NORDISK METODIKKOMITÉ FOR
Nr. 192
2011
NÆRINGSMIDLER
NORDIC COMMITTEE ON FOOD ANALYSIS
No. 192
2011
Gramnegativa bakterier i
pastöriserad mjölk och grädde.
Påvisande av återkontamination.
Gram-negative bacteria in pasteurized milk and cream. Detection of
recontamination.
1.
1.
INTRODUKTION
INTRODUCTION
Detta är en kvalitativ metod. Gramnegativa bakterier
överlever inte lågpastörisering (HTST), d.v.s.
värmebehandling vid minst 72 °C i 15 sekunder.
Närvaro av Gramnegativa bakterier i pastöriserad
mjölk och grädde indikerar därför återkontamination
efter pastörisering. Även om återkontaminationsnivån är låg, ofta enstaka bakterier per liter, så kan
tillväxt av Gramnegativa bakterier begränsa
mjölkens hållbarhet.
This is a qualitative screening method. Gramnegative bacteria do not survive high temperature
short time (HTST) pasteurization (i.e. a minimum
heat treatment at 72 °C for 15 seconds). The presence
of Gram-negative bacteria in pasteurized milk and
cream therefore indicates post pasteurization
contamination. Although the level of contamination
is very low, even a few bacteria/l, growth of Gramnegative bacteria may limit the shelf life.
2.
2.
ÄNDAMÅL OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDE
SCOPE AND FIELD OF APPLICATION
En metod att påvisa återkontamination av
Gramnegativa bakterier i mjölk och grädde beskrivs.
Det är oftast bakterier av släktet Pseudomonas som
dominerar. Denna metod är utarbetad för
Gramnegativa bakterier i mjölk och grädde men kan
vara användbar för andra typer av värmebehandlade
livsmedel.
A method that is intended to detect recontamination
by Gram-negative bacteria in milk and cream is
described. Generally Pseudomonas spp. dominate.
This method has been developed for Gram-negative
bacteria in milk and cream but could be applicable to
other heat-treated food matrices.
3.
3.
DEFINITION
DEFINITION
Med Gramnegativa bakterier avses i denna metod
bakterier som kan tillväxa på ytan av violett röd
gallagar med glukos (VRGG) inom ett dygn vid
30 °C och som ger Gramnegativ reaktion i
kaliumhydroxid-test.
Gram-negative bacteria in this method are bacteria
that grow on the surface of violet red bile agar with
glucose (VRBG) within 24 hours at 30 °C and give a
Gram-negative reaction in the potassium hydroxide
test.
4.
4.
REFERENSER
REFERENCES
4.1
NMKL-prosedyre nr. 23, 2008: Handledning i
kvalitetssäkring för mikrobiologiska laboratorier.
4.1
NMKL Procedure No. 23, 2008: Guide on
quality assurance in microbiological laboratories.
4.2 NMKL-prosedyre nr. 12, 2002: Håndbok i
prøvetaking av næringsmidler.
4.2
NMKL Procedure No. 12, 2002: Guide on
sampling for analysis of food.
NMKL-metode nr. 192, 2011, Side 2 (5)
NMKL Method No. 192, 2011, Page 2 (5)
4.3 NMKL-prosedyre nr. 15, 2005: Temperaturkontroll på mikrobiologiska laboratorier.
4.3 NMKL Procedure No 15, 2005: Temperature
Control in Microbiological Laboratories.
4.4 NMKL-metode nr. 91, 6. udg., 2010:
Prøveudtagning og forbehandling af levnedsmidler
og foderstoffer til kvantitativ mikrobiologisk
undersøgelse.
4.4 NMKL Method No. 91, 6 Ed., 2010: Preparation
of the test sample and initial suspension for food and
animal feeding stuffs for quantitative microbiological
examination.
4.5 Gregersen, T. European Journal of Applied
Microbiology 5 (1978):123-127. Rapid method for
distinction of Gram-negative from Gram-positive
bacteria.
