Sluttentamen med svarsmallar Bke2/KE0003, 29:e Oktober 2003, 0900 - 1500.
Max poäng = 94 p. Preliminär gräns för godkänd = 50 p (53 %).
1. Utan biologiska membran skulle inget liv kunna existera.
a) Beskriv med en enkel skiss uppbyggnaden av ett biologiskt membran. (1p)
b) Ge två exempel på energialstrande processer där biologiska membran är av central
betydelse. (1p)
c) Vad kallas den drivande kraften som gör att membraner hålls ihop (och som gör att
proteiner veckar sig) (1p)? Hur fungerar den (1p)?
(4p)
Svarsmall:
a) Membranfigur: Dubbellager, hydrofila huvuden utåt, hydrofoba svansar inåt (1p).
b) Membranet har en central betydelse vid oxidativ fosforylering (0.5p) och vid
fotosyntes (0.5p).
c) Hydrofoba effekten (1p). Hydrofoba delar av t.ex. lipider eller proteiner klumpar
ihop sig med varandra för att undgå kontakt med vatten (1p).
2. Proteinstruktur.
a) Proteiners struktur kan beskrivas i fyra nivåer, primär, sekundär, tertiär och
kvartenär. Förklara kortfattat vad som avses med respektive begrepp (4p).
b) Ge exempel på en aminosyra som oftast är gömd inuti proteinet och en annan som
oftast förekommer på utsidan. Vilken egenskap är viktigast för var en viss aminosyra
brukar förekomma? (2p)
(6p)
Svarsmall:
a) Primärstruktur är aminosyrasekvensen (1p). Sekundärstruktur bildas när avsnitt av
polypeptidkedjan veckar ihop sig med regelbundna vätebindingar i sekundärstrukturelementen alfa-helix, beta-sträng, beta-böj (1p). Tertiärstruktur beskriver hela
polypeptidkedjans veckning, hur sekundärstruktur-element och sidokedjor är packade
(1p). Kvartenärstruktur beskriver hur subenheterna sitter ihop i ett oligomert
protein/proteinkomplex (1p).
b) Inuti hittar man t.ex. Trp, Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, Ala, Met, Cys (0.5p); utanpå ofta
Arg, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln (0.5p). Det som avgör är hur polär/hydrofil
(eller opolär/hydrofob) aminosyran är (1p).
3. Du tänker dig att rena proteinet P med hjälp av bl.a. jonbyteskromatografi.
a) Du har som första steg i reningsproceduren fällt ut P med en 60 % lösning av
ammoniumsulfat. Varför är det viktigt att först dialysera bort ammoniumsulfatet från
P innan du laddar det på en jonbytare? (2p)
b) Proteinet P visar sig binda till en positivt laddad jonbytare (anjonbytare) i en
buffert som har pH 7.8. När du repeterar försöket några dagar senare tar du av misstag
fel buffert och kör nu samma jonbytarkolonn vid pH 6.0 varvid det visar sig att ditt
protein inte binder. Förklara varför. (Vad säger resultaten om egenskaperna hos
proteinet P?) (2p)
(4p)
Svarsmall:
a) I jonbyteskromatografi binds normalt molekylerna till jonbytaren vid låg jonstyrka
(1p). Om provet vid försökets start innehåller hög koncentration av andra joner
konkurrerar dessa med tillgängliga ligander (1p). Resultatet blir att P inte binder till
jonbytaren.
Sidan 1 av 8
b) Vid pH 7.8 bör P ha en negativ nettoladdning då det binder till en positiv ligand.
Proteiner som har en negativ nettoladdning befinner sig över sin isoelektriska punkt
(1p). När pH sänks protoneras P och resultatet tyder på att proteinet antingen är
oladdat eller positivt nettoladdat vid pH 6.0 (1p). P:s isoelektriska punkt bör alltså
ligga mellan 6.0 och 7.8.
