Forskning Special
Nr 12 2012-08-07
Analysmetoden för gramnegativa
bakterier NMKL-godkänd
Anders Christiansson
Den analysmetod för påvisande av återkontamination av gramnegativa
bakterier i mjölk och grädde, som används av mejerierna i Sverige, har
blivit godkänd av NMKL (Nordisk Metodikkommitté för Livsmedel). Erkännandet innebär att metoden blir en nordisk standardmetod. För att
alla mejerilaboratorier ska utföra metoden på samma sätt bör analysen
fortsättningsvis utföras enligt beskrivningen i standarden NMKL nr 192.
Kraven i EU:s lagstiftning
I förordningen om mikrobiologiska kriterier för livsmedel (förordning (EG) 2073/2005), med ändring i förordning (EG) 1441/2007
krävs det att analys av Enterobacteriaceae ska göras som kontroll av
processhygienen vid tillverkning av pastöriserad mjölk och andra
flytande mejeriprodukter (1). I provtagningsplanen i förordningen
föreskrivs att fem delprov ska tas per batch (n=5) och att inget prov
(c=0) får överskrida gränsen för icke acceptabelt prov 10/ml (M). Erfarenheterna från mejerierna är att man nästan aldrig får utslag med
Enterobacteriaceae-metoden. Med andra ord är metoden för okänslig.
Metoden behöver förbättras
Anledningen är att återkontamination sker på betydligt lägre nivå,
oftast med enstaka bakterier per liter mjölk. Plattspridning med 1 ml
mjölk blir då alltför okänslig för att upptäcka återkontamination.
Dessutom består den psykrotrofa återkontaminationsfloran i huvudsak av andra bakterier än Enterobacteriaceae. Olika arter inom släktet
Pseudomonas dominerar helt (2). Historiskt sett har analys av mjölk
som förvarats vid 8°C fram till bäst före-dagen använts som test på
hållbarhet och produktionshygien. Höga totalantal bakterier vid bäst
före-dagen (log 6 bakterier/ml) beror på att gramnegativa bakterier
vuxit till och potentiellt kan påverka hållbarheten. Eftersom dessa
bakterier inte överlever pastörisering så indikerar de att återkontamination skett i processen. Den termoresistenta grampositiva floran
tillväxer vanligen betydligt långsammare. Men totalantalsmetoden är
för långsam (hela framstämplingstiden plus tre dygn) för verifiering
av processhygien och har ersatts av analys av gramnegativa bakterier
på förinkuberat prov (3). Mjölkförpackningen inkuberas då vid 2025°C för att eventuella gramnegativa bakterier ska föröka sig till en
nivå som kan detekteras. Därefter görs utstryk på VRGG-platta och
inkubering i 24 timmar. Förekomst av bakterier, oavsett färg, visar att
mjölken återkontaminerats. Metoden tar två dygn (4).
foto: svensk mjölk
Elektronmikroskopfoto av E. coli.
Tillstånd för alternativ metod
Under arbetet med att revidera branschriktlinjer för hygienisk
mjölkproduktion ville mejerierna att man även fortsättningsvis skulle
kunna använda analys av gramnegativa bakterier. I förordning (EG)
2073/2005 medges att livsmedelsföretagare kan få använda alternativa provtagnings- och kontrollförfaranden om de på ett tillfredsställande sätt kan styrka för den behöriga myndigheten att dessa
förfaranden ger minst likvärdiga garantier. Det innebar att branschen
Telefon: 0771-191900
www.svenskmjolk.se
Prenumerationer/adressändring
[email protected]
2
måste visa att gramnegativmetoden fungerar väl och säkerställa att den
utförs på samma sätt på alla laboratorierna, vilket gjordes i samarbete
mellan Svensk Mjölk och mejeriföretagen. Företagen bidrog med sina
analysrutiner och data från analyser, bland annat jämförande studier
och utfall i kontrollen. Svensk Mjölk ställde samman data och gjorde en
validering av metoden med underlag från tidigare rapporter, samt sammanställde en kortfattad analysmetodbeskrivning (5). I valideringen
visades att metoden kan detektera alla typer av gramnegativa bakterier
som kan växa i mjölk och att grampositiva bakterier inte stör analysen.
Inkuberingstid och temperatur demonstrerades vara lämpliga för att
bakterierna ska hinna växa till och kunna påvisas vid utstryk. Eftersom
analysmetoden fångar hela gruppen gramnegativa bakterier, där Enterobacteriaceae ingår som en undergrupp, och dessutom är känsligare, så
ger metoden minst likvärdiga garantier som metoden i de mikrobiologiska kriterierna från EU. Detta underlag ledde till att Livsmedelsverket
godkände att gramnegativmetoden kan användas som alternativ metod
till analys av Enterobacteriaceae, vilket framgår av branschriktlinjerna (6).