4.5 Gregersen, T. European Journal of Applied
Microbiology 5 (1978):123-127. Rapid method for
distinction of Gram-negative from Gram-positive
bacteria.
4.6 Christiansson, A . Svensk mjölk Forskning
Branschintern Rapport nr 7007-I 2003-04-03.
Metoder
för
påvisande
av
Gramnegativa
återkontaminationsbakterier vid produktion av kmjölk.
4.6 Christiansson, A . Svensk mjölk Forskning
Branschintern Rapport nr 7007-I 2003-04-03.
Metoder för påvisande av Gramnegativa
återkontaminationsbakterier vid produktion av kmjölk.
4.7 Ternström, A. Lindberg, A-M. and Molin, G.
(1993) Classification of the spoilage flora of raw and
pasteurized bovine milk, with special reference to
Pseudomonas and Bacillus. Journal of Applied
Bacteriology 1993, 75, 25-34.
4.7 Ternström, A. Lindberg, A-M. and Molin, G.
(1993) Classification of the spoilage flora of raw and
pasteurized bovine milk, with special reference to
Pseudomonas and Bacillus. Journal of Applied
Bacteriology 1993, 75, 25-34.
4.8 Christiansson, A. Svensk Mjölk Forskning.
Rapport 7083, 2010-06-22. Metodvalidering Analys av Gramnegativa bakterier med inkuberat
prov som alternativ till analys av Enterobacteriaceae
i konsumtionsmjölk.
4.8 Christiansson, A. Svensk Mjölk Forskning.
Rapport 7083, 2010-06-22. Metodvalidering - Analys
av Gramnegativa bakterier med inkuberat prov som
alternativ till analys av Enterobacteriaceae i
konsumtionsmjölk.
5.
5.
PRINCIP
PRINCIPLE
En förpackning med mjölk eller grädde förinkuberas
i 25 °C i 24 timmar, alternativt i rumstemperatur* i
28 timmar*, för att bakterierna ska föröka sig till en
påvisbar nivå. Förpackningen öppnas och prov (10
µl efter inkubering vid 25 °C eller 100 µl* vid
rumstemperatur) stryks ut på ytan av en VRGGplatta. Efter inkubering vid 30 °C i 24 ± 2 timmar
noteras förekomst av bakterieväxt. Vid förekomst av
5 eller fler kolonier, oavsett koloniutseende eller
färg, bedöms provet som positivt för Gramnegativa
bakterier. Konfirmering kan göras genom KOH-test.
A package of milk or cream is incubated at 25 °C for
24 hours or at room temperature* for 28 hours*, in
order to allow bacterial growth to reach detectable
levels. The package is opened and a sample (10 µl
following incubation at 25 °C or 100 µl* following
incubation at room temperature) is streaked on the
surface of a VRBG agar plate. The plates are
incubated at 30 °C for 24 ± 2 hours. Growth of 5 or
more bacterial colonies, irrespective of colony
morphology or color, indicates the presence of Gramnegative bacteria in the package. The KOH test can
be used to confirm the presence of Gram-negative
bacteria.
*Med rumstemperatur avses i denna metod temperatur lägre än
25 °C men inte under 20 °C. Rumstemperaturen kan variera
under dygnet. Särskilt vid 20-22 °C finns det en risk att
tillväxten blir för låg för att kunna påvisas. Därför bör
inkubationstid respektive analysvolym justeras.
*Room temperature in this method denotes a temperature less
than 25 °C but not below 20 °C. The room temperature may vary
over 24 hours. Particularly at 20-22 °C bacterial growth is slow
and may not be detectable unless incubation time and inoculation
volume is adjusted.
NMKL-metode nr. 192, 2011, Side 3 (5)
6.
MEDIA OCH REAGENSER
NMKL Method No. 192, 2011, Page 3 (5)
6.
