Biokemisk analys och separationsteknik
FDA (Food and Drug Administration),
Läkemedelsverket
GLP = Good Laboratory Practice
GMP = Good Manufacturing Practice
SOP = Standard Operating Procedures
Kvalitativ analys
Kvantitativ analys
Kvantitativ analys
Välja metod:
• Tillgång på utrustning
• Detektionsgränser metod/prov
• Antal prover
• Graden av komplexitet i provet
• Tänkbara risker metod/prov
• Kända/publicerade metoder
Fel i analysen
• Noggrannhet hos
•laboranten
•instrumentet
•metoden
Minska de systematiska
felen genom
• Blankprov
• Referens
• Mer än en metod
• SOP
Metodens kvalité
• Reproducerbarhet/precision
• Noggrannhet
• Detektionsgräns
• Analytiskt fönster
• Specificitet
• Robusthet
Proteinernas/DNAts omgivning är viktig
Önskvärda egenskaper hos en buffert:
!
!
!
!
!
Vattenlöslig
Inte giftig
Buffertkapacitet vid önskat pH-intervall och temperatur
Hög renhet hos ingående kemikalier
Ej absorbera UV eller synligt ljus
Buffertkapacitet mycket viktig
Koncentrations och temperaturberoende
Konduktivitets [mS/cm] beroende
In vivo modeller (vivus-levande)
Man försöker studera händelser i ett “normalt” system
hela organismer
cellkulturer
In vitro modeller !(vitrum-glasflaska, glaskärl)
Förenklade, cellfria system används för att studera ett visst förlopp
cellhomogenat
delar av organ
Cellkulturer
Mikrobiella kulturer (jäst, svampar, bakterier)
Vävnadskulturer av växter
Mammaliecellkulturer
Att odla:
#Batch
#Fed-batch
#Kontinuerlig
För att kartlägga en viss funktion i en cell
Mutationer
" I genomet
" Addera en funktion via plasmid
Olika typer
! Punktmutationer
! Deletioner
Effekt
! Icke konditionella
! Konditionella
! Supressorkänsliga mutationer (sus)
Mikroskopering
1 500 ggr (0.2µm)
! Ljusmikroskopi
! Faskontrastmikroskopi
! Polariserat ljus
! Konfokalmikroskopi
200 000 ggr (1nm)
! Elektronmikroskopi
! Transmissions elektronmikroskopi (TEM) (!!4*10-3 nm)
tungmetaller
! Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Ny teknik
! Atomic force mikrosopi (AFM)
lateralt 0.5-1 nm, vertikalt 0.1-0.2 nm
0.1nm
1nm
10nm
100nm
Viruses
1µm
10µm
100µm
1mm
Yeast
Small
molecules
Bacteria
Embryos
Globular
proteins
Ribosomes
Plant cells
Organelles
Animal cells
Electron microscope
Light microscope
MRI
Human eye
To Perform High Quality Immunohistochemistry
On Selected Human Tissues And Cells
HPRK300030: !-HER-2
Subcellular localisation: plasma membrane
RT4
(Human epithelial
urinary bladder
carcinoma)
Elektronmikroskopbild av rER
Provberedning (1)
Vävnadsfixering
! kemisk (formaldehyd, glutaraldehyd)
omgivande material vax el dyl
! frysning
Tunna skivor
! Ljusmikroskopi =5-10µm, mikrotom
! TEM "100nm, ultramikrotom
TMA - production
Collection of tissues
Annotation
TMA design
Analysis
TMA construction
TMA sectioning
Provberedning (2)
Färgning:
Ospecifik:
! Kemikalier som binder - eller +-laddade molekyler
! pH indikatorer
Specifik:
! Utnyttja protein-protin interaktioner (Antikroppar)
! Koppla ett signalprotein till en molekyl med
känd/okänd lokalisering (GFP)
! Utnyttja enzymatiska reaktioner (utfällning)
Proteinlokalisering
P.Samuelson et al.