NMKL-godkännande
NMKL är en nordisk organisation som består av mikrobiologer, kemister
och sensoriker från Danmark, Finland, Island, Norge och Sverige. Målet med NMKL:s verksamhet är bland annat att utarbeta och publicera
lämpliga och väldokumenterade analysmetoder för foder och livsmedel,
som bidrar till att säkra och hälsosamma produkter kan tillverkas. För
att ge metoden en erkänd status och ytterligare säkerställa en enhetlig
tillämpning föreslog Livsmedelsverket att vi skulle utveckla en nordisk
standard baserad på den svenska. Intresse fanns från övriga nordiska
länder och en arbetsgrupp tillsattes. Arbetsgruppen leddes av en referent (Anders Christiansson) och en medreferent (Madeleine Ripsweden, Arla Foods) och med en kontaktperson vardera från övriga länder.
Metodförslag togs fram och diskuterades i gruppen, varefter varje lands
nationalkommitté gav synpunkter. Det slutgiltiga förslaget godkändes
vid NMKL:s årsmöte och publicerades som NMKL-metod 192 i december 2011 med titeln ”Gramnegativa bakterier i pastöriserad mjölk och
grädde. Påvisande av återkontamination” (7).
Referenser
1. Förordning (EG) 2073/2005
om mikrobiologiska kriterier
för livsmedel.
2. Ternström, A. m. fl. (1993).
Classification of the spoilage
flora of raw and pasteurized
milk, with special reference to
Pseudomonas and Bacillus. J.
Appl. Bacteriol. 75: 25-34
3. Christiansson, A. m .fl. (2003).
Metoder för påvisande av
gramnegativa återkontaminationsbakterier vid produktion av k-mjölk. Svensk Mjölk
Forskning rapport 7007-I.
4. Christiansson, A. (2008).
Analys av gramnegativa bakterier med inkuberat prov som
alternativ till direktanalys av
Enterobacteriaceae i k-mjölk.
Svensk Mjölk Forskning rapport 7075-I.
5. Christiansson, A. Metodvalidering –Analys av gramnegativa bakterier med inkuberat
prov som alternativ till analys
av Enterobacteriaceae i konsumtionsmjölk. Svensk Mjölk
Forskning rapport 7083.
6. Branschriktlinjer för hygienisk
produktion av mjölkprodukter
ver. 2a 2010-08-23.
7. Metoden kan beställas på NMKL:s hemsida
http:// www.nmkl.org/.
Metodbeskrivningen
Metoden beskrivs mera detaljerat än i tidigare rapporter och följer i
stort dessa, men med vissa modifikationer. Förpackningar med mjölk
eller grädde inkuberas vid 25°C i 24 timmar (värmeskåp) eller i rumstemperatur i 28 timmar (vid minst 20°C men under 25°C). Rumstemperaturen kan variera under dygnets timmar och för att säkerställa att
bakterierna tillväxer till detekterbar nivå så förlängs inkubationstiden
med fyra timmar. Därefter öppnas förpackningen och 10 µl stryks ut på
ytan av en VRGG-platta om inkubering skett vid 25°C. Flera utstryk kan
då göras på samma platta. Om inkuberingen skett i rumstemperatur
stryks 0,1 ml ut på en platta. Syftet med detta, liksom den förlängda
inkuberingstiden, är att kunna påvisa vid låga halter även om temperaturen är lägre än 25°C. Genom ytutstryk gynnas tillväxt av aeroba
gramnegativa bakterier, särskilt Pseudomonas. Plattorna inkuberas vid
30°C i 24 timmar. Vid förekomst av fem eller flera kolonier, oavsett koloniutseende eller färg, bedöms provet som positivt för gramnegativa
bakterier. Metoden är endast kvalitativ och antalet kolonier ska inte
räknas. När metoden används för påvisande av återkontamination med
provtagningsplan gäller rekommendationerna i branschriktlinjerna. Det
är viktigt att veta att metodens känslighet är hög (1 cfu/förpackning).
Så länge alla prover är negativa för gramnegativa bakterier uppfylls
även EU-kravet. Mejerierna kan sätta egna gränsvärden. Om mer än 40
procent av proverna är positiva krävs ”konfirmering” genom analys av
Enterobacteriaceae. Denna konfirmering kan göras genom ny provtagning och analys med VRGG-agar.
Ytterligare information
Anders Christiansson
046-192581
[email protected]
foto: studio spirit