MEDIA AND REAGENTS
6.1 Violettröd gallagar med glukos (VRGG)
Jästextrakt
3,0 g
Pepton
7,0 g
Natriumklorid
5,0 g
Gallsalter nr. 3
1,5 g
Glukos
10,0 g
Neutralrött
0,03 g
Kristallviolett
0,002 g
Agar
10-15 g
(beroende på gelstyrkan hos agarn)
Destillerat eller jämförlig vatten
1000 ml
6.1 Violet red bile glucose agar (VRBG)
Yeast extract
3.0 g
Peptone
7.0 g
Sodium chloride
5.0 g
Bile salts no. 3
1.5 g
Glucose
10.0 g
Neutral red
0.03 g
Crystal violet
0.002 g
Agar
10-15 g
(depending on the gelling properties of the agar)
Distilled or equivalent water
1000 ml
Lös upp komponenterna i vatten under värmning.
Koka så att alla komponenterna löser sig. Justera pH
efter kokning till pH 7,4 ± 0,2 vid 20-25 °C.
Sterilisera inte.
Dissolve the components by heating. Boil to dissolve
all components. Adjust the pH after boiling, to 7.4 ±
0.2 at 20-25 °C. Do not sterilize.
Gjut substratet i sterila petriskålar till en tjocklek av
minst 3 mm. Plattorna kan förvaras i 7 dygn vid 5,0
± 3,0 °C.
Pour the substrate into sterile petri dishes to a
thickness of at least 3 mm. The plates can be stored 7
days at 5.0 ± 3.0 °C.
Färdiggjutna plattor och dehydrerade medier finns
kommersiellt tillgängliga och ska användas efter
tillverkarens instruktioner. Observera att man inte
kan använda torre media ”sheets/films” till analysen.
Ready-to-use plates and commercial dehydrated
media are available and shall be used according to the
manufacturer’s instructions. Please notice that dry
media sheets/films are not suitable for the analysis.
6.2
KOH-lösning
Kaliumhydroxid
3,0 g
Destillerat vatten
100 ml
Lös i vatten och förvara i flaska med skruvlock.
6.2
KOH solution
Potassium hydroxide
3.0 g
Distilled water
100 ml
Dissolve in water and keep in a bottle with screw cap.
7.
7.
APPARATUR
APPARATUS
7.1
Inkubatorer, 30,0 ± 1,0 °C, 25,0 ± 1,0 °C.
Alternativt kan förinkuberingen göras vid
rumstemperatur*.
7.1
Incubators, 30.0 ±1.0 °C, and 25.0 ± 1.0 °C.
Optionally pre-incubation can be performed at room
temperature*.
*se 5, fotnot
*see 5, footnote
8.
8.
PROVTAGNING
SAMPLING
Provtagning utförs enligt gängse bakteriologiska
principer (4.2).
Sampling is carried out according to common
bacteriological principles (4.2).
9.
9.
UTFÖRANDE
9.1
Förinkubering
Förinkubera mjölk- eller gräddförpackningar vid
25 °C i 24 ± 2 timmar (rekommenderas i första
PROCEDURE
9.1
Pre-incubation
Pre-incubate packages of milk or cream at 25 °C for
24 ± 2 hours (recommended). In case of limited
NMKL-metode nr. 192, 2011, Side 4 (5)
NMKL Method No. 192, 2011, Page 4 (5)
hand). Alternativt vid brist på inkubatorutrymme kan
förinkuberingen ske i rumstemperatur* (notera
temperaturen). Justera inkubationstiden till 28 ± 2
timmar vid inkubering i rumstemperatur och
anteckna detta i rapporten. Det är viktigt att
temperaturen i förpackningen når 20 °C inom 8 ± 1
timmar för att bakterierna ska hinna föröka sig till
påvisbar nivå.
incubator facilities, the packages can be preincubated at room temperature*. The actual
incubation temperature should be recorded in the
report. Furthermore, the incubation period shall be
adjusted to 28 ± 2 hours if it occurs at room
temperature and should be included in the report. It is
essential that the time to reach 20 °C in the package
is maximum 8 ± 1 hours in order to assure sufficient
multiplication of the bacteria.
