UMEÅ UNIVERSITET
Institutionen för molekylärbiologi
2011-01-11
RUT10 - Biomedicinsk vetenskap I
MIKROBIOLOGISK LABORATIONSTEKNIK
Målsättning
Att introducera mikrobiologisk metodik för handhavande av renkulturer. Laborationen
skall demonstrera sterilteknik för att:
a) skydda en renkultur från kontaminering utifrån samt
b) skydda omgivningen för mikroorganismer.
Olika steriliseringsmetoder såsom termisk behandling, kemisk behandling,
sterilfiltrering och UV-bestrålning kommer att jämföras och utvärderas. Vidare skall
spädningsförfaranden och överföring av mikroorganismer från vätskekulturer till fast
substrat, liksom bildning av encellskolonier demonstreras och tränas. Skillnader i
temperaturkänslighet mellan vegetativa celler och sporer skall påvisas.
Bakgrund
Sterilitet definieras inom mikrobiologin som fullständig avsaknad av reproducerbart liv.
Val av olika steriliseringsmetoder styrs av vad som behandlas och vad det behandlade
ska användas till. Termisk behandling i värmeskåp eller autoklav ger sterilitet genom att
proteiner, t.ex. enzymer, denatureras, vilket medför att bakteriecellen dör. Metoden är
lämplig för glasvaror etc och för värmetåliga lösningar. Kemisk behandling medför
oftast inte sterilitet, utan snarare desinfektion, dvs. minskat antal patogena
mikroorganismer. Olika kemikalier påverkar viktiga komponenter i bakteriecellen som
membraner (sprit, aceton etc.) och proteiner (jod, klor m.fl.). Om kemikalien tillförs
t.ex. en lösning som ska desinficeras kommer lösningen att efter behandlingen
fortfarande innehåller kemikalien. Metoden är alltså oftast inte lämplig för födoämnen
eller mediciner, men desto mer användbar för sår- och annan ytbehandling.
Sterilfiltrering är en metod att mekaniskt skilja bakterier och virus från en lösning med
hjälp av filter med noggrant bestämda porstorlekar. Detta är en lämplig metod för
värmekänsliga lösningar. Bestrålning, t.ex. med UV-ljus, som påverkar cellens DNA
och ger vid viss dos tillräckligt stora skador för att leda till celldöd. Används för
desinfektion av operationssalar och andra lokaler med stora krav på bakteriefri miljö.
Bakterier
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Serratia marcescens
Materiel
Övernattskultur av E. coli i 5 ml LB
TYS-plattor
0,15 M steril NaCl
Sterila rör (15 ml)
1 ml pipetter, sterila
10 ml pipetter, sterila
Petriskål
Sterilfilter
Rör med desinfektionsmedel
Termometer 20-110°C
Sterila eppendorfrör
Plastplatinöser
Spruta, 5 ml
24 st
100 ml
1 st
1 st
3-5 st
1 förp.
1 st
A. DEMONSTRATION AV NÅGRA STERILISERINGSMETODER
1) Enkel termisk behandling
Försöket avser att visa hur bakteriers överlevnadsförmåga påverkas av inkubation vid höga
temperaturer. En övernattskultur av E. coli utdelas. Ett utstryk av denna kultur (-tid 0) görs
m.h.a en plastplatinös på en TYS-platta, vars undersida markerats med 7 streck (Fig 1).
Ett eppendorfrör placeras i ett värmeblock, termostaterat vid 80°C, och förvärmes i 10
minuter. 0.5 ml av kulturen överföres till det förvärmda röret. Efter 30, 60, 90, 120, 180 och
240 sekunder i 80°C görs ett utstryk med plastplatinös på TYS-plattan. Försöket upprepas
med den variationen att cellerna inkuberas i värmeblock vid 100°C. Kom ihåg att markera
plattorna med gruppnummer, laborationsnummer och datum. Plattorna inkuberas upp- och
nervända vid 37°C över natt. Notera på resultatbladet hur den termiska behandlingen påverkat
tillväxten.
2
2) Kemisk behandling
I detta experiment skall olika desinfektionsmedels inverkan på E. coli undersökas. En
övernattskultur av E. coli utdelas.
Grupp
1-12
13-23
24-34
Desinfektionsmedel
Desivon
Handdisk
Etanol
Rör A
100
100
100
Koncentration (%)
Rör B
50
50
50
Rör C
10
10
10
Rör K: 0,1 ml av övernattskulturen späds med 0,9 ml steril 0,15 M NaCl (=kontrollen).
Rör A-C: till tre sterila rör med 0,9 ml desinfektionsmedel av ovan nämnda koncentrationer
sätts 0,1 ml av övernattskulturen. Efter 1, 3, 5, 10 och 15 minuters inkubation i rumstemperatur
görs utstryk med en plastplatinös av respektive cellsuspensioner på TYS-plattor markerade A-C
enligt exempel i Figur 2. Märk plattorna! Observera att ett utstryk från rör K (tid = 0) görs på
samtliga plattor. Plattorna inkuberas upp- och nervända vid 37°C över natt. Notera i
resultatbladet hur desinfektionsmedlet påverkat cellerna.
