ezrin som prognosmarkör för rektalcancer

EZRIN SOM PROGNOSMARKÖR
FÖR REKTALCANCER
ANDREAS LINDHOLM
Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap Malmö högskola
BA161B, 15 hp
Hälsa och samhälle
Biomedicinska analytikerprogrammet
205 06 Malmö
Mars-maj 2015
EZRIN SOM PROGNOSMARKÖR
FÖR REKTALCANCER
ANDREAS LINDHOLM
Lindholm, A. Ezrin som prognosmarkör för rektalcancer. Examensarbete i
Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö högskola:
Fakulteten för hälsa och samhälle, Institutionen för Biomedicinsk vetenskap,
2015.
Rektalcancer drabbar cirka 2000 personer i Sverige per år. Trots förbättringar i
preoperativ utredning och behandling, utgör fortfarande lokalrecidiv (lokalt
återfall i bäckenet) ett allvarligt problem. I dagsläget överlever inte majoriteten av
patienterna som får ett lokalrecidiv. För närvarande finns det inga kliniskt
introducerade prognostiska vävnadsmarkörer för risken att utveckla ett
lokalrecidiv. Identifieringen av en sådan markör skulle kunna leda till att en
individuell behandlingsplan skapas för patienten, både primärt och postoperativt
samt för uppföljning. Patienter med högre risk att utveckla lokalrecidiv skulle
identifieras i ett tidigare skede. Proteinet ezrin har rapporterats vara en potentiell
tumörmarkör vid olika cancerformer. Association mellan ett högt uttryck av ezrin
och dålig prognos har påvisats. Syftet med studien var att undersöka om ezrin är
en prognosmarkör för rektalcancer. Därigenom skulle eventuellt en förbättrad
individbaserad behandlingsplan kunna skapas. Detta genom framställning av
vävnadsklotsar med tekniken tissue microarray för att därefter utföra
immunhistokemisk färgning för detektion av förekomsten av ezrin. Patienterna
utgör en kontrollgrupp omfattande patienter som inte har utvecklat lokalrecidiv. I
en case-only studie av Jörgren et al. (2010), med patienter som utvecklat
lokalrecidiv fem år från primäroperation, visades att ezrin skulle kunna vara
användbar som en prognosmarkör för rektalcancer. I 19,4 % (59/304) bedömdes
färgintensiteten i vävnadscytoplasman som svag, som måttlig i 56,9 % (173/304)
och som intensiv i 23,7 % (72/304). Intensiteten av cytoplasmafärgningen för
ezrin ska analyseras multivariat och dess eventuella prognostiska betydelse
värderas.
Nyckelord: Ezrin, immunhistokemi, lokalrecidiv, prognosmarkör, rektalcancer,
tissue microarray, tumörmarkör
1
EZRIN AS A PROGNOSTIC
MARKER FOR RECTAL CANCER
ANDREAS LINDHOLM
Lindholm, A. Ezrin as a Prognostic Marker for Rectal Cancer. Degree project in
Biomedical Science 15 Credit Points. Malmö University: Faculty of Health and
Society, Department of Biomedical Science, 2015.
Yearly, about 2000 persons in Sweden are diagnosed with rectal cancer. Although
advances have been made in tumour detection and its treatment, local recurrence
still represents a severe matter. A majority of the patients diagnosed with local
recurrence will not survive. There are no clinically available prognostic tissue
markers for rectal cancer patients concerning the risk of local recurrence at the
moment. The identification of a prognostic marker could lead to the development
of an individualized treatment plan for the patient, both primarily and
postoperatively as well as in follow-up. Several published papers have shown that
the protein ezrin could be a potential tumour marker in various tumours.
Association between high ezrin expression and poor prognosis has been
demonstrated. The aim of this study was to further explore if ezrin may function
as a prognostic marker for rectal. This by manufacturing tissue blocks utilizing the
technique of tissue microarray that were stained immunohistochemically for
ezrin. By analysing the expression of ezrin in the tumour cell cytoplasms
microscopically by determining the colour intensity. Patients in the study form a
control group consisting of only patients that did not develop a local recurrence.
The ezrin expression of the control group will be compared to the results from the
study of Jörgren et al. (2010) on rectal cancer patients who developed local
recurrence within 5 years of surgery, where it was shown that ezrin expression
could be used as a prognostic marker for rectal cancer. In 19,4% (59/304) the
expression intensity of the tumour cells cytoplasm was assessed as weak, as
moderate in 56,9% (173/304) and as intense in 23,7% (72/304). The intensity of
the ezrin expression will be analysed multivariately, and the prognostic value
further evaluated.
Keywords: Ezrin, immunohistochemistry, local recurrence, prognostic marker,
rectal cancer, tissue microarray, tumour marker
2
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
INLEDNING
BAKGRUND
Tissue microarray
Immunhistokemi
Ezrin
Syfte
MATERIAL OCH METOD
Urval och metod
Tissue microarray-konstruktion
Immunhistokemisk analys
Databehandling
Etisk bedömning
RESULTAT
DISKUSSION
Metoddiskussion
Resultatdiskussion
KONKLUSION
ACKNOWLEDGEMENTS
REFERENSER
BILAGA 1
4 4 5 5 6 7 7 7 8 8 9 9 10 11 11 12 14 14 15 17 3
INLEDNING
Cancerdiagnostik med tillhörande behandling är ett mycket brett och viktigt
område med ständigt aktuell forskning till grund för nya framsteg. För närvarande
finns det ingen tillförlitlig, kliniskt introducerad prognosmarkör i tumörvävnad
från rektalcancer.
BAKGRUND
Årligen diagnostiseras cirka 2000 personer i Sverige med rektalcancer. Adenom,
det vill säga benign polyp (neoplastisk epitelial förändring), är prekursor till
rektalcancer. Ungefär 10 % av adenomen utvecklas till en invasiv form,
adenocarcinom. Denna process tar 10-15 år att utveckla. I 80 % av patienter som
utvecklat rektalcancer uppkom denna sporadiskt, medan resterade procent utgörs
av patienter med hereditet för rektalcancer [1].
