Biokemisk Analys och Separationsteknik
Human Protein Atlas
Proteinlokalisation i human vävnad
Förarbete
Produktion och
kvalitetskontroll av
detektionsreagens
- I detta fall antikroppar
Biokemisk Analys och Separationsteknik
Förarbete - bl a
Proteinrening
IMAC-rening
Analys av renhetsgrad
med SDS-PAGE
Inbindningsstudier
Imaging av cancertumörer
mha Affibody-molekyler
Biacore-data
Immunohistokemi
Biokemisk Analys och Separationsteknik
Förarbete - bl a
Proteinrening
IMAC – rening
SDS-PAGE - analys
Strukturstudier
Scanning Electron Microscopy
Utveckling av ”spiber” – spindelfibrer
Hjälp vid odling av mänsklig hud
Biokompabilitet
Immunohistokemi
Biokemisk Analys och Separationsteknik
Koncentrationsbestämning av IgG
exempelvis vid autoimmun sjukdom
mha Gyrolab Bioaffy assay
Förarbete
Rening, inmärkning och
kvalitetskontroll av detektionsreagens
- I detta fall proteinet ”z”
Valet av metod
Förutsättningarna hos analyten / provet / frågeställningen
Exempel: Hur ta Biomarkör från att vara kandidat till klinisk tillämpning?
Hur många prover resp. analyter krävs?
Vilka tekniker kan över huvud taget användas?
Leigh Andersson, PepTalk, San Diego 2007
Kvalitativ och kvantitativ analys (Kap 1.6)
Välja metod – vad avgör?
Tillgång på utrustning
Detektionsgränser metod/prov
Antal prover
Graden av komplexitet i provet
Tänkbara risker metod/prov
Kända/publicerade metoder
Förutsättningarna hos analyten / provet
Graden av komplexitet i provet – Human Plasma som exempel
•Human plasma mycket komplext prov. Dock användbart i såväl forskning som diagnostik och
monitorering av behandlingsförlopp. Man tror att plasma innehåller kroppens alla proteiner
• Extremt dynamiskt fönster! Koncentrationsskillnader i storleksordningen 1012
•Totalmängden protein är ca 100 mg/ml protein, varav Albumin utgör drygt 50%
• Upptäkt, validering, diagnostisering, monitorering ställer olika tekniska krav
(mg/ml till <<pg/ml)
Kvalitativ och kvantitativ analys (Kap 1.6)
Metodens kvalitet
Reproducerbarhet / precision
Noggrannhet – Accuracy
Detektionsgräns – LOD – Limit of Detection
Analytiskt fönster – Detection range
Specificitet – Specificity
Selectivitet – Selectivity
Robusthet – Robustness
Kvantitativ analys (Kap 1.6)
Experimentella fel
Slumpmässiga eller systematiska
Beror på
Noggrannhet hos
- laboranten
instrumentet
- metoden
Minskas med
- Blankprov
- Referens
- Mer än en metod
- SOP
Analytens omgivning - Buffertval (Kap 1.4)
Önskvärda egenskaper hos en buffert
Vattenlöslig
Inte giftig
Buffertkapacitet vid önskat pH-intervall och temperatur
Hög renhet hos ingående kemikalier
Ej absorbera UV eller synligt ljus
Buffertkapacitet mycket viktig
Koncentrations och temperaturberoende
Konduktivitets [mS/cm] beroende
Analytens omgivning - Modellsystem
In vivo modeller (vivus-levande)
Man försöker studera händelser i ett “normalt” system
hela organismer
cellkulturer
In vitro modeller (vitrum-glasflaska, glaskärl)
Förenklade, cellfria system används för att studera ett visst förlopp
cellhomogenat
delar av organ
Produktion – Odling – Cellkulturer
Vad odla
Mikrobiella kulturer (jäst, svampar, bakterier)
Vävnadskulturer av växter
Mammaliecellkulturer
Hur odla
Batch
Fed-batch
Kontinuerlig
Cellkulturer – att slå sönder cellen
Mammalieceller (≈10 µm)
är sköra och lätta att slå sönder
Växtceller (≈100 µm)
har rigida cellväggar, deras storlek gör att de ändå är rel. lätta att slå sönder
Bakterier (≈1-4µm)
tåliga och ganska svåra att förstöra
Grampositiva
Gramnegativa
Svampar och jästceller är också relativt tåliga
Cellkulturer – att slå sönder cellen
Metoder för att krossa cellerna (1)
Mixa i ”hushållsmaskin”
Vävnadsdelar blandas med lämplig buffert.