3) Sterilfiltrering
0,1 ml av övernattskulturen av E. coli spädes med 10 ml steril 0,15 M NaCl. 5 ml av den
spädda kulturen filtreras genom ett sterilfilter. Filtratet samlas upp i sterilt rör. Med en
plastplatinös görs ett utstryk av dels den ofiltrerade, dels den filtrerade cell-suspensionen på
vardera halvan av en TYS-platta. Markera på plattan. Inkubera plattan vid 37°C över natt.
Notera effekten av filtreringen på resultatbladet.
3
4) UV-bestrålning
0,1 ml av övernattskulturen av E. coli spädes med 10 ml steril 0,15 M NaCl och hälls i en
steril petriskål. Locket tas av och skålen placeras på ett plattställ 18 cm från UV-lampan i ett
UV-skåp (förvärmt 10 min). Efter 0, 30, 60, 90, 180 och 240 sekunders UV-bestrålning görs
ett utstryk med en plastplatinös på en TYS-platta. Skydda ögonen mot UV-bestrålning!
Inkubera plattan vid 37°C över natt. Notera effekten av bestrålningen på resultatbladet.
B. SPORERS TEMPERATURRESISTENS
Bakgrund
Bakterier tillhörande familjen Bacillaceae har ett försvarssystem som utnyttjas när
bakteriecellens miljö blir för näringsfattig eller på annat sätt ogästvänlig. Från en bakteriecell
bildas då en spor, som när miljön förbättras kan gro till en vegetativ cell igen. Sporbildning
hos bakterier är alltså inte någon förökningsmekanism som hos svamparna. En aktivt växande
bakteriekultur innehåller till största delen vegetativt växande celler och endast ett litet antal
sporer. Andelen sporer i population ökar kraftigt då kulturer övergår till stationär fas.
Bakteriesporer har en mycket låg vattenhalt och ett till stor del ändrat innehåll av
småmolekyler och makromolekyler jämfört med den vegetativa cellen. Denna ändrade
sammansättning ger sporen andra egenskaper än cellen, den är t ex motståndskraftig mot
strålning, uttorkning och värme. I detta experiment jämförs stationärfas-kulturer av dels en
sporbildande bakterie, Bacilius subtilis, och dels en icke-sporbildare, Escherichia coli, för
förmåga att överleva inkubation vid höga temperaturer.
Utförande
Från två utlämnade kulturer, som har vuxit 1 respektive minst 5 dygn i LB, av vardera B.
subtilis och E. coli (totalt fyra kulturer om vardera 1 ml) görs en bestämning av antalet
levande bakterier/ml (s. k. viable count VC).
Gör en spädningsserie av varje kultur och sprid 0.1 ml från de två sista spädningarna, 105 och
106 gångers spädning, på en TYS-platta per spädning.
Resterande 0,9 ml av de fyra utlämnade kulturerna inkuberas i 100°C under 20 min, dvs.
rören sätts i värmeblocket vid 100° C. Sedan rören svalnat tas 0,1 ml ut från rören och sprids
på 1 st TYS-platta per rör. Efter inkubering vid 37°C över natt avräknas plattorna och titern
levande bakterier beräknas. Ange i resultatbladet om några bakterier överlevde kokningen och
i så fall hur stor fraktion överlevande som erhölls.
4
C. KONTAMINERINGSUNDERSÖKNINGAR
Platta nr 1 (1-2 plattor per kurs!) Lämna plattan med locket avtaget på bänken under 60 min.
Följande försök ska utföras av varje laboratoriegrupp.
Platta nr 2 Dela in plattan i två segment! Tag ett hårstrå från vardera laborant och lägg dem
försiktigt på agarytan, ett i vardera segment och tryck fast dem mot agarytan med en steril
tandpetare.
Platta 3 Dela in plattan i två segment, ett segment per laborant! Fukta tummen med steril
NaCl och tryck lätt mot agarytan före och efter handtvätt. Tag en steril tandpetare, peta under
en nagel, i örat eller i näsan, tryck sedan tandpetaren lätt mot agarytan och tillsätt en droppe
steril NaCl, så att materialet löses upp och sprides på agarytan. Inkubera plattorna över natt
vid 37°C, sedan i 30°C eller i rumstemperatur för att få växt av bl a svampar. Kommentera
och rita av resultatet på resultatbladet.
D. ISOLERING AV BAKTERIEKLON
Bakgrund
När ett bakterieprov tas från t.ex. förorenat vatten, en patient på en vårdcentral eller
potatissalladen på en restaurang innehåller det nästan alltid flera olika sorters bakterier.