Färgen berättar om pH i organellen
pH"5
lysosom
pH"5,5-6,5
endosom
Separation och analys av DNA/RNA
Bygger på laddning och storlek. DNA och RNA negativt laddat
Aminosyror är optiskt aktiva
undantag glycin
Aminosyror i proteiner har alltid L-form
Aminosyror har flera pKa
Glycin
katjon
zwitterjon
anjon
pI där aminosyran är oladdad
Alifatiska aminosyror
Aromatiska aminosyror
Laddade aminosyror
Polära aminosyror
Peptidbindning
Peptidbindning
Endast ett pKa
relevant för de flesta
aminosyrorna
Undantag är de Noch C-terminala
Disulfider stabiliserar proteinstrukturer
Primär, sekundär, tertiär, kvartenär
Proteinmängden viktig för att tolka resultat
Absorbansmätning, UV-ljus
!
!
Peptidbindning !=190 nm
Aromatiska sidogrupper !=280 nm
Korrektionsfaktor för det önskade proteinet kan
användas, förutsätter relativt rent material.
Nukleinsyror absorberar också (260nm/280nm)
Lowry:
!
Beroende av peptidbindningar och aromatiska aminosyror (Cu2+=> Cu+)
BCA
!
Bicinchoninic acid, liknar Lowry (Cu2+=> Cu+)
Bradford
Coomassie Brilliant Blue, binder till arg och lys. Absorbtionsmax ändras vid
inbindning
! Bra standardkurva nödvändig
Aminosyra analys
!
Provet degraderas till aminsyror och mängden av varje komponent
bestäms mha kromtografi
Att extrahera ut sitt målprotein (1)
Extraktionsbuffert
Isoton lösning: jonstyrka 0.1-0.2 M, pH 7-8
! Antioxidant, förhindra oxidation av fria S-grupper.
DTT, "-merkaptoetanol, cystein, GSH
! Enzyminhibitorer för att undvika nedbrytning av protein/DNA/RNA
PMSF, DFP, IAA, Cystatin
Låg temperatur (4°C) hämmar också enzymatisk aktivitet
! Enzymsubstrat, co-faktorer tillsätts för att stabilisera målproteinet
! EDTA för att förhindra oxidation av thioler, -SH
! Polyvinylpyrrolidone (PVP) används till växtceller, fällning av
fenolinnehållande ämnen
! Natriumazid, lösningar som ska sparas under längre perioder
Att extrahera ut sitt målprotein (2)
Membranproteiner kräver särskild omtanke
Perifera, binder till ytan genom elektrostatiska interaktioner
och vätebindningar
! går att få loss genom att öka salthalten (!1M NaCl)
Integrerade, sträcker sig genom membranet, långa sekvenser
med hydrofoba aminosyror
! detergenter behövs, oftast får man prova sig fram till vad
som passar målproteinet
SDS, CTAB, CHAPS, Nonidet-40, Triton-X
Att extrahera ut sitt målprotein (3)
Slå sönder cellen
Mammalieceller (!10 µm)
! är sköra och lätta att slå sönder
Växtceller (!100 µm)
! har rigida cellväggar, deras storlek gör att de ändå
går ganska lätt att slå sönder
Bakterier (!1-4µm)
! tåliga och ganska svåra att förstöra
! Grampositiva
! Gramnegativa
Svampar och jästceller är också relativt tåliga
Metoder för att krossa cellerna (1)
Mixa i ”hushållsmaskin”
Vävnadsdelar blandas med lämplig buffert.
! Både för stor och liten skala
Krossa tillsammans med slipmedel (sand el dyl) i en mortel
(växtceller och bakterier)
! Liten skala
Glaskulekvarn
! Mellan och stor skala
Tryckförändring
French press
! Liten skala
HPH
! Mellan och stor skala
Metoder för att krossa cellerna (2)
Enzymatiska metoder
Lysozyme används för att bryta ner peptidoglycan
! Gramnegativa bakterier behöver även
behandlas med detergent och EDTA (Ca+)
! Liten skala
Lyticase eller zymolyase används till jästceller
! Kompletteras med osmotisk shock
! Liten skala
Sonikering
Ultraljud, >20kHz, skjuvkrafter
! Liten skala ty hög värmeutveckling
Osmotisk shock
Cellerna utsätts för hög osmotisk potential och sedan
mycket låg, membranet går sönder. Periplasmatiska
proteiner
! Liten och mellan skala
