpiD
FkpA
PpiA
Outer membrane beta-barrel proteins
Outer membrane beta-barrel proteins
Broad substrate range
Unknown
Proteins involved in
disulfide bond formation
DsbA
DsbB
DsbC
DsbG
DsbD
DsbE (CcmG)
CcmH
Reduces cell-envelope proteins
Reduces DsbA
Proteins with nonnative disulfides
Proteins with nonnative disulfides
Oxidised DsbC, DsbG and CcmG
Cytochrome c biogenesis
Cytochrome c biogenesis
Baneyx F et al, Nature Biotechnology (2004), 22: 1399-1407
6
Export and periplasmic folding pathways
E. coli: periplasm
Folding in the bacterial periplasm: protein disulphide-isomerases
• DsbA, a generic dithiol oxidase in the periplasm of E. coli
Baneyx F et al, Nature Biotechnology (2004), 22: 1399-1407
E. coli: periplasm
E. coli: periplasm
Folding in the bacterial periplasm: protein disulphide-isomerases
Folding in the bacterial periplasma: peptidyl-prolyl cis/trans-isomerases
•
•
•
•
DsbC catalyzes disulphide bond exchange reactions
polypeptide bonds are synthesized in trans configuration
5% cis peptidyl-prolyl bonds in native proteins
Ea = 20 kcal/mol for peptidylprolyl-isomerisation
Rate-determining step of protein folding
Metabol belastning
Vad händer med cellen?
• Plasmider med högt kopieantal
• Celltillväxt minskar
• Syrebegränsning
• Form och storlek förändras
• Överproduktion av främmande proteiner tär på
lagret av tRNA
• Stress-respons. Proteaser tillverkas
• Exportmaskineriet blockeras. Export av värdcellens
egna proteiner hindras
• Förändrade metabola egenskaper i vissa stammar
försämrar
• Minskad tillförlitlighet i DNA-proof reading
• Fel aminosyra sätts in om något tRNA
eller någon aminosyra är begränsad
• Främmande proteiner kan störa cellen. Ev. toxiska
egenskaper hos målproteinet
7
Syrebegränsning
Plasmider - en börda för cellen
•
Långsammare tillväxt och ändrad
metabolism vid syrebegränsning
•
Stressrespons aktiveras. Proteaser
tillverkas
•
Plasmider spottas ut
•
Strategi: plasmidkodat protein som
behövs för överlevnad i cellkulturen
•
Kräver tillsats av antibiotika eller
nödvändig metabolit (dyrt och i
många fall oönskat)
•
Risk med plasmider för överförande
av genetiskt material
•
Lösning: DNA-integration i
värdkromosom
Åtgärder:
•
•
Proteasnegativa stammar ger
minskad nedbrytning, men felaktiga
proteiner kan ej brytas ner
Uttryck av bakteriellt hemoglobin för
intracellulär O2-bindning
Minskning av metabol belastning
• Common problems • Solutions
- protein aggregation
- decreased synthesis rate
•
Använda andra kodon
•
Promotorer som är reglerbara
och inte ’läcker’
•
Minskad produktionsnivå kan
i många fall ge högre celltäthet
- protein misfolding
- inactive protein
Effect of co-expression of GroEL/ES
DH5alpha/11b-HSD1-eGFP
0h
2h
4h
Heterologous protein expression in E. coli
(weaker promoter, reduce conc. of inducer, low
temperature)
- co-expression of folding
modulators
- fusion tags
- protein engineering of target
- host engineering
Effect of co-expression of GroEL/ES
DH5alpha/11b-HSD1-eGFP/GroELES
0h
2h
4h
time: 4 h
DH5alpha/11b-HSD1-eGFP
DH5alpha/11b-HSD1-eGFP/GroELES
8