År 1995 startade det Svenska rektalcancerregistret (SRCR) av Socialstyrelsen
med syfte att övervaka och säkerställa kvaliteten av hanteringen av rektalcancer. I
registret insamlas data prospektivt för alla nydiagnostiserade individer där det
bland annat ingår preoperativ utredning, behandling information och
uppföljningsdata fram till fem år efter operationen. Främst är det personer som är
över 70 år som drabbas av rektalcancer [2]. På individnivå finns det inga konkreta
riskfaktorer för utveckling av rektalcancer [3]. Tumören klassificeras som T1-T4
beroende på hur djupt den växer in i tarmväggen [1].
Stora framsteg har gjorts i behandlingen av rektalcancer, vilket har medfört att
antalet lokalrecidiv (lokala återfall) har minskat och att överlevnadsgraden ökat.
Detta har sitt ursprung i framför allt ökad användning av pre- och postoperativ
radioterapi och kemoterapi, förfinade operationstekniker (t.ex. TME – total
mesorektal excision) samt införandet av multidisciplinära teamkonferenser
(MDT). Vid utredning genomförs bland annat rektoskopi där provexcisioner (px)
tas från misstänkta förändringar för histopatologisk bedömning. Datortomografi
(DT/CT) av thorax och buk utförs för att upptäcka eventuella fjärrmetastaser eller
recidiv från tidigare operation. Magnetresonanstomografi (MRT) av lilla bäckenet
utförs för att undersöka detaljer kring tumörens djupväxt till omkringliggande
organ. Det är främst genom denna undersökning som det föreslås om patienten
skall genomgå neoadjuvant behandling (i form av radioterapi eller kemoterapi)
eller inte. Detta baseras på avståndet från tumören till den cirkumferentiella
resektionsmarginalen (CRM) tillsammans med den histologiska bedömningen av
tagna biopsier. CRM avser avståndet mellan den djupast liggande tumörvävnaden
och resektionsranden i mesorektum (tarmkäx i rektum) [1,3].
Operation utgör den potentiellt botande behandlingsmetoden för rektalcancer.
Trots framgångar i behandlingen av rektalcancer, utgör lokalrecidiv alltjämt ett
problem. För patienter som behandlades för rektalcancer mellan åren 1995 och
1998 uppkom lokalrecidiv för 9,5 % av dessa individer inom en femårsperiod
efter primäroperationen. Huvudparten av patienterna som utvecklar lokalrecidiv
av tumörer överlever inte. Det finns flertalet potentiella riskfaktorer för
lokalrecidiv: patientrelaterade såsom ålder och kön, behandlingsrelaterade som till
exempel icke optimal användning av pre- och postoperativa behandlingar samt
4
faktorer relaterade till tumören som vaskulär invasion, dålig tumördifferentiering
samt invasion av lymfatisk vävnad. Den nuvarande kunskapen om
prognosmarkörer är otillräcklig. Identifiering av en tumörmarkör för rektalcancer
behövs för att bättre kunna anpassa behandlingen till den enskilde patienten och
för att kunna differentiera uppföljningen [1-2,4].
En potentiell tumörmarkör som har visat lovande resultat i tidigare publicerade
studier är ezrin [4-7]. För att undersöka detta ytterligare analyseras uttrycket av
ezrin i biopsier med hjälp av tissue microarray och immunhistokemi.
Tissue microarray
Tissue microarray (TMA) är en form av matris som används för att kunna utföra
en större multiplex histologisk analys. Fördelen med TMA-tekniken jämfört med
analys av traditionella histologiska snitt är att flera hundratals vävnadsprover kan
analyseras samtidigt, vilket är både tids- och kostnadseffektivt. Tekniken har
alltjämt sitt störta huvudområde inom forskningen, men utnyttjas alltmer inom
den kliniska diagnostiken [8]. Formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE)
vävnadsklotsar snittas och färgas histologiskt med rutinfärgningen hematoxylin
och eosin (H&E). De infärgade objektglasen mikroskoperas för att identifiera och
märka upp morfologiskt representativa tumörområden. Områdena stansas sedan ur
vävnadsklotsarna (givarklotsar) med hjälp av TMA-apparaten för att konstruera
en mottagarklots. En mottagarkloss kan komma att innehålla upp emot 1 000
stycken så kallade tissue cores eller vävnadskärnor. Dessa vävnadskärnor erhålls
med hjälp av en ihålig nål som borrars ner i vävnaden och stansar ur en cylindrisk
biopsi. Borrkärnorna överförs till mottagarklotsen i en precis matris med ett
förutbestämt mellanrum mellan kärnorna [8-9]. Så kallade orientation spots
möjliggör orientering av mottagarklotsen genom att dessa innehåller vävnad helt
skild från vävnadstypen som skall analyseras – annars skulle det vara omöjligt att
påvisa från vilken givarkloss vävnadskärnan urstansats. Orientation spots görs
ofta även asymmetriska för att ytterligare skilja dessa från provmaterialet1.
Mottagarklossen snittas därefter för användning i histologiska metoder som
immunhistokemi eller in situ-hybridisering [9-10].
Immunhistokemi
Vid immunhistokemi används primära antikroppar med hög specificitet för att
lokalisera och binda till antigener. Tekniken bygger på identifiering av antigener
genom antigen-antikroppsinteraktioner, där bindningsstället identifieras med hjälp
av direkt enstegsmetod eller indirekt flerstegsmetod. En antikropp kan ha flera
målantigener, men den har bara specifik bindning för en särskild epitop som
möjliggörs av antikroppens variabla regioner. För att underlätta för antikroppen
att binda till sin epitop görs ofta en slags förbehandling av FFPE snitt.
