LINKÖPINGS UNIVERSITET IFM-Kemi Tentamen i Biokemi 2 TFKE36 2009-05-29, Kl: 14.00-18.00 Skriv namn på alla blad Skriv endast en uppgift per blad Redovisa beräkningar och motiveringar Hjälpmedel: Miniräknare som inte får vara programmerad Ansvarig lärare: Magdalena Svensson, 5686 el. 0704-09 09 99 1.a) Du har en proteinextrakt innehållande 4 olika enzymer. Det är enzym B du önskar rena fram och för vilket du dessutom har en enkel metod att bestämma aktiviteten. Enzym A Enzym B Enzym C Enzym D pI pI pI pI 5,5 5,8 7,9 8,0 Mw 22 000 Mw 43 000 Mw 19 000 Mw 44 000 Hur går du till väga för att separera dessa proteiner. Motivera val av kromatografimetod/er, buffert/ar och elueringsbetingelser. Rita hur ett kromatogram kan komma att se ut efter varje kromatografisteg. Indikera var i kromatogrammet respektive protein återfinns. Ange enhet på axlarna i kromatogrammen. 6p b) Enzym B är ett serinproteas och du studerar dess aktivitets pH-beroende. Hur förväntar du dig att detta beroende ser ut? Motivera! 3p c) Du tillverkar en glycinbuffert – vid vilket/vilka pH områden kommer den att fungera som en buffert. 1p 2.a) Hur påverkas Hb´s syrebindningsförmåga i närvaro av 2,3-BPG (bifosforglycerat)? Förklara utifrån vad du känner till om Hb struktur och egenskaper. 3p b) Du vill studera ett enzyms aktiva yta. Du väljer att använda dig av ett gruppspecifikt reagens. Vad kan fördelen/nackdelan med denna typ av reagens vara jämfört med ett affinitetsreagens. 2p c) Förklara uttrycket substratkatalys. 2p d) Rita mekanismen för ett cysteinproteas klvyning av en peptidbindning. 3p 3.a) ATCas är ett allostert enzym. Vad kännetecknar denna typ av enzymer? Ge en allmän förklaring och en ATCas-specifik. 3p b) ATCas aktivitet regleras av närvaro av allosteriska effektorer. Vilka effektorer känner du till för ATCas och hur påverkar de enzymets aktivitet? Motivera! 4p c) Proteiner med gemensamt ursprung är homologa. Vilka kriterier använder man sig av för att bestämma om 2 proteiner är homologa eller inte? 2p d) Hur kan man tänka sig att olika isoenzymer uppstått under evolutionen? 1p 4. Enzymet laktatdehydrogenas katalyserar följande reaktion: NAD+ + Laktat NADH + Pyruvat Det har visat sig att produkten pyruvat kan verka som inhibitor mot substratet laktat. Av den anledningen utfördes ett kinetikexperiment för att utreda inhiberingsmekanismen. Härvid kördes 3 försöksserier med och utan inhibitorn pyruvat. (NAD+ hölls konstant på mättnadsnivå i samtliga fall). Hastighet (μmol/s) Vid 0 μM pyruvat 1,88 2,36 3,10 5,81 Laktat (mM) 1,5 2,0 3,0 10,0 Hastighet (μmol/s) Vid 40 μM pyruvat 1,05 1,34 1,88 4,19 Hastighet (μmol/s) Vid 80 μM pyruvat 0,73 0,94 1,34 3,27 a) Beräkna Vmax. (2p) b) Beräkna KM. (2p) c) Beräkna KI. (3p) d) Vilken inhiberingstyp ger pyruvat upphov till enligt kinetiken och ange även ett skäl för detta. (3p) 5. Kinetiken undersöktes för ett enzym, varvid följande mätdata erhölls: [S] (mM) v mmol/min) 2 22 4 60 6 110 10 165 20 200 a) Karakterisera enzymet kinetiskt och beräkna lämpliga kinetiska parametrar. 40 215 7p b) Enzymkoncentrationen i försöksserien var 0,10 mg/ml och enzymets molvikt var 50 000. Provvolymen var 15 ml. Vad är enzymets kcat.? 3p Svarsförslag: 1.a) Först gelfiltreringskromatografi – enzym Boch D eluerar först troligen ej baslinjeseparerade. Tris-buffert med pH runt 7. Poola fraktioner med enzym B och D. Separera med jonbyteskromatografi. Vid pH 7 är B –laddat och D + laddat. För att binda in B väljer vi en anjonbytare ekvilibrerad med exvis Tris-buffert pH med låg jonstyrka. D kommer att rinna rakt igenom kolonnen. B elueras genom att höja jonstyrkan på bufferten. b) Asp bör vara deprotoniserad för att kunna dra i H från His. His drar i H från Ser – så His bör vara deprotoniserad. His pKa normalt 6 så aktiviteten bör vara högst vid basiska pH. c) Glycin pKa ~^2 och ~^ 10 buffrar alltså mellan 1-3 och 9-11. 2.a) 2.a) HB allostert protein. Inbindning av syre påverkar inbindning av nästa syre osv. Hb finns in 2 former R och T, utan syre dominerar T. Ju fler syre som binder desto mer förskjuts jmv mot R. 2,3-BPG binder till T formen och stabiliserar denna – det krävs alltså högre halt av syre för att driva jmv. Mot R. b) Gruppspecifikt bra om inte så mycket kunskap om aktiva ytan. Binder spec sidokedjor men kan binda även denna typ av kedjor på andra ställen än i aktiva ytan. Aff.märk – substratanalog binder verkligen till aktiva ytan. c) Någon för katalysen viktig del (sidokedja) tillhandahålls av substratet. d) se styer 3,a) Inbindning av substrat 1 påverkar inbindning av substrat 2 till nästa aktiva yta osv. ATCas katalyserar karbamoylfosfat + aspartat till N-karbamoylaspartat. ATCas binder karbamoylfosfat först. Mätta enzymet med karbamoylfosfat. Mät produktbildning vid olika konc av aspartat. Sigmoidkurva. Alltså inbinding av substat till en aktiva yta påverkar inbindning av substrat till nästa osv. ATCas består av 6 katalytiska subenheter och 6 regulatoriska. b) ATP positiv och CTP (UTP) negativ (feedback inhibering). De binder till reulatorisk subhenhet (finns 6 st). ATCas finns i 2 former R aktiv och T inaktiv. ATP stab R och CTP stab T. c) sekvens och struktur. d) gendupplicering 4.a) Vmax=11,1 μmol/s b) KM= 7,1 mM c) KI= 40 μM d) Eftersom linjerna med och utan I skär på y-axeln är det kompetitiv inhibering. Laktat och pyruvat är strukturanaloger. 5. a) Vmax 230 mmol/min, positiv kooperativitet. b) kcat=1,25 x105 s-1