Dnr 110024
Cellbaserad behandling av det skadade innerörat
Slutrapport 2015
Prof. Mats Ulfendahl
Institutionen för neurovetenskap
Karolinska Institutet
Inledning
Hörselnedsättning orsakad av skador i innerörat kan endast i begränsad omfattning
kompenseras av hörapparater, som i princip endast förstärker och filtrerar det inkommande
ljudet. Fungerande hörselsinnesceller, s.k. hårceller, och nervceller i innerörat är en
förutsättning för normal hörsel. Skadade hörselceller kan idag, med förvånansvärt gott
resultat, ersättas av en inopererad protes, ett s.k. cochleaimplantat. I cochleaimplantat tas
ljudet från en högtalare till en elektrod som direkt stimulerar innerörats nervceller. Funktionen
hos cochleaimplantat är beroende av en tillräckligt stor population av kvarvarande nervceller
samt en effektiv elektrisk stimulering. Omfattande forskning bedrivs i syfte att antingen
behandla innerörat så att hörsel- och nervceller överlever efter en skada eller skapa underlag
för en cellterapi där skadade celler kan ersättas med nya, implanterade celler. I det aktuella
projektet har vi arbetat med att studera vilken skyddsfunktion som erhålls av substanser
frigjorda från olika celltyper, hur sinnesceller kan deriveras från stamceller, interaktionen
mellan olika exogena celler och celler från innerörat samt bidra till utvecklingen av en
elektrod i vilken celler som frisätter aktiva substanser integreras (encapsulated cells).
Arbetshypotesen i projektet har varit att en cellbaserad behandling kan bidra till att, efter en
skada, bibehålla en population av fungerande celler i innerörat. Detta visar vi också i ett av de
arbeten som baseras på det projekt som stötts av AFA Försäkring (Fransson et al., 2015).
Arbetet i projektet inriktades initialt på att dels ta fram lämpliga celler för transplantation till
innerörat (Ali et al. 2014). Därefter inleddes ett långsiktigt arbete att med utgångspunkt från
humana embryonala stamceller utveckla implanterbara nervceller motsvarande de som
normalt finns i nervsystemets perifera delar och i innerörat (Ali et al. 2015). Parallellt har vi
testat dels hur effektivt faktorer frisatta från olika typer av odlade celler stimulerar tillväxt hos
andra celler och dels hur olika kandidatceller interagerar med innerörats vävnad (in vitro)
(Dash-Wagh, opubl.). Under projektets senare del har arbetet fokuserat på tester i vår
djurmodell av en biolelektrod där s.k. encapsulated cells frisätter aktiva skyddssubstanser.
Utöver projektledaren har projektgruppen huvudsakligen bestått av forskaren Suvarna DashWagh, ansvarig för in vitro-studierna, forskaren Anette Fransson, som huvudsakligen arbetat
med de djurexperimentella delarna av projektet, och doktoranden Rouknuddin Ali, som
utvecklat olika kandidatceller för transplantation. I de delar som rör in vitro-arbetet har också
en student, Lovisa Franzén, och en gästforskare, dr. Ibtihel Smeti, deltagit. Vi har liksom
tidigare ett nära samarbete med professor Lars Ährlund-Richter (Karolinska Institutet) när det
gäller embryonala stamceller och med dr. Jens Tornøe och dr. Lars Wahlberg (NsGene A/S,
Danmark) kring s.k. encapsulated cells och utvecklingen av bioelektroden. Nyligen inleddes
också ett samarbete med docent Anna Falk (Karolinska Institutet) för att få tillgång till en
speciell typ av humana stamceller.
Prof. Mats Ulfendahl, Karolinska Institutet (Slutrapport 2015)
Uppnådda resultat i projektet
Utveckling av celler lämpliga för transplantation till innerörat
För att få lämpliga celler för transplantation till innerörat har vi arbetat med att utveckla ett
protokoll för att ta fram nervcellsliknande celler från humana embryonala stamceller (Figur
1).
Figur 1. Schematisk illustration
över de olika protokoll som
testats för att inducera
bildningen av sensoriska
nervceller. (Ali et al. 2014)
Cellerna var immunoreaktiva för såväl nestin, en vanligt markör för neuronala
progenitorceller, som Tuj1, en tidig markör för nervceller (Figur 2). Förekomsten av nestin
och Tuj1 minskade gradvis när immunoreaktiviteten för perferin, en markör för sensoriska
nerverceller, samt TrkB och TrkC ökade (Figur 3). Immunohistokemiska studier och PCRanalys indikerar att ett visst protokoll ger celler som bör vara mer lämpliga för
transplantation.
Figur 2. Celler (s.k. neuronal rozettes) deriverade från
humana embryonala stamceller märkta med antikroppar
mot Tuj1 (grönt), en tidig markör för neuronala celler.
Cellkärnorna är märkta med DAPI (blått). Samma celler
är också positiva för nestin (visas ej här), vilket visar att
de är progenitorceller. Skalstrecket är 50 µm. (Ali et al.,
opubl.)