Både för stor och liten skala
Krossa tillsammans med slipmedel, sand eller dylikt
i en mortel (växtceller och bakterier)
Liten skala
Glaskulekvarn
Mellan och stor skala
Tryckförändring
French press
Liten skala
HPH
Mellan och stor skala
Cellkulturer – att slå sönder cellen
Metoder för att krossa cellerna (2)
Enzymatiska metoder
Lysozyme används för att bryta ner peptidoglycan
Gramnegativa bakterier behöver
även behandlas
med detergent och EDTA
(Ca+)
Liten skala
Lyticase eller zymolyase används till jästceller
Kompletteras med osmotisk shock
Liten skala
Sonikering
Ultraljud, >20kHz, skjuvkrafter
Liten skala ty hög värmeutveckling
Osmotisk shock
Cellerna utsätts för hög osmotisk potential och sedan
mycket låg, membranet går sönder. Periplasmatiska
proteiner
Liten och mellan skala
Cellkulturer – att få ut proteinet
Metoder för att extrahera sitt målprotein (1)
Extraktionsbuffert
Isoton lösning: jonstyrka 0.1-0.2 M, pH 7-8
Antioxidant, förhindra oxidation av fria S-grupper
DTT, b-merkaptoetanol, cystein, GSH
Enzyminhibitorer för att undvika nedbrytning av protein/DNA/RNA
PMSF, DFP, IAA, Cystatin
Låg temperatur (4°C) hämmar också enzymatisk aktivitet
Enzymsubstrat – co-faktorer tillsätts för att stabilisera målproteinet
EDTA för att förhindra oxidation av thioler, -SH
Fällning av fenolinnehållande ämnen – PVP, används till växtceller
Natriumazid, lösningar som ska sparas under längre perioder
Cellkulturer – att få ut proteinet
Metoder för att extrahera sitt målprotein (2)
Membranproteiner kräver särskild omtanke:
Perifera membranproteiner binder till ytan genom
elektrostatiska interaktioner och vätebindningar
- Går att få loss genom att öka salthalten (≈1M NaCl)
Integrerade sträcker sig genom membranet, långa sekvenser
med hydrofoba aminosyror
- Detergenter behövs, oftast får man prova sig fram till vad
som passar målproteinet
(SDS, CTAB, CHAPS, Nonidet-40, Triton-X)
Koncentrationsbestämning – ett flertal metoder
Absorbansmätning – UV-ljus
Peptidbindning l=190 nm
Aromatiska sidogrupper l=280 nm
Korrektionsfaktor för det önskade proteinet kan användas, förutsätter
relativt rent material.
Nukleinsyror absorberar också (260nm/280nm)
Lowry - Beroende av peptidbindningar och aromatiska aminosyror (Cu2+=> Cu+)
BCA -
Bicinchoninic acid, liknar Lowry (Cu2+=> Cu+)
Bradford - Coomassie Brilliant Blue, binder till arg och lys. Absorbtionsmax ändras
vid inbindning. Bra standardkurva nödvändig
Aminosyra analys - Provet degraderas till aminsyror och mängden av varje
komponent bestäms mha kromtografi. Den mest noggranna metoden.
Assays baserade på Immunologiska metoder – ELISA, Gyrolab Bioaffy...
– Proteinmängden ofta viktig vid tolkning av resultat!
Mikroskopering
Olika förstoringsgrader och upplösningar
1 500 ggr (0.2µm)
Ljusmikroskopi
Faskontrastmikroskopi
Polariserat ljus
Konfokalmikroskopi
200 000 ggr (1nm)
Elektronmikroskopi
Transmissions elektronmikroskopi (TEM) (l≈4*10-3 nm)
tungmetaller
Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Ny teknik
Atomic force mikrosopi (AFM)
lateralt 0.5-1 nm, vertikalt 0.1-0.2 nm
Mikroskopering
Val av metod utifrån studieobjektets storlek
0.1nm
1nm
10nm
100nm
1µm
Viruses
Small
molecules
10µm
100µm
1mm
Yeast
Bacteria
Embryos
Globular
proteins
Ribosomes
Plant cells
QuickTime™ and a
TIFF (Uncompressed) decompressor
are needed to see this picture.
Organelles
Animal cells
Electron microscope
Light microscope
MRI
Human eye
Confocal microscopy
Labeled Antibody binding to the protein HER-2
Subcellular localisation: plasma membrane
RT4
Human epithelial
urinary bladder
carcinoma
Elektronmikroskopbild av rER
Separation och analys av
DNA/RNA
Bygger på laddning och storlek. DNA och RNA negativt laddat
Aminosyror är optiskt aktiva
undantag glycin
Aminosyror i proteiner har alltid L-form
Aminosyror har flera pKa
Glycin
katjon
zwitterjon
anjon
pI där aminosyran är oladdad
Alifatiska aminosyror
Aromatiska aminosyror
Laddade aminosyror
Polära aminosyror
Peptidbindning
Peptidbindning
Endast ett pKa
relevant för de flesta
aminosyrorna
Undantag är de Noch C-terminala
Disulfider stabiliserar
proteinstrukturer
Primär, sekundär, tertiär,
kvartenär