Prepareringen kallas för antigen retrival eller epitop retrival. Det finns två
huvudsakliga tillvägagångssätt: HIER (heat-induced epitope retrival) och EIER
(enzyme-induced epitope retrival). HIER utnyttjar en kombination av hög värme
med en retrival-buffert för att åstadkomma detta. Enzymbehandling, EIER,
innebär att ett proteolytiskt enzym används för att exponera epitopens
bindningsställe. För visualisering finns det tre metoder: immunofluorescens,
enzymer och radioaktivitet. Vid enzym-immunhistokemi utnyttjas enzymer som
är märkta för att kunna demonstrera positionen av antikroppen. För att
visualiseringen ska kunna äga rum behöver enzymet närvaro av substrat och
kromogener. Horseradish peroxidase (HRP) och calf-intestinal alkaline
phosphatase är de mest frekvent använda enzymerna för visualiseringen. HRP
__________________________________
1
Personlig kommunikation E Rambech (1)
5
bildar en färgavgivande produkt i närvaro med substratet väteperoxid och
kromogenen 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) eller 3-amino-9etylcarbazol (AEC), varigenom bindningsstället mellan antikroppen och antigenen
kan identifieras. Alkaliskt fosfatas synliggörs genom användning av substratet
naphthol-AS-fosfatas och ett kromogen som fast-red TR, fast-blue BBN eller fast
red-violet LB. För att detektera förekomsten av antigener eller antikroppar i
vävnaden respektive serum finns det ett par olika tekniker. I den direkta
enstegsmetoden brukas en enzym-märkt primär antikropp som reagerar med
antigenen och binder direkt till denna i vävnaden. För metoden används det endast
en antikropp som är märkt med ett enzym, till exempel HRP. En indirekt tvåstegsmetod involverar en omärkt primär antikropp som binder till målantigenet
och en sekundär märkt antikropp (anti-humant Ig) som reagerar med den primära
antikroppen. En indirekt trestegsmetod (lösligt enzym-immunkomplex) innefattar
ett enzym-antienzymkomplex som reagerar med enzymmärkt sekundär antikropp.
Den sekundära antikroppen är märkt med ett enzym och visualiseras med hjälp av
ett kromogen. Den primära antikroppen och enzym-antienzymkomplexet måste
vara tillverkat i samma djur för att den sekundära antikroppen ska kunna binda
ihop dem. Peroxidase-antiperoxidase (PAP-komplex) är ett exempel på denna
teknik [11].
Ezrin
Ezrin är ett protein som tillhör familjen ezrin-radixin-moesin, vilka agerar
sammanlänkande mellan aktin-innehållande cytoskelett och plasmamembran via
cellsignalering av ytmolekyler. Ezrin utgör en viktig roll i cellmotilitet (rörelse),
interaktioner mellan celler samt mellan celler och extracellulärt matrix,
signaltransduktionsvägar, proliferation, apoptos, invasion och metastas [4-5,7].
Ezrin, också känt som cytovillin, är en produkt av genen Vil2 och uttrycks i
flertalet olika normala celltyper, som till exempel endotelceller och i mikrovilli. I
vilande form återfinns ezrin i cytoplasma i en stängd strukturformation, där dess
bindningsställen inte är tillgängliga. Vid stimulering sker en konfirmationsändring
genom fosforylering vid de terminala domänerna NH2 och COOH vilka
dissocieras från varandra, bland annat genom inbindning till fosfatidylinositol-4,5bifosfat. Medieringen styrs av Rho. Aktiveringen leder till att ezrin lokaliseras till
plasmamembranet och att den fria N-terminalen binder till
transmembranproteiner, i synnerhet adhesionsmolekyler, och C-terminalen binder
till aktinfilament. Adhesionsmolekylerna utgörs av bland andra E-cadherin och
CD44. E-cadherin reglerar celladhesion samtidigt som ezrin utöver en regulatorisk
kontroll av lokalisationen av E-cadherin till plasmamembranet. Ezrin kan få Ecadherin att aggregera och resultera i en förlust av cell-celladhesion, vilket kan
indikera att ezrin främjar metastatisk spridning [12-13]. CD44 är en
membranreceptor, som interagerar med bland annat hyaluronsyra, och reglerar
interaktioner mellan celler samt mellan celler och extracellulärt matrix. CD44 har
förknippats med metastaser i tidigare studier genom dess cellmigrerande funktion
av tumörceller [14-15]. Ezrin associeras med flertalet olika
signaltrasduktionsvägar, många inblandade i onkogenisk signalering, som till
exempel PI3K/Akt som reglerar cellulära processer som proliferation och
cellöverlevnad. Proteinkinasen Akt är en effektor av PI3K och den aktiverade
formen av Akt identifieras frekvent i dåligt differentierade tumörer där Akt
framkallar en förbindelse mellan onkogen aktivitet och cellöverlevnad, vilket
medför en högre risk för tumörinvasion [5,16]. Akt utövar bland annat sin
signaleffekt på proteinet Bad vars funktion medverkar i initiering av apoptos [16].
Nyligen visade en studie att Akt2 specifikt aktiverade ezrin genom fosforylering
6
[7]. Funktion av ezrin i dessa processer medför att proteinet har en nyckelroll i
progressionen av tumörer och metastaser, varför den anses vara en mycket
intressant kandidat som en potentiell biomarkör för rektalcancer [4].
Ezrin har bevisat sig vara en vävnadsmarkör för aggressiv tillväxt i ett flertal olika
solida tumörer [6]. Dessutom finns det indikationer om att ezrin kan vara en
vävnadsmarkör för aggressivitet även i rektalcancer. Studien av Jörgren et al. [4]
visade att ezrin uttrycktes i primärtumörer och att nivån av uttrycket kunde
prognosera tiden till utveckling av ett lokalrecidiv. Uttrycket av ezrin i
tumörvävnaden bedömdes till att 17 % (18/104) klassificerades som svag, måttlig
i 62 % (64/104) av fallen och i 21 % (22/104) intensiv. Tiden för utveckling av
lokalrecidiv hos patienter med högt uttryck av ezrin var signifikant kortare jämfört
med hos patienter med lågt uttryck av ezrin (p=0,0004). Patienter med högt
uttryck av ezrin uppvisade lokalrecidiv i median efter 316 dagar (intervall 98961), jämfört med 621 dagar (intervall 127-1673) för patienter med lågt uttryck av
ezrin. Studiens slutsats var att ezrin potentiellt kan representera en prognosmarkör
för aggressivitet i rektalcancer [4]. Denna teori har stöd i flera andra studier, bland
andra Kokeila et al. som påvisade att ezrin möjligt kan användas som en prediktiv
biomarkör för patienter med rektalcancer [5] samt Wang et al. som konstaterade
en korrelation mellan högt uttryck av ezrin och tumörens malignitet [12].
Fastställs ezrin som en prognosmarkör kan informationen bidra till att anpassa
behandling och uppföljning.