Kanske vill man se om badvattnet innehåller E. coli-bakterier eller kanske vill man se om den
sjuke patienten har samma Salmonella-bakterier som man fann i potatissalladen? Ofta vill
man separera de olika sorterna från varandra och få renkulturer för att se vilka olika bakterier
provet innehåller. I det närmaste allt arbete med mikroorganismer utförs med renkulturer. I en
renkultur förekommer endast en typ av bakterieceller. En renkultur fås genom att isolera en
bakterieklon, dvs en population där samtliga celler härstammar från en enda bakterie.
Bakteriekloner kan isoleras från en blandning av bakterieceller genom att späda
bakteriesuspensionen och därefter göra ett utstryk på fast substrat. Varje celltyp ges då
möjlighet att utvecklas till separata kolonier. Ofta görs ytterligare ett utstryk på en ny
agarplatta för att kontrollera att den isolerade bakterieklonen är ren. Att isolera klonala
stammar är även nödvändigt i genetiskt och molekylärbiologiskt arbete. Det är viktigt att välja
ett medium som man vet att de bakterier man söker efter verkligen växer på. Man måste exv.
använda olika typer av odlingsmedium om man tar provet från blodet på en patient respektive
bottensediment från Bottenhavet. I detta experiment kommer du att separera två sorters
bakterier, E. coli (vita kolonier) och S. marcenses (röda kolonier) från en blandkultur genom
att göra ett encellsutstryk.
Följande försök skall utföras av varje laborant.
Materiel
En blandkultur av två olika övernattskulturer med bakteriearterna:
A: Escherichia coli och B: Serratia marcescens.
Odlingsplattor: Rikt medium, t. ex. LAL eller blodagar, 1 per person.
5
Utförande
Dag 1.
Det är mycket viktigt att inga andra bakterier hamnar på
plattan. Kom ihåg att fingrar, labbänk etc. är smutsiga. Se till
att du har gjort i ordning allt och vet hur du ska göra innan du
börjar.
Plattan som skall strykas lägges på bordet upp och ner (locket
nedåt och agarytan uppåt). Röret med celler hålls i vänster
hand. Steril plastögla tas sterilt ur förpackningen.
För in öglan i röret och doppa ner den i suspensionen och ta
upp lite bakteriesuspension med öglan (Fig. 1).
Fig. 1
Sätt på skruvlocket och ställ tillbaka röret i provrörsstället
Tag skålen av den upp- och nervända plattan på sidorna med
andra handens fingrar, lyft av och vänd så att agarytan pekar
uppåt. Stryk med öglan fram och tillbaka i ena kanten av
agarytan (Fig. 2). För varje stryk hamnar bakterierna glesare
och glesare på plattan.
Fig. 2
Släng plastöglan i en speciell burk, ta en NY ögla Från det
första utstryket (1, fig 3), görs ett nytt utstryk (2) vinkelrätt
mot det tidigare. Plastöglan slängs, NY ögla tas. Ett tredje
utstryk görs från 2 (Fig. 3).
Det sista utstryket kan väntas ge kolonier uppkomna ur
enstaka celler.
Skålen vänds neråt och sätts tillbaka på locket.
Plastöglan slängs.
Fig. 3
Inkubera plattan över natt vid 30°C. Plattan ställs upp- och nedvänd för att förhindra att
eventuellt kondensvatten droppar ner på agarytan och där ger upphov till s.k. sekundärkolonier.
6
Dag 2.
Plattan med encellsutstryket inspekteras och uppvisas för kursassistenten för godkännande.
Två kolonityper ska kunna särskiljas. Ev. görs omstryk av de två kolonityperna efter
anvisning av kursassistenten.
OBS! Glöm inte namn, gruppnummer, försökets nummer samt datum på botten av alla
petriskålar.
7
UMEÅ UNIVERSITET
Kurs
______________________
Institutionen för molekylärbiologi
Termin/År ______________________
Grupp nr ______________________
Namn
______________________
RESULTAT FRÅN ÖVNINGAR I STERILTEKNIK
Steriliseringsmetoder
Ange resultat som:
Behandling
Termisk
80°C
100°C
Kemisk
Des.inf.medel konc
0"
30"
++
+
(+)
-
Tillväxt
90"
60"
K
Sterilfiltrering
UV-bestrålning
kraftig växt (= kontroll)
svag växt
nästan ingen växt
ingen växt
1'
3'
120"
5'
ej filtrerat
0"
180"
10'
240"
15'
filtrerat
30"
60"
Sporers temperaturresistens
VC (bakt/ml)
Sporer/ml
90"
180"
Sporuleringsfrekvens
E. coli 1 dygn
E.coli 5 dygn
B. subtilis 1 dygn
B. subtilis 5 dygn
Kommentarer: _______________________________________________________________
8
240"