4. Hemoglobin.
a) Vilken prostetisk grupp finns i hemoglobin? (0.5p)
b) Syre binder till en metalljon i denna grupp. Vilken metalljon? (0.5p)
c) Beskriv kortfattat vad positiv kooperativitet innebär, hur det uppkommer hos
hemoglobin och vad mekanismen kallas. (2p)
d) Myoglobin är mycket likt hemoglobin, men uppvisar inte positiv kooperativitet i
binding av syre. Varför? (1p)
e) Två histidiner utgör ligander till den prostetiska gruppen, metallen och syret.
Histidin deltar också i katalytiska mekanismen hos många enzymer. Vilken egenskap
hos histidin gör denna aminosyra särskilt lämpad för detta? (1p)
f) Cytokrom C innehåller samma prostetiska grupp som hemoglobin och myoglobin,
men kan inte binda syre. Varför? (1p)
(6p)
Svarsmall:
a) Hemoglobin har heme/hem/häm som prostetisk grupp (0.5p).
b) Syret binder till en järnjon som sitter i heme-gruppen (0.5p).
c) Positiv kooperativitet innebär att affiniteteten (bindningsstyrkan) för syre ökar med
ökad koncentration av syre (0.5p). Hemoglobin består av fyra subenheter. De kan anta
två olika former, en som binder syre starkt (R) och en som binder svagare (T).
Bindingen mellan subenheterna styr dem att anta samma form. När syre binds till en
av subenheterna så stabiliseras R-formen, även hos de andra subenheterna, så att de
lättare binder syre (1p). Mekanismen kallas för allosteri (0.5p).
d) Myoglobin består bara av en subenhet (1p).
e) Histidin har normalt pKa-värde mellan 6 och 7 och är därför bra på att uppta och
avge protoner vid neutralt pH. (1p)
f) I hemoglobin (och myoglobin) binder syret till en ledig ligandplats på järnet i
heme-gruppen, men i Cytokrom C finns ingen plats för syrebindindning eftersom den
upptas av en extra ligand till järnet, en metionin-sidokedja. (1p)
5. Enzyminhibitorer verkar genom att binda till enzymer och bromsa eller stoppa
deras aktivitet. Genom enzymkinetiska mätningar kan man urskilja tre typer av
reversibel inhibering: kompetitiv, okompetitiv (uncompetitive) och icke-kompetitiv
(non-competitive). Skriv för var och en om inhibitorn binder till enzymet 1) bara när
substrat inte är bundet, 2) bara när substrat är bundet, eller 3) både med och utan
substrat bundet. Ange också vilken Lineweaver-Burk-plot A), B) eller C) nedan som
hör ihop med respektive inhiberingstyp.
(3p)
A)
B)
C)
Sidan 2 av 8
Svarsmall:
Kompetitiv: 1) Binder bara när substratet inte är bundet (0.5p). LB-plot B) är rätt (0.5
p). Vmax är samma, Km ökar med ökad inhibitorkoncentration.
Okompetitiv: 2) Binder bara när substrat är bundet (0.5 p). LB-plot C) är rätt (0.5 p).
Km och Vmax minskar lika mycket med ökad inhibitorkoncentration, så att kcat/Km
är konstant vilket ger samma lutning.
Icke-kompetitiv: 3) Binder både med och utan substrat bundet (0.5p). LB-plot A) är
rätt (0.5 p). Km är samma, Vmax minskar med ökad inhibitorkoncentration.