Syfte
Syftet med studien var att undersöka om proteinet ezrin kan användas som
prognostisk tumörmarkör för rektalcancer. Detta genom att analysera uttrycket
ezrin i vävnadsmaterial från patienter som inte uppvisat lokalrecidiv. Resultatet
från denna kontrollgrupp används för att jämföra och validera resultatet från en
tidigare publicerad studie av Jörgren et al. (2010) där endast patienter som
drabbats av lokalrecidiv ingick.
MATERIAL OCH METOD
Detta är en retrospektiv studie där arkiverat material från patienter används.
Insamling av kliniska variabler gjordes från SRCR och från arkiverade journaler.
En databas konstruerades i Excel®.
Urval och metod
Patientgruppen utgjordes av 287 personer från Skåne som opererades för
rektalcancer mellan den 1 januari 1996 och 31 december 2005 och som inte
uppvisade lokalrecidiv eller metastaser inom fem år efter primäroperationen.
Resultatet från denna kontrollgrupp jämfördes med resultatet från studien av
Jörgren et al. [4], vars syfte var att analysera uttrycket ezrin i tumörer från
patienter med rektalcancer som utvecklat lokalrecidiv.
Biopsier utgjordes av preoperativa provexcisioner (px) samt av utskuret
biopsimaterial från operationspreparat. Totalt utgjordes provmaterialet av 311
stycken FFPE vävnadsklotsar från 287 patienter. Vävnadsklotsar med tillhörande
glas framplockades ur patologarkivet, infärgat med rutinfärgningen H&E, om
detta fanns tillgängligt. Fanns inga glas snittades dessa klotsar och infärgades med
7
H&E. Tillsammans med patolog mikroskoperades infärgade glas för markering
för TMA. Mottagarklotsen snittades och färgades immunhistokemiskt för ezrin.
En databas i SPSS® (Chicago, Illinois, USA) skapades för statistisk analys. En
andel av vävnadsklossarna exkluderas innan konstruktionen av TMA på grund av
otillräckligt med återstående material för att erhålla vävnadskärnorna. Denna
bedömning utfördes makroskopiskt.
Tissue microarray-konstruktion
Konstruktionen av mottagarklotsen utfördes med en halvautomatisk arrayer,
Minicore® 3 Tissue Arrayer (Mitogen Ltd, Harpenden, Storbritannien). Till
arrayen tillkommer två datorprogram; Minicore® Control Station, som styr
apparaten, och Tissue Arrays Design Software TMADesigner®2 Version
1.0.0.12, i vilken designen av matrisen konstrueras. Patientdata importerades från
Excel® till TMADesigner®2. I programmet bestäms dimensionerna för
mottagarklotsen, storleken av vävnadskärnorna samt mellanrummen mellan dessa
i mottagarklotsen, antalet vävnadskärnor per givarklots som skall erhållas,
givarblockets vävnadstyp (exempelvis tumörvävnad) samt därtill att beräkna
antalet mottagarklotsar som behövs för arrayen. Designen laddas in i Minicore®
Control Station. Med hjälp av Minicore® Control Station sätts markeringar ut var
stansen i givarklotsen skall tas enligt markeringarna på de färgade glasen. Varje
enskild spot innehar specifika koordinater i matrisen, således behöver användaren
inte själv sikta var hålen skall göras utan detta sköter apparaten [17].
En nål som erhåller 1 mm ⌀ stans användes. Det minsta avståndet mellan
vävnadskärnorna är diametern av stansen + 100 µm [17]. Mellanrummet
bestämdes till 1600 µm. Från varje givarklots erhölls två stycken vävnadskärnor
från tumörområdet. Dubbletter av mottagarklotsen skapades ifall någonting
oförutsett skulle inträffa. Den första raden utgjordes utav två stycken orientation
spots, som i detta fall bestod av hjärnvävnad. Totalt 146 vävnadskärnor per
mottagarkloss (exkl. orientation spots) erhölls. Hålet som framställdes i
mottagarklotsen var 4 mm djupt, medan den urstansade vävnadkärnan var 3 mm
djup. Detta för att stansen inte skall sticka upp och eventuellt gå av. Dessutom
sparar detta förfarande på vävnaden eftersom mottagarklotsen behöver grovsnittas
innan snitten erhålls1. TMA-apparaten har tre lägen; recipient, donor och transfer.
Recipient är det första steget där hålet i mottagarklotsen utförs. Transfer väljs
därefter vilket avlägsnar paraffinstansen från nålen. I läget donor stansas
vävnadskärnan ut och överförs till mottagarklotsen genom att välja transfer. För
att validera resultatet och med säkerhet kunna se att vävnadskärnan kommit rätt
kan ett foto tas av mottagarklotsen [17].
De färdiga mottagarklotsarna placerades i värmeskåp, 30-37 °C, i 3-4 timmar eller
till nästkommande dag för att paraffinet skulle mjukna. Detta renderar en bättre
kontaktyta mellan det omgivande paraffinet i mottagarklotsen och
vävnadsmaterialet samt ger en jämn och slät yta. För att säkerställa jämnheten
trycktes ett rent objektglas försiktigt över mottagarklotsen. Denna fick därefter
vila i ett dygn i rumstemperatur innan snittning1. Det producerades fem stycken
mottagarklotsar (totalt tio inräknat dubbletterna) från 311 givarklotsar.
Immunhistokemisk analys
Med mikrotom HM 355S (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) erhölls 4 µm
tjocka snitt som överfördes till objektglas specifika för immunhistokemi (DAKO
FLEX IHC Microscope Slides K8020, DAKO A/S, Glostrup, Danmark). Snitten
__________________________________
1
Personlig kommunikation E Rambech (1)
8
torkades över natten och innan den immunhistokemiska färgningen även i
värmeskåp, 60 °C, i 1-2 timmar. Detta görs för att snitten skall fästa vid glasen
och för att vattnet ska avdunsta. Därefter följde en avparaffinering och
rehydrering i xylen respektive i fallande serie alkoholkoncentrationer till dH2O
(destillerat vatten). Antigen retrival utfördes enligt HIER där glasen sattes i kyvett
innehållande TRIS/EDTA-bufferten Target Retrieval Solution pH 9 S2367
(DAKO A/S, Glostrup, Danmark). Kyvetten med glasen sattes i tryckkokare
(2100 Retriver, Histolab, Göteborg, Sverige) innehållande 750 ml dH2O och
behandlades i 1 timme. Glasen sköljdes därefter i flera omgångar dH2O. Glasen
infärgades med DakoCytomation DAKO AutostainerPlus (DAKO A/S, Glostrup,
Danmark) för ezrin. Visualiseringssystemet som användes var DAKO REAL™
EnVision™ FLEX high pH K8010 (DAKO A/S, Glostrup, Danmark). Systemet
detekterar specifika primära antikroppar från mus och kanin som är bundna till
antigener i vävnadssnitt genom en indirekt detektionsmetod. Den primära
antikroppen reagerar med enzymmärkt sekundär antikropp i form av en multimer.
