Laboration 3a. Undersökning av proteaser
Del 1
Syfte:
Ta reda på i vilka frukter det finns proteaser.
Metod:
Gör en gelatinlösning, häll den på en bricka och låt den stelna i kylen. Använd så mycket
gelatin att gelén blir hård. Lägg därefter valda frukter och bär på gelén. Låt stå en stund.
Frågor:
Vad är huvudbeståndsdelen i geatin?
Hur har man framställt gelatin?
Vilka frukter innehåller proteas?
Vad bildas i reaktionen med proteas?
Del 2
Syfte:
Ta reda på om det finns någon skillnad i aminosyrainnehåll i olika proteinhaltiga ämne som
hår, spindelväv, brosk och olika matvaror. Välj tre ämnen.
Metod:
Placera ut varje ämne på tre urglas. Den ena omgången är referens och till den sätts endast lite
vatten. Till den andra omgången sätts saften från en lämplig frukt och till den tredje en
vattenlösning av ett enzymhaltigt tvättmedel. Sönderdelningen tar cirka 15 minuter. Använd
ytterst lite vatten vid sönderdelningen.
Blanda till kromatografivätska bestående av tre delar etanol, en del vatten och en del
koncentrerad ammoniak. Häll i ett lämpligt kärl i dragskåp och täck över. Låt kärlet därefter
stå alldeles stilla.
Applicera lite av lösningarna på tunnskiktsplattor som små punkter cirka 2 cm från kortsidan.
Till varje ämne används en platta, dvs tre punkter per platta, referens, fruktbehandlad och
tvättmedelsbehandlad.
Sätt ner plattorna i kromatografikärlet. Täck över och låt stå cirka tre timmar.
Utvärdera resultatet.
Laboration 3b. Succinatdehydrogenas
Teori
Succinatdehydrogenas är ett enzym som ingår i citronsyracykeln. Det katalyserar övergången
mellan succinat och fumarat (eller bärnstenssyra och fumarsyra). Enzymet behöver för sin
funktion coenzymet FAD
CH2
COOH
+
CH
COOH
FAD
+ FADH2
CH
HOOC
Ett sätt att studera aktiviteten hos enzymet är att använda metylenblått som väteacceptor i
stället för syre. Metylenblått övergår från sin blåa, oxiderade form till sin ofärgade,
reducerade form.
Genom att bestämma tiden för avfärgningen får man ett mått på enzymets aktivitet. För att det
ska vara möjligt får enzymlösningen inte komma i kontakt med syre.
CH2
COOH
Syfte: Studera hur enzymet succinatdehydrogenas fungerar och hur malonsyra verkar på detta
enzym.
Materiel:
Provrör, termostatbad 40 grader, tidur, pipetter
Kemikalier:
0,1 M natriumdivätefosfat, 0,1 M dinatriumvätefosfat, 0,1-procentig metylenblått löst i etanol,
0,2 M natriumsuccinatlösning, 0,4 M malonsyra, jästsuspension (20 g jäst slammas upp i 100
ml dest vatten)
A. Framställning av 100 ml fosfatbuffert pH 7,2 (pKa för divätefosfatjonen är 7,21)
B. Utförande av försöket
Gör i ordning 4 numrerade provrör med det innehåll som tabellen nedan visar. Skaka
provrören och placera dem i ett vattenbad med temperaturen cirka 40 grader.
Tillsätt ett 2 cm tjockt skikt av paraffinolja så snabbt som möjligt i alla provrören.
Mät tiden från tillsatsen av oljan tills avfärgning sker. (Ta inte hänsyn till den avfärgning som
sker närmast under oljan eftersom man kan anse att lite syre kan diffundera in hit.)
Förklara resultatet!
Provrör nr
Buffert (ml)
Vatten (ml)
Na-succinat (ml)
Malonsyra (ml)
Metylenblått (ml)
Jästsuspension (ml)
Kokad jästsusp. (ml)
1
0,5
2,5
0,5
0,5
0,5
-
2
0,5
2,0
0,5
0,5
0,5
0,5
-
3
0,5
2,5
0,5
0,5
0,5
-
4
0,5
2,5
0,5
0,5
0,5
Frågor:
Jämför formlerna för malonat och succinat. Vilken roll spelar malonat i försöket?
Vad skulle skett om man uteslutit paraffinoljan?
Vad tror du skulle hänt om du ätit stora mängder malonsyra?