9.2
Inokulering
Blanda mjölken eller grädden noggrant genom att
vända förpackningen innan analys. Öppna
förpackningen.
9.2
Inoculation
Mix the milk or cream package thoroughly by
inverting the package before analysis. Open the
package.
Ta ut 10 µl prov med en ympögla om provet
inkuberats vid 25 °C. Stryk provet på ytan av en
VRGG-platta. Utstryk från flera olika förpackningar
kan göras på samma platta.
Collect a sample using a 10 µl inoculation loop if the
incubation temperature is 25 °C. Streak the sample
on the surface of VRBG agar. Several samples from
different packages can be streaked on the same agar
plate.
Om provet inkuberats i rumstemperatur ska 100 µl
prov tas ut med en pipett och spridas över hela ytan
på en platta.
If the pre-incubation is at room temperaturesample
100 µl with a pipette and spread over the entire
surface of a plate.
9.3
Inkubering
Inkubera VRGG-plattorna vid 30,0 ± 1,0 °C i 24 ± 2
timmar.
9.3
Incubation
Incubate the VRBG plates at 30.0 ± 1.0 °C for 24 ± 2
hours.
9.4
Avläsning och tolkning
Metoden ger endast ett kvalitativt svar. Undersök
förekomst av kolonier på plattorna. Om det finns 5
eller fler kolonier* eller sammanhängande växt efter
utstryk med ögla, oavsett koloniutseende eller färg,
anses Gramnegativa bakterier förekomma i provet.
* Halten bakterier ska inte bestämmas. Metoden
visar endast om Gramnegativa bakterier finns i
provet eller inte. Gränsen 5 bakterier syftar till att
eliminera risken för oavsiktlig laboratoriekontamination.
9.4
Reading and interpretation
The method is only qualitative. Examine the plates
for colonies. The presence of 5 or more* colonies or
confluent growth, irrespective of colony appearance
or color indicates that Gram-negative bacteria are
present in the sample.
*The method is not quantitative. The method only
indicates whether Gram-negative bacteria are present
or not in the package. The limit of 5 colonies is a
precautionary measure to eliminate the possibility of
accidental laboratory contamination.
9.5
Konfirmering
För att säkerställa gramnegativitet kan konfirmering
utföras med KOH-test vid behov. Sätt en droppe 3%
KOH på ett objektglas. Plocka en koloni, eller
material från utstryket, med hjälp av en ympögla och
rör ut den i droppen. Efter 5-10 sekunder dras öglan
upp försiktigt. Om en slemtråd följer med öglan
anses resultatet positivt för Gramnegativa bakterier.
9.5
Confirmation
Confirmation can be carried out, when needed, using
the KOH test to ensure the gram negativity. Place a
drop of 3% KOH on a microscopic slide. Pick a
colony, or confluent growth, with an inoculation loop
and stir it in the KOH. After 5-10 seconds of stirring
the inoculation loop is raised cautiously from the
drop. If a thread of slime follows the loop the
reaction is positive for Gram-negative bacteria.
NMKL-metode nr. 192, 2011, Side 5 (5)
10.
ANGIVANDE AV RESULTAT
NMKL Method No. 192, 2011, Page 5 (5)
10.
EXPRESSION OF RESULTS
Rapportera resultatet som positivt eller negativt för
Gramnegativa bakterier i mängd/volym av prov.
Report the result as presence or absence of Gramnegative bacteria in weight or volume of sample.
11.
11.
REFERENTER
Denna metod har utarbetats av Anders
Christiansson, Svensk Mjölk AB och med
Madeleine Ripsweden, Arla Foods Sverige, som
medreferent.
REFEREES
This method has been elaborated by Anders
Christiansson, Swedish Dairy Association and
Madeleine Ripsweden, Arla Foods Sweden.
© NMKL - www.nmkl.org