Multimeren utgörs av ett enzymkomplex bestående av dextran bundit till HRP
som är kopplat till sekundära antikroppsmolekyler, get anti-mus/kanin.
Reaktionen visualiseras genom att HRP bildar en färgavgivande produkt i närvaro
med kromogenet DAB+ (EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen) och substratet
väteperoxid (EnVision™ FLEX Substrate Buffer), vilket ger en brun infärgning.
Den primära antikroppen utgjordes av monoklonal anti-ezrin (mus IgG1), klon
3C12, från Sigma® (St Louis, MO, USA). Antikroppen späddes 1:5000 med
DEKO REAL™ Antibody Diluent S2022. Innan färgning droppas Wash Buffer
på snitten för att undvika intorkning. Motfärgning utfördes med hematoxylin (C.I.
75290, EnVision™ FLEX Hematoxylin). Efter avslutade färgning dehydreras
snitten och glasen monteras med Pertex® (Histolab, Göteborg, Sverige). Som
kontrollvävnad användes tonsill samt placenta. För fullständigt färgningsprotokoll
av Ezrin, se bilaga 1 [18]. Rutinmässigt framställs det även glas infärgat med
H&E.
I enighet med den tidigare studien av Jörgren et al. [4] användes en fyrgradig
skala för bedömning av uttrycket ezrin i vävnaden: negativ (-), svag (1+), måttlig
(2+) och intensiv (3+) färgintensitet. Bedömningen gäller endast färgintensitet och
inte mängden infärgad vävnad. Negativt och svagt uttryck utgör tillsammans en
kategori under beteckningen svagt. Vid den statistiska analysen slogs resultatet
från kategorierna svagt och måttligt samman och kategoriserades som ett svagt
uttryck. Detta jämfördes med resultatet från den intensiva infärgningen som
ansågs vara av högt uttryck. För bedömningen av färgintensiteten i denna studie
stod författaren och Gudrun Lindmark (professor, överläkare kolorektal kirurgi,
Helsingborgs lasarett). Bedömningen utfördes blindat, det vill säga utan
kännedom om patientdata. Helena Árnadóttir (ST-läkare i kirurgi) och patolog
Dejan Korkocic, Helsingborgs lasarett, utförde separat värdering av
färgintensiteten. De vävnadskärnor som bedömdes olika i gruppen omvärderas
tills koncensus uppnåddes.
Databehandling
Den statistiska databehandlingen utförs genom multivariabelanalyser i SPSS®.
Denna genomförs i slutet av maj månad av Helena Árnadóttir och Fredrik Jörgren.
Etisk bedömning
Tillstånd från regionala etikprövningsnämnden erhölls, Um dnr 02-416/02-417.
9
RESULTAT
Totalt kunde 311 vävnadsklotsar användas till TMA-konstruktionen som
resulterade i fem stycken mottagarklotsar. Ur dessa kunde 304 stycken (97,7 %)
analyseras. Bortfallet berodde antingen på att vävnadskärnorna endast innehåll
normal slemhinna utan tumörceller eller på att vävnadskärnan saknades helt. Från
varje givarkloss erhölls två borrkärnor. Förelåg olika intensitetsstyrka mellan
dessa valdes värdet med högst intensitet.
Tabell 1. Resultat från bedömningen gällande färgintensiteten av ezrin i
tumörcellscytoplasma. Siffrorna anger antal vävnadskärnor.
Icke
Uttryck av ezrin
bedömbar
Svagt
Måttligt
Intensivt
Kloss 1
3
12
33
25
Kloss 2
0
17
46
10
Kloss 3
3
20
37
13
Kloss 4
1
9
45
18
Kloss 5
0
1
12
6
Totalt antal
7
59
173
72
%
2,3
18,9
55,6
23,2
% (borttaget icke
19,4
56,9
23,7
bedömbar)
Totalt
73
73
73
73
19
311
100
100
Resultatet från bedömningen redovisas i tabell 1. I 19,4 % (59/304) bedömdes
färgintensiteten i vävnadskärnorna som svag, som måttlig i 56,9 % (173/304) och
som intensiv i 23,7 % (72/304). Jämförs dessa resultat med resultatet från Jörgren
et al. (17 % (18/104) svag, 62 % (64/104) måttlig och 21 % (22/104) intensiv
intensitet) [4] erhålls en korrelationskoefficient till r = 0,9997. Figur 1 visar på
hur bedömningen av färgintensiteten vid mikroskoperingen av vävnadskärnorna
har gått tillväga.
10
Figur 1. Bedömning och kategorisering av uttrycket ezrin i vävnader infärgat
immunhistokemiskt för ezrin (klon 3C12, Sigma®, 1:5000). Figuren demonstrerar
tumörvävnad som infärgats negativt (A), svagt (B), måttligt (C) och intensivt (D).
Bilderna tagna med 10x förstoring.
DISKUSSION
I denna studie analyserades uttrycket ezrin i tumörvävnad från patienter som inte
utvecklade lokalrecidiv efter primäroperation. Detta jämförs med resultatet som
Jörgren et al. [4] presenterat i en tidigare studie där enbart patienter som drabbats
av lokalrecidiv ingick. Mängden patienter som drabbas av lokalrecidiv har under
de senaste decennierna minskat, mycket tack vare förbättrade operationsmetoder
och neoadjuvanta behandlingar. Genom detta har den cancerspecifika
femårsöverlevnaden för rektalcancer stigit till över 60 % i Sverige [2].