6. En del enzymer kräver ytterligare funktionella enheter än de aminosyror som ingår
i polypeptidkedjan, s.k. co-faktorer. De kan vara Essentiella joner eller Co-enzymer.
a) Ett co-enzym kan fungera som co-substrat eller prostetisk grupp. Vad är
skillnaden? (1p)
b) Ett viktigt co-enzym är NAD. Vad står förkortningen för? I vilken typ av reaktioner
ingår detta co-enzym och vilken funktion har det i cellen? Är det ett co-substrat eller
en prostetisk grupp? (2p)
c) NADP är mycket likt och fungerar på samma sätt som NAD, men används av andra
enzymer. I vilka metaboliska vägar används huvudsakligen NAD och i vilka används
NADP? (1p)
d) FAD och FMN deltar i liknande reaktioner och har liknande funktion som
ovanstående. Skriv vad en av förkortningarna står för. Dessa co-enzymer har dock en
förmåga som NAD/NADP saknar. Vilken? Brukar de fungera som co-substrat eller
prostetisk grupp? (2p)
e) Namnge ytterligare två co-enzymer, ett co-substrat och en prostetisk grupp. (1p)
(7p)
Svarsmall:
a) Ett co-substrat binder reversibelt och lämnar enzymet efter reaktionen (0.5p) och en
ny molekyl kan komma i dess ställe. Co-substratet regenereas av ett annat enzym nån
annanstans. En prostetisk grupp däremot sitter normalt bunden till enzymet hela tiden
(0.5p) och måste regenereras på plats innan enzymet kan katalysera en ny reaktion.
b) NAD står för Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (0.5p). NAD+/NADH (och
NADP+/NADPH) ingår i redox-reaktioner (oxidationer och reduktioner) och tar emot
eller avger elektroner. Fungerar som elektronbärare och reduktionsmedel i cellen (1p).
Är co-substrat (0.5p).
c) NAD+/NADH används hvudsakligen i kataboliska (nedbrytande) vägar (0.5p),
medan NADP+/NADPH mest används i anaboliska (uppbyggande) vägar (0.5p).
d) Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) eller Flavin-Mono-Nukleotid (FMN) (0.5p), en
räcker). Ingår liksom NAD+/NADH i oxidationer och reduktioner och kan ta emot och
avge två elektroner, men kan också ta emot och avge en elektron i taget (1p). Är
prostetiska grupper (0.5p).
e) Exempel på co-substrat: ATP, ADP, AMP, GTP, GDP, GMP, S-adenosyl-metionin,
UDP-glucose, Coenzym A, Tetrahydrofolat, Ubiquinon/Q10 (0.5p). Prostetisk grupp:
Tiamin-pyrofosfat/TPP, Pyridoxal-fosfat/PLP, Biotin, (Metyl-/Adenosyl-) cobolamin,
Lipoamid (0.5p). Förkortningar är OK.
7. Enzymreglering.
a) Fosfofruktokinas 1 (PFK-1) är ett enzym i glykolysen som katalyserar
fosforyleringen av fruktos-1-fosfat till fruktos-1,6-bisfosfat. Varifrån kommer 6fosfat-gruppen? (1p)
b) Produkten från PFK-1, fruktos-1,6-bisfosfat, påverkar pyruvatkinas längre fram i
glykolysen och får det att arbeta snabbare. Vad kallas det när ett enzym längre fram i
en metabolisk väg aktiveras av produkten av ett tidigare steg? (1p)
Sidan 3 av 8
c) PFK-1 aktiveras av bla. AMP och inhiberas av bl.a. citrat. Med vilken typ av
regleringsmekanism? (1p)
d) En annan reglermekanism används ofta vid hormonell kontroll, t.ex. för att styra
nedbrytning och syntes av glykogen genom att enzymerna glykogen-syntas och
glykogen-fosforylas sätts på eller stängs av. Vad kallas mekanismen och vad innebär
den? (2p)
e) En tredje mekanism som vi stött på kontrollerar aktiviteten hos serin-proteaserna
från bukspottkörteln, trypsin, kymotrypsin och elastas, som används i
matsmältningen. Vad kallas denna mekanism och hur fungerar den? (2p)
f) Vilka steg i en metabolisk reaktionsväg brukar vara kontrollerade? (1p)
(8p)
Svarsmall:
a) Fosfatgruppen kommer från ATP. (1p)
b) Feed-forward-aktivering. (1p)
c) Allosterisk reglering. (1p)
d) (Protein-)fosforylering (1p). Enzymet stängs av eller sätts på genom att en
fosfatgrupp sätts på eller tas av från ett speciellt fosforyleringsställe på enzymet (1p).
