Sv
Cirkulerande tumör-DNA för
cancerdiagnostik
-Behandlingsstyrande tester av EGFR hos patienter med
icke småcellig lungcancer
Gisela Helenius
Laboratoriemedicinska kliniken
Universitetssjukhuset Örebro
Sv
Sökning i Web of Science: Circulating
tumor DNA
Published Items in Each Year
Last 20 years are shown
Citations in Each Year
Sv
Mängden cfDNA är högre och det är mer
fragmenterat hos cancerpatienter jämfört
mot friska
Mouliere et al. High fragmentation characterizes tumor-derived circulating DNA. PLoS September 6 2011
Sv
Mekanismer bakom ctDNA?
• Apoptos
• Nekros
• Apoptos är den ledande hypotesen med anledning av den
regelbundna storleken på fragmenten <300bp MEN! också
lite omdiskuterat eftersom utebliven apoptos är
karaktäristiskt för cancerceller
• Aktiv frisläppning
• Stödjer hypotes om ”genometastasis”
• Mittra et al. Circulating nucleic acids damage DNA of
healthy cells by integrating into their genomes. J. Biosci.
40(1), March 2015, 91–111,
Sv
Olika cancertyper avger olika
mängder ctDNA
Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage
Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Sv
Muterade
fragment / 5 ml
plasma
Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage
Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Sv
Mutationer i olika
tumörtyper (vävnad)
Science (2013) 339, 1546-58
Sv
lokal vs.metastaserande
sjukdom
Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage
Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Sv
Mängden ctDNA ökar i mer
avancerad sjukdom
Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage
Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Sv
Hur kan ctDNA användas kliniskt?
• Screening av cancer
− Cancerpatienter har högre mängd ctDNA och mer fragmenterat
men det finns ett överlapp med exempelvis inflammatoriska
tillstånd.
− Avger benigna tumörer ctDNA?
− Mer forskning krävs!
• Diagnos
− Standardiseradevårdförlopp, ”Allvarliga ospecifika symptom”
• Behandlingsstyrande tester
• Prognos
− Mer forskning krävs. Behövs det?
• Monitorering under behandling
Sv
Lungcancer
• Incidens 2014, 40/100000
• Femårsöverlevnad, 13,6% för män och
19,4% för kvinnor
• Överlevnaden har inte förbättrats de sista
25 åren
• Men nu! TKIs mot EGFR och ALK (samt
immunterapi)
• Icke-småcellig lungcancer (NSCLC),
adenocarcinom
• Heterogena tumörer
• Nya läkemedel under utveckling mot flera
av dessa avvikelser
• TKI mot resistensmutationen T790M
Sv
Svårigheter för behandlingsstyrande
tester på vävnadsbiopsier/cytologi
• Finns det tillräckligt med tumörceller i
biopsin?
• Är biopsin representativ för hela
tumören eller tumörerna?
• Räcker materialet till efter övrig
diagnostik?
• Vilket material ska vi analysera,
primärtumör eller metastas?
• Uppföljning av behandling –ny biopsi?
STORT BEHOV AV EN ICKE-INVASIV
PROVTAGNING
Sv
EGFR som behandlingsstyrande test
•
•
•
•
•
•
•
•
Meta-analys baserad på 27 publikationer med parade data
Plasma/serum
Olika stadie
FFPE/färsk frusen vävnad
Olika analysmetoder
Före och efter behandling
Sensitivitet 0,620
Specificitet 0,959
Sv
Kommersiella tester finns, bl.a. från
•
•
•
•
•
•
Qiagen
Entrogen
Roche
Genomica
Biocartis
BioRad
Sv
Monitorering under behandling
Marchetti et al. J Thorac Oncol. 2015;10: 1437–1443
Sv
Provmaterial för monitorering under behandling
Sv
Nya analysplattformar
Sv
LiBio
Diagnosprov
-Detektering av biomarkörer i cirkulerande
nukleinsyra hos patienter med lungcancer
Behandlingsstart, T0
• Alla patienter som utreds för
lungcancer får lämna samtycke och
prov (blod och urin).
• Diagnosprover från patienter med
NSCLC analyseras för EGFRmutationer. METODVALIDERING
• EGFR-muterade patienter som
behandlas med EGFR TKIs följs upp
enligt forskningsprotokoll.
BEHANDLINGSRESPONS
3-5 dagar
7-9 dagar
14-16 dagar
21 dagar
35 dagar
70 dagar
Sv
Frågeställningar
• Vilka karaktäristika har cfDNA från lungcancerpatienter
jämfört med friska kontrollindivider?
• Finns någon skillnad mellan ctDNA i plasma och i urin?
• Har ctDNA ett diagnostiskt värde i lungcancer?
• Kan man använda ctDNA från plasma eller urins för att
monitorera patienter under behandling med TKIs?
• Ska man använda ett riktat test eller en bred panel?
• Går det att detektera fusionsgener i ctDNA eller ctRNA?
Sv
Vad händer i projektet nu?
• Provinsamling pågår
• Verifiering av metod för extrahering av ctDNA från plasma
• Optimering av metoder för att mäta mängd och
fragmentering
• Koncentrering av urinprover och verifiering av extrahering
• Test av protokoll för NGS
− Riktad panel
− Sekvensering av allt ccfDNA
Sv
Stor variation i mängd
Prov id
Diagnos
1011 CRC
1018 Kolon hyperplasi?
1023 Adenomcarcinom, EGFR neg, KRAS neg, ALK neg
1031 Skivepitelcancer
1020 Adenocarcinom, EGFR mut, Del exon 19
1017 Småcellig cancer
1021 Adenocarcinom, EGFR mut, L858R
1026 NSCLC cancer uns, EGFR neg, KRAS neg, ALK neg
1019 NSCLC Adenocarcinom, mol test ej möjlig
1032 Ej malignt
1029 Fibrom
1028 Metastas småcellig cancer, pat avliden
1010 ej malignt
1030 metastas adenocarcinom
pg/µl
Qubit
687
390
1410
565
394
2630
665
444
1520
1910
424
98800
1110
728
pg/µl
Tapestation D1000
539
309
8940
548
351
19200
753
244
4120
953
66,5
80000
875
538
Entrogen
Ct IC
27,8
28,6
27
28,2
28,6
26,4
27,7
29,5
26,1
25,8
29,4
19,9
26,9
28,8
Sv
Tapestation
High sensitivity
D1000 och
D5000
Sv
Fragmenterings-PCR
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commo
ns/e/e1/Chromosome-DNA-gene.png
Mouliere et al. High fragmentation characterizes tumorderived circulating DNA. PLoS September 6 2011
Sv
Till sist…
• ctDNA för behandlingsstyrande test och monitorering under
behandling är kliniskt användbart för patienter med
lungcancer
• Kan monitorering av ctDNA användas för att styra när
bilddiagnostik ska användas?
• ctDNA som prognostiskt markör fungerar nog bra men
behövs det?
• ctDNA för screening och diagnos kräver mer forskning
Sv
Frågor och tack
http://www.npr.org/sections/healthshots/2014/11/10/360342623/combining-the-dna-ofthree-people-raises-ethical-questions
http://www.chemknits.com/2010/01/freepatterns-by-chemknits-summary.html