Lokalrecidiv utgör likväl ett stort problem på grund av att det är svårbehandlat
och oftast resulterar i att drabbade patienter inte överlever, varför utvecklingen av
tillfredsställande kliniskt introducerade prognostiska vävnadsmarkörer är
önskvärd.
Metoddiskussion
TMA-tekniken är en väletablerad vetenskaplig metodik för analys av att stort
antal olika vävnader [1,9-10]. Tekniken är smidig och när väl förarbetet, som
upptar den mesta tiden, är genomfört fortlöper själva konstruktionen snabbt och
effektivt. Det allra viktigaste vid förarbetet är att morfologiskt representativa delar
av tumören väljs, eftersom dessa regioner är mest intressanta ur ett prognostiskt
perspektiv. Detta bör utföras av en erfaren patolog [9]. TMA-tekniken kan med
fördel även användas för att konstruera multiblock innehållandes olika vävnader
som kontrollmaterial vid immunhistokemisk analys [8]. Skulle något gå fel vid
själva konstruktionen går det att härleda varifrån vilken givarklots som vävnaden
__________________________________
1
Personlig kommunikation E Rambech (1)
11
är tagen från, allting sparas automatiskt i apparaturens dataprogram.
Informationen används därefter för underlag till efterarbetet vid
mikroskoperingen1. Immunhistokemi är en mångfasetterad teknik. Dels ger den
underlag till bekräftelse av den frågeställning som klinikern ställt, dels även ett
prognostiskt värde samt vilken behandling som ska bli aktuell för patienten.
Tillsammans med TMA-teknik är det möjligt att analysera ett stort antal
vävnadsprover tidseffektivt på ett överskådligt och produktivt sätt, där fokus av
analysen inte ligger på diagnostik. Immunhistokemi är emellertid en mycket
känslig metod där varje glas kan ses som en enskild färgning. De antikroppar som
produceras i dagsläget är såpass känsliga att de klarar av att identifiera epitoper
trots den rigorösa preparationsprocessen med formalinfixering (ev.) och
paraffininbäddning [11]. Då endast ett fåtal glas infärgas i denna studie, kan
samtliga analyseras med samma förutsättningar och utföras med exakt likadana
reagenser. Detta ger TMA-tekniken en fördel gentemot traditionella snitt där alla
glas inte hade kunnat färgas under samma dag. Dessa kan däremot vara mer
svårbedömda jämfört med traditionella snitt eftersom inte hela uppbyggnaden av
tarmkanalens vägg finns med, utan endast den utvalda tumörvävnaden. Därtill
består mottagarklotsen av olika tumörvävnader som gått igenom olika
dehydreringsprogram (givarklotsar från olika städer) vilket har till följd att
mottagarklotsarna blir mycket svårsnittade. Det är av hög vikt att komma ner helt
i samtliga vävnadskärnor vid grovsnittning för att undvika ett eventuellt bortfall
till analysen. Saknas det vävnadskärnor vid analysen beror det med största
sannolikhet på att grovsnittningen inte utförts tillräckligt djupt. Trots att två
borrkärnor per tumörvävnad används i studien erhålls arrayer (7) som icke är
bedömbara. För att motverka detta problem kan tre borrkärnor göras per
tumörvävnad [9]. Tumörheterogeniteten i två borrkärnor bedöms dock adekvat
motsvara den från ett helt, traditionellt, histologiskt snitt [8].
Storleken på den urstansade vävnadskärnan kan varieras. Att en 1 mm stans
valdes med 1,6 mm mellanrum i matrisen berodde på en högst personlig
uppfattning att det ger en behaglig mikroskopering. Vid konstruktionen av
matrisen designas den så att hålen inte görs hela vägen ut på mottagarklossen.
Detta dels för stabiliteten för klotsen, dels för att ha en yta med paraffin att ta och
överföra snitten med pincett till objektglas vid snittningen.
För att förhålla sig objektivt vid mikroskoperingen finns ingen patientdata
tillgänglig vid bedömning av färgintensiteten. Råder skiljaktigheter i
bedömningen diskuterades varje fall i samförstånd tills ett fastställande kan göras.
Denna form av bedömning är dock högst subjektiv. Figur 1 visar ett typexempel
där det med enkelhet går att bedöma intensiteten, men i många fall var det svårt
att bedöma infärgningen, särskilt gällande kategorierna måttlig och intensiv.
Därför är det rekommenderat att minst två oberoende arbetslag bedömer
färgintensiteten vid separata tillfällen. Den statistiska analysen kommer att utföras
i maj månad efter det att en utbildad patolog mikroskoperat och bedömt arrayerna.
Därefter sker en multivariat statistik analys. Målet är att projektets resultat ska
utmynna i en publikation som ska insändas till en vetenskaplig tidskrift.
Resultatdiskussion
Det önskvärda resultatet skulle påvisa ett signifikant mindre uttryck av ezrin i
vävnaderna som ingick i denna studie jämfört med resultat från den tidigare
studien. Baserat på bedömningen av färgintensiteten är ezrin inte en
tillfredställande markör för att prognostisera tiden för utveckling av lokalrecidiv
12
gällande rektalcancer. Det föreligger ingen skillnad i uttrycket av ezrin mellan den
tidigare studien, som innehöll patienter som drabbats av lokalrecidiv, och denna
studie, där endast patienter som inte uppvisade lokalrecidiv eller några metastaser
inom uppföljningsperioden fem år efter primäroperationen ingick. Det föreligger
en stark korrelation mellan resultaten. Först efter att en patolog granskat arrayerna
och analyserat färgintensiteten skall den statistiska analysen genomföras. När den
är genomförd går det att med säkerhet uttala sig om den prognostiska funktionen
för ezrin.
Samtidigt konstaterade Jörgren et al. [4] att den enda potentiella riskfaktorn (högt
uttryck av ezrin, ålder, kön, tumörstadium, differentieringsgrad samt pre- och
postoperativ radioterapi) som signifikant förevisade tiden för utvecklade av
lokalrecidiv efter primäroperationen var ett högt uttryck av ezrin. Ett högt uttryck
av ezrin visade att tiden för utveckling av lokalrecidiv var betydligt kortare än hos
patienter med lågt uttryck av ezrin [4].