e) Proteolytisk aktivering (1p). Enzymet syntetiseras som ett inaktivt pro-enzym
(zymogen), och aktiveras genom att en eller flera peptidbindingar i proteinet
hydrolyseras av ett proteas (1p).
f) Metaboliskt irreversibla steg brukar regleras, ofta energi-krävande (ATPförbrukande) steg. (1p)
8. Skelettmusklerna kan utnyttja ett flertal olika substrat för att utvinna energi för bla.
muskelkontraktion. Hur mycket energi (i form av ATP) utvinns vid fullständig
förbränning av 1 mol glukos respektive 1 mol ketonkroppar (acetoacetat)? Motivera
svaret. (I citronsyracykeln bildas 3 NADH, 1 QH2-FADH2 och 1 GTP per varv).
(6p)
Svarsmall:
Glukos: 2 ATP och 2 NADH i glykolysen (1p), 2 NADH i PDH-komplexet (1p), 6
NADH, 2QH2 -FADH2, 2 GTP i citronsyracykeln (0.5p). Oxidativa fosforyleringen
2,5 ATP/NADH, 1,5 ATP/ QH2 detta blir 32 mol ATP/ mol glukos (1p) (beroende på
vilken transport skyttel som används 30-32 ATP).
Ketonkroppar: Acetoacetat klyvs till 2 Acetyl-CoA (1p). Två varv i citronsyracykeln
medför att 6 NADH, 2 QH2 och 2 GTP bildas (0.5p). Totalt via den oxidativa
fosforyleringen (2,5 ATP/NADH, 1,5 ATP/ QH2 ) bildas 20 mol ATP/mol acetoacetat.
(1p)
9. Avidin är ett protein som binder extremt hårt till biotin. Avidin är därmed en
mycket potent inhibitor för biotin-krävande enzymatiska reaktioner. Antag att det sker
en biosyntes av glukos från följande substrat.
a. Laktat
b. Oxaloacetat
c. Fumarat
d. Fruktos 6-fosfat
e. Fosfoenolpyruvat
Vilken metabolisk ”syntesväg” och substratanvändning skulle inhiberas? Motivera
svaret.
(3p)
Svarsmall:
Glukoneogenes från lakatat (1p). Laktat omvandlas till pyruvat som sedan
karboxyleras till oxalacetat (1p). Karboxyleringen katalyseras av pyruvatkarboxylas
Sidan 4 av 8
som innehåller biotin (som prostetisk grupp (1p). Avidin binder till biotin vilket
medför att för lite biotin finns tillgängligt för enzymkomplexet.
10. Rotenon är ett naturligt förekommande ämne som kan påträffas i vissa växter.
Antimycin A är en toxisk antibiotika. Båda substanserna påverkar organismer mycket
kraftigt och kan leda till döden.
a) Vilken metabolisk väg är det som inhiberas av dessa två ämnen? (1p)
b) Förklara varför rotenon kan vara dödligt. (2p)
c) Förklara varför Antimycin A klassas som en giftig substans. (2p)
d) Antag att rotenon och antimycin A är lika effektiva inhibitorer, vilken av de två
substanserna skulle vara mest toxiskt? Förklara. (1p)
(6p)
Svarsmall:
a) Oxidativ fosforylering eller andningskedjan. (1p)
b) Rotenon inhiberar enzymkoplexet NADH-reduktas i andningskedjan (1p) vilket
medför att elektrontransportern via andningskedjan till syre är nedsatt och ATPproduktionen är reducerad (1p). Om inte tillräckligt med ATP produceras dör
organismen.
c) Antimycin A binder till komplex 3 (cytokrom c reduktas) (1p) i andningskedjan
och blockerar därmed transporten av elektroner till syret med minskad ATP
produktion till följd (1p).