Figur 3. Expressionen av
perferin, TrkB och TrkC i
olika cellpopulationer.
(Real time PCR ; Ali et
al., opubl.)
2 (7)
Prof. Mats Ulfendahl,
ahl, Karolinska Institutet
Institute (Slutrapport 2015)
Med utgångspunkt från det beskrivna arbetet har vi försökt öka andelen celler med en lämplig
fenotyp för implantation genom att påverka olika signalvägar, exempelvis för att stimulera
differentiering (Figur 4-5).
Figur 4.. Blockering av signalvägen TGF-β
TGF
(med molekylen SB431542;
SB431542 SB)
resulterade i ett ökat uttryck av
transkriptionsfaktorn GATA3 i celler
deriverade från humana embryonala
stamceller. (Ali et al., opubl.)
opubl.
Figur 5. Immunohistokemisk märkning för markörer för sensoriska nervceller. De neuroepiteliala
stamcellerna behandlades med s.k. small molecules (ISX9,isoxazole 9, och SB431542;
SB431542 två molekyler
som stimulerar nybildning av nervceller samt blockerar
bl
signalvägen TGF-β). Skalstrecket är 20
2 µm (Ali
et al. 2015)
3 (7)
Prof. Mats Ulfendahl, Karolinska Institutet (Slutrapport 2015)
Frisatta substanser med effekt på målvävnaden (conditioned media)
En betydande del i projektet har varit att studera effekten av de faktorer olika typer av celler
(exv. från hörselsystemet eller stamceller) frisätter. Utöver att använda detta i försök att
påverka olika cellpopulationer ger den typen av experiment en möjlighet att indentifiera
specifika substanser som skulle kunna användas för läkemedelsutveckling. I försöken odlades
cellerna in vitro och odlingsmediet, s.k. conditioned medium, samlades upp vid olika
tidpunkter. Detta conditioned medium tillfördes sedan andra celler (in vitro) och effekten på
tillväxt och överlevnad studerades.
I en serie försök med ett ett modellsystem baserat på SH-SY5Y-celler har vi undersökt hur
substanser frisatta in vitro från hörselorganet respektive spiralgangliet påverkar utväxt av
nervcellsutskott, neuriter. Resultaten visar att conditioned medium från innerörats vävnader
har en positiv effekt på utväxten av nervcellsutskott (Figur 6).
Figur 6. Utväxt av nervcellsutskott stimuleras av conditioned medium från hörselorganet (OCCM) och
spiralgangliet (SGNCM). Till vänster ses AH-AY5Y-celler som odlats i närvaro av condition medium.
Pilarna visar att det bildas längre utskott jämfört med kontrollen. Utskottens längd var signifikant större
i närvaro av båda typerna av conditioned medium (höger). (Dash-Wagh, opublicerat.)
Conditioned medium från hörselsystemets vävnader användes också för att undersöka
eventuell påverkan på neuronal differentiering av omogna celler deriverade från humana
embryonala stamceller. Här har vi kunnat visa en effekt på differentiering mot
nervcellsliknande celler av faktorer frisatta från det perifera hörselsystemet (hörselorganet och
spiralgangliet) men inte av conditioned medium från hjärnstammen. Cellöverlevnaden ökade,
vilket visar att vävnaden frisätter också trofiska faktorer. Alla tre typer av conditioned
medium hade en positiv effekt på nervcellsutskottens tillväxt (Figur 7).
Figur 7. Stimulering av utväxt av närvcellsutskott från
differentierade neuronala progenitorceller (deriverade
från humana embryonala celler) i närvaro av
conditioned medium från hjärnstammen (BSCM),
hörselorganet (OCCM) och spiralgangliet (SGNCM). En
tydlig och signifikant effekt på nervcellsutskottens längd
sågs speciellt i närvaro av conditioned medium från
spiralgangliet (SGNCM). (Dash-Wagh et al.,
opublicerat.)
4 (7)
Prof. Mats Ulfendahl, Karolinska Institutet (Slutrapport 2015)
Utveckling av en bioelektrod
Framtagandet av en implanterbar kombination av en
stimuleringselektrod och celler med effekt på målvävnaden, en
s.k. bioelektrod, har varit ett av projektets huvudsyften. Detta
har skett i nära samarbete med det danska företaget NsGene och
innefattat såväl in vitro- som in vivo-försök (se nedan).
Tekniken baseras encapsulated cells, d.v.s celler inneslutna i en
kapsel med ett semipermeabelt membran som medger
frisättning av substanser samtidigt som cellerna hålls på plats.
In vitro-försöken har syftat till att både testa de substanser som
frisätts från de cellinjer som används (Figur 8) och direkt testa
effekten av att kombinera de inkapslade cellerna (i en speciell
struktur, ”device”) på vävnad från hörselorganet (Figur 9-10).
Figur 8. Utväxt av nervcellsutskott från
spiralgangliet (in vitro) efter behandling
med conditioned medium från en celltyp
som utsändrar tillväxtfaktorn BDNF (två
olika koncentrationer, 10 och 50 ng/ml).