Den tidigare studien av Jörgren et al. [4] undersökte även om radioterapi
påverkade uttrycket av ezrin i vävnaden. Neoadjuvant behandling i form av
radioterapi genomgick 26/109 av patienterna. Material från provexcisioner (innan
radioterapi) analyserades mot utskuret biopsimaterial från operationspreparat där
patienten bestrålats för att utforma en komparativ analys. Resultatet visade att
uttrycket av ezrin var oförändrat i 50 % (13/26) av fallen, att uttrycket ökade i 27
% (7/26) av fallen och att det minskade i 23 % (6/26) av fallen [4]. Baserat på
resultatet förefaller radioterapi ha liten eller ingen förändring på uttrycket av ezrin
i vävnaden. Samtidigt rapporterar Korkeila et al. [5] att det fanns en signifikant
skillnad i uttryck av ezrin mellan px och utskuret biopsimaterial för patienter som
fått preoperativ radioterapi. Neoadjuvant eller adjuvant radioterapi har bevisats
reducera risken för lokalrecidiv och bidrar därmed till en ökad överlevnad [1,19].
Exakta kriterier för vilka patienter som skall genomgå neoadjuvant behandling
finns för närvarande dock inte [3].
Ezrin har en stark association till dålig prognos i ett flertal olika cancerformer,
bland annat i ovarialcancer, maligna melanom och osteosarkom. Därtill har ett
högt uttryck av ezrin kopplats till sämre överlevnadsprognos i kolorektalcancer
[4-5,12]. Därför utförs det för nuvarande många studier som syftar till att framta
ett läkemedel som skall inhibera förmågan av ezrin eller någon av dess
regulatorer, som Akt2. Bulut et al. [20] rapporterar om molekylerna NSC668394
och NSC305787 som verkar inhiberande på effekten av aktiverat ezrin. Detta
genom defosforylering av ezrin vilket får ezrin att återgå till sin inaktiverade
formation [6,20]. MK-2206 är en allosterisk inhibitor av Akt och verkar genom
inbindning till Akt och därigenom hindrar dess aktivering. MK-2206 verkar även
pro-apoptotiskt genom inaktivering av ezrin och därmed förlust av proteinet XIAP
(X-linked Inhibitor of Apoptosis). XIAP utövar sin funktion genom inbindning till
caspaser vilket därmed inhiberar deras förmåga till apoptos. Dessutom påvisade
Agarwal et al. [16] en minskning av fosforylerat Bad (pBad) vid behandling med
MK-2206. pBad interagerar med proteinfamiljen 14-3-3 som verkar antiapoptotiskt. En minskad interaktion indikerar en minskning av cellöverlevnad.
Det framkom även att Bad interagerade mindre med 14-3-3 vilket föreslår att Bad
kan utföra sin apoptotiska funktion av tumörceller [16].
13
KONKLUSION
Studiens framtida värde kan komma att innebära att en behandlingsform som är
anpassad för den enskilde patienten kan skräddarsys, till exempel genom tidigare
initiering av neoadjuvant behandling i form av radioterapi eller flera omgångar av
postoperativ kemoterapi. Gällande denna studie går det inte att uttala sig om den
prognostiska funktionen av ezrin innan den statistiska analysen är genomförd och
aspekter som överlevnad är inberäknade.
Analys av uttrycket ezrin i vävnadsmaterial kan, tillsammans med
datortomografisk undersökning, utgöra ett viktigt hjälpmedel för att i ett tidigare
stadium identifiera patienter med en högre föreliggande risk att utveckla
lokalrecidiv.
ACKNOWLEDGEMENTS
Jag vill framföra ett stort tack till samtliga som hjälpt mig under detta
examensarbete. Till Gudrun Lindmark för att jag fick möjligheten att utgöra en
del i projektet. Till handledare för studien Gudrun Lindmark (professor,
överläkare kolorektal kirurgi, Helsingborgs lasarett) och delhandledare Fredrik
Jörgren (biträdande överläkare kolorektal kirurgi, Helsingborgs lasarett). Till Eva
Rambech (laboratorieingenjör) för introduktion till TMA-tekniken och
rundvisning på Medicon Village i Lund. Till övrig personal i byggnad 404 på
Medicon Village för det vänliga bemötandet. Till Gabriela Enggren och Frida
Johansson för värdefull feedback.
14
REFERENSER
1. Jörgren F, (2010) Risk Factors of Tumour Recurrence and Reduced
Survival in Rectal Cancer. Lund University: Lund.
2. Påhlman L, Bohe M, Cedermark B, Dahlberg M, Lindmark G, Johansson
R, (2007) The Swedish Rectal Cancer Registry. British Journal of
Surgery, 94 (10), 1285-1292.
3. Regionala cancercentrum i samverkan, (2008) Nationellt vårdprogram för
kolorektalcancer.
>http://www.cancercentrum.se/sv/Vardprogram/Kolorektalcancer/<
(2015-03-31)
4. Jörgren F, Nilbert M, Rambech E, Bendahl P, Lindmark G, (2012) Ezrin
expression in rectal cancer predicts time to development of local
recurrence. International Journal of Colorecetal Disease, 27(7), 893- 899.
5. Korkeila E, Syrjänen K, Bendardaf R, Laulajainen M, Carpén O, Pyrhönen
S, Sundström J, (2011) Preoperative radiotherapy modulates ezrin
expression and its value as a predictive marker in patients with rectal
cancer. Human Pathology, 42, 384-392.
6. Elzagheid A, Korkeila E, Bendardaf R, Buhmeida A, Heikkilä S, Vaheri A,
Syrjänen K, Pyrhönen S, Carpén O, (2008) Intense cytoplasmic ezrin
immunoreactivity predicts poor survival in colorectal cancer. Human
Pathology, 39, 1737-1743.
7. Leiphrakpam P, Rajput A, Mathiesen M, Agarwal E, Lazenby A, Are C,
Brattain M, Chowdhury S, (2014) Ezrin expression and cell survival
regulation in colorectal cancer. Cellular Signaling, 26, 868-879.
8. Van Zwieten A, (2013) Tissue microarray technology and findings for
diagnostic immunohistochemistry. Pathology, 45(1), 71-79.