(Dash-Wagh et al., opublicerat)
Figur 9. Tillväxtfaktorer från
encapsulated cells i ”devices”
stimulerade överlevnad av celler från
innerörat. I dessa försök sågs speciellt
god effekt av BDNF. (Dash-Wagh,
opublicerat)
Figur 10. Faktorer frisatta från en ”device” (med encapsulated cells) placerad i samma vävnadskultur
som celler från hörselorganet stimulerade såväl utväxt av nervcellsutskott (neurites) från spiralgangliet
(in vitro) som deras längd. Tydligast effekt sågs med BDNF. (Dash-Wagh et al., opublicerat)
5 (7)
Prof. Mats Ulfendahl, Karolinska Institutet (Slutrapport 2015)
En omfattande serie försök har gjorts där en ”device” med inkapslade celler placerats i
marsvinets hörselorgan samtidigt som en stimuleringselektrod implanterats (Figur 11).
Härigenom har det varit möjligt att studera huruvida de faktorer som frisätts från de
inkapslade cellerna har förmåga att skydda hörselorganets celler från fortsatt degeneration
orsakad av en experimentell hörselskada (i marsvinsmodellen dövgörs djuren kemiskt före
implantationerna). Försöken har varit mycket lyckade och tydligt visat både överlevnad och
bibehållen funktionalitet i form av elektrisk retbarhet (Figur 12).
Figur 11. Vänster: En fripreparerad hörselsnäcka från
marsvin (cochlea). I nedre delen ses änden på en ”device”
(vänster) samt stimuleringselektroden (höger).
Nedan: En tvärsnittad ”device” med GDNF-frisättande
celler (encapsulated cells).
(Fransson et al., opubl.)
Figur 12. Resultat från in vivo-försök med inkapslade celler. Den vänstra bilden visar hur elektriska
trösklar förändrades efter dövgörning (Vecka 0) och implantation (Vecka 3) av en ”device”
innehållande antingen inga celler alls (”Empty device”) eller celler frisättande BDNF eler GDNF. I
kontrollsituationen (utan tillväxtstimulering) stiger trösklarna (d.v.s. djuret hör sämre) som förväntat
medan i närvaro av i synnerhet GDNF så hålls de på en signifikant (p<0,05) lägre nivå. Detta innebär
att hörselsnäckans elektriska retbarhet är bibehållen, d.v.s. en bevarad funktionalitet. Till höger
illustreras att antalet celler (densiteten) också var högre i inneröronen hos de djur som implanterats
med ”devices” som frisätter tillväxtfaktorer. (Fransson et al. 2015)
6 (7)
Prof. Mats Ulfendahl, Karolinska Institutet (Slutrapport 2015)
Avvikelser i projektet utifrån projektbeskrivningen
Projektet har till största delen genomförts enligt den ursprungliga planen. Initialt var avsikten
att i vår djurmodell testa om implanterade celler deriverade från humana stamceller kunde,
genom sin fysiska närvaro i vävnaden eller genom frisatta substanser, bidra till att reparera
skadade celler. De försöken har endast i begränsad omfattning kunnat göras p.g.a. svårigheter
att dels få god överlevnad av implanterade celler och dels tekniska problem att vid den
histologiska analysen med tillräckligt stor säkerhet kunna särskilja implanterade celler från
värddjurets egna celler. Projektets arbetshypotes, att en cellbaserad behandling kan bidra till
att bibehålla en population av fungerande celler i det skadade innerörat har dock bevisats
genom våra avslutande djurförsök (Fransson et al., 2015).
Insatser som skett och planeras för att resultatet ska komma till praktisk
användning i arbetslivet
Resultaten har rapporterats vid vetenskapliga konferenser och har eller kommer att publiceras
på sedvanligt vis. Genom vårt samarbete med det danska företaget NsGene och den
europeiska cochleaimplantattillverkaren MedEl säkerställs att resultaten tas vidare i studier
som i ett längre tidsperspektiv har möjlighet att komma till praktisk nytta i sjukvården och
därmed bidra till rehabilitering av yrkesverksamma individer med hörselskador.
Vetenskapliga rapporter baserade på projektets resultat
Ali RQ, Blomberg E, Falk A, Ährlund-Richter L, Ulfendahl M (2015) Induction of sensory
neurons from neuroepithelial stem cells by the ISX9 small molecule. Submitted to
American Journal of Stem Cells.
Ali R, Cheng Y, Kostyszyn B, Ährlund-Richter L, Ulfendahl M (2014) Differentiation of
human embryonic stem cells towards a sensory neural phenotype. Advances in Stem
Cells, Vol. 2014, Article ID 252491, DOI: 10.5171/2014.252491
Dash-Wagh S, Ali RW, Ärhlund-Richter L, Ulfendahl M (2015) Influence of target tissue on
survival and differentiation of neurons derived from HES cells. In preparation.
Fransson A, Tornøe J, Wahlberg L, Ulfendahl M (2015) Preservation of auditory neuron
function by an encapsulated cell device implanted in the deafened guinea pig. In
preparation.
7 (7)