9. Fernebro E, Dictor M, Bendahl P, Fernö M, Nilbert M, (2002) Evaluation
of the Tissue Microarray Technique for Immunohistochemical Analysis in
Rectal Cancer. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 126, 702705.
10. Kallioniemi O, Wagner U, Kononen J, Sauter G, (2001) Tissue microarray
technology for high-throughput molecular profiling of cancer. Human
Molecular Genetics, 10(7), 657-662.
11. Carson F L, Hladik C, (2009) Histotechnology: A Self-Instructional Text.
Chicago, Illinois: American Society for Clinical Pathology Press, s 278289.
12. Wang H, Zhu J, Zhang Q, Sun Q, Guo H, (2009) High level of ezrin
expression in colorectal cancer tissues is closely related to tumor
malignancy. World Journal of Gastroenterology, 15(16), 2016-2019.
15
13. Hunter K, (2004) Ezrin, a key component in tumor metastasis. TRENDS in
Molecular Medicine, 10(5), 201-204.
14. Martin T, Harrison G, Mansel R, Jiang W, (2003) The role of the
CD44/ezrin complex in cancer metastasis. Critical Reviews in
Oncology/Hematology, 46, 165-186.
15. Ohtani K, Sakamoto H, Rutherford T, Chen Z, Satoh K, Naftolin F, (1999)
Ezrin, a membrane-cytoskeletal linking protein, is involved in the process
of invasion of endometrial cancer cells. Cancer Letters, 147, 31-38.
16. Agarwal E, Chaudhuri A, Leiphrakpam P, Haferbier K, Brattain M,
Chiwdhury S, (2014) Akt inhibitor MK-2206 promotes anti-tumor activity
and cell death by modulation of AIF and Ezrin in colorectral cancer. BMC
Cancer, 14(145), 1-12.
17. Mitogen Ltd (2008) Minicore® 3 Tissue Arrayer Manual. Harpenden,
England: Mitogen.
18. DAKO A/S (2011) DAKO REAL™ EnVision™ FLEX high pH Manual.
Glostrup, Danmark: Dako.
19. Folkesson J, Johansson R, Påhlman L, Gunnarsson U, (2005) Swedish
Rectal Cancer Trial: long lasting benefits from radiotherapy on survival
and local recurrence rate. Journal of Clinical Oncology, 23(5), 644-650.
20. Bulut G, Hong S, Chen K, Beauchamp E, Rahim S, Kosturko G, Glasgow
E, Dakshanamurthy S, Lee H, Daar I, Toretsky J, Khanna C, Uren A,
(2012) Small molecule inhibitors of ezrin inhibit the invasive phenotype of
osteosarcoma cells. Oncogene, 31(3), 269-281.
16
BILAGA 1
Nedan följer det fullständiga protokollet för immunhistokemisk färgning för ezrin
på DakoCytomation DAKO AutostainerPlus. Alla reagenser samt utrustning
kommer från DAKO A/S (Glostrup, Danmark), såvida inget annat anges.
Steg 1-6 respektive 20-21 utförs manuellt, medan steg 7-19 utförs maskinellt.
Färgningsmaskinen programmerades att tillsätta reagenser till två stycken
droppzoner på glaset där 150 µl tillsätts till varje zon (300 µl totalt).
1. 4 µm tjocka snitt erhålls och överförs till objektglas DAKO FLEX IHC
Microscope Slides K8020. Glasen står i rumstemperatur över natten för att
torka.
2. Glasen torkas ytterligare i 60 °C i 1-2 timmar. Detta för att snitten skall
fästa vid objektglasen bättre.
3. Glasen placeras i xylen (Histolab, Göteborg, Sverige) i 2x5 minuter för
avparaffinering av snitten.
4. Snitten rehydreras genom att placera glasen i en serie med fallande
alkoholkoncentration, 99,5 % etanol → 95 % etanol (Solveco, Rosersberg,
Sverige), till dH2O i vardera 5 minuter.
5. Glasen sätts i kyvett innehållande Target Retrieval Solution pH 9 S2367.
Kyvetten med glasen sattes i tryckkokare (2100 Retriver, Histolab,
Göteborg, Sverige) innehållande 750 ml dH2O och behandlades i 1 timme
(gärna i 2 timmar). Behandlingen demaskerar antigenen och medför att
antikropparna kan komma till och binda in, så kallad antigen retrival.
Glasen sköljdes därefter i flera omgångar dH2O.
6. Glasen monteras i färgningsmaskinen och Wash buffer droppas på glasen
för att förhindra intorkning av snitten.
7. Buffer rinse (sköljbuffert) tillsätts för tvättning.
8. HP-block tillsätts som blockerar vävnadens endogena peroxidasaktivitet
(HRP-aktivitet) för att det bundna enzymet skall vara stabilt, vilket ger en
minskad bakgrundsfärgning. Inkubationstiden är 5 minuter.
9. Tvättning med buffer rinse.
10. Primär antikropp tillsätts som binder till antigener i vävnadssnittet.
Inkubationstiden är 30 minuter. Därefter tvättning med buffer rinse.
11. Enzymmärkt sekundär antikropp, EnVision, tillsätts vilket binder in till
den primära antikroppen. Inkubationstiden är 25 minuter.
12. Tvättning med buffer rinse i två omgångar.
13. Kromogenen DAB+ tillsätts. Inkubationstiden är 5 minuter.
14. Ytterligare en omgång med DAB+ tillsätts. Inkubationstiden är även här 5
minuter.
15. Glasen sköljs med dH2O och tvättas med buffer rinse.
16. Hematoxylin (C.I. 75290) tillsätts för motfärgning. Inkubationstiden är 5
minuter.
17. Glasen sköljs med dH2O.
18. Behandling med en lösning bestående av H2O och Triton för att reducera
ytspänning samt för permeabilisering av cellmembran. Inkubationstiden är
5 minuter.
19. Glasen sköljs med dH2O.
20. Glasen sköljs med rinnande kranvatten i 10 minuter.
21. Dehydrering av snitten genom en stigande alkoholkoncentration, 95 %
etanol → 99,5 % etanol, till xylen. Därefter montering av glasen med
Pertex (Histolab, Göteborg, Sverige) [18].
17