d) Eftersom Antimycin A blockerar all transport av elektroner till syret är antimycin A
giftigare jämfört med rotenon som blockerar elektronflödet från NADH men inte från
QH2/FADH2. (1p)
11. Du har blivit erbjuden att hålla ett föredrag på en Institution om energimetabolismen hos enkelmagade djur eller människa. Du ombeds att lämna in ett
abstract på högst en A-4 sida. För att kunna begränsa dig har du valt att endast berätta
samspelet mellan organen lever, muskel och fettväv vid kortvarig svält. De
metaboliska vägarna och de viktigaste intermediärerna anges, en förklarande bild kan
accepteras (men inte för detaljerat)
(10p)
Svarsmall:
Vid partiell svält är prioritet ett att kunna hålla blodglukosnivån på en acceptabel nivå.
Leverns glykogen bryts ner för att balansera blodglukosnivån. (1p)
Muskelproteiner bryts ned och transporteras till levern för glukoneogenes. (1p)
Muskeln utnyttjar muskelglykogen och muskelprotein för sin egen energi-metabolism.
(1p)
Skelettmusklerna producerar större mängd laktat som transproteras till levern för
syntes av glukos. (1p)
Lipolys av upplagrat fett (från fettdepåerna), glycerol spjälkas av. (1p)
Glycerol transporteras till levern som syntetiserar glukos av glycerol. (1p)
Fettsyrorna utnyttjas som energi (bränsle) i lever och skelettmuskel. (1p)
Fettsyrorna oxideras via beta-oxidationen men oxalacetat nivån är låg i levern vilket
medför att levern bildar ketonkroppar som exporteras ut i blodet (2p)
Ketonkropparna används av bla. musklerna som bränsle. (1p)
12. En bekant till dig har läst i tidningen att det bästa sättet att gå ner i vikt är att
enbart äta kolhydrater. Därför har han/hon ändrat sina kostvanor till att i större
utsträckning äta fler mellanmål och mer konditorivaror. Effekten blev inte riktigt vad
som var tänkt utan resulterade i att mer fett lagrades i fettcellerna, med viktökning
som följd.
Sidan 5 av 8
a) Förklara hur glukos kan tillgodose behovet av kolatomer som behövs för
fettsyrasyntes. (2p)
b) Hur kan acetyl-CoA, som bildas i mitokondrierna transporteras ut i cytosolen? (1p)
c) Fettyrasyntesen är en reduktiv process som kräver stora mängder av reducerande
ekvivalenter (NADPH). Varifrån erhålls dessa? (2p)
(5p)
Svarsmall:
a) Det antal kolatomer som behövs för syntes av fettsyror erhålls genom att glukos
bryts ned till pyruvat via glykolysen (1p) och vidare till mitokondriellt acetyl-CoA
(1p).
b) Mitokondriellt acetyl-CoA transporteras ut till cytosolen som citrat (1p).
c) NADPH erhålls från pentosfosfat-shunten och från citrattransport-systemet då
malat omvandlas till pyruvat via malat-enzymet (2p).
13. Fotosyntes.
a) I växter fixeras luftens koldioxid i ribulos-1,5-bisfosfat i första steget i Calvincykeln. Produkten i denna reaktion, 3-fosfoglycerat, omvandlas sedan i en ATPberoende reaktion till 1,3-bisfosfoglycerat som sedan reduceras med hjälp av NADPH
till glyceraldehyd-3-fosfat (som tillsammans med dihydroxyacetonfosfat går under
benämningen triosfosfat). Varifrån kommer de ATP och NADPH som behövs i dessa
reaktioner? (1p)
b) Vad händer vidare med glyceraldehyd-3-fosfat (i och utanför Calvin-cykeln)? (4p)
c) Från vilket ämne tas elektroner till den icke-cykliska elektrontransporten i
ljusreaktionen och vilket ämne är den slutliga elektron-mottagaren? (2p)
d) Vilken är den huvudsakliga funktionen för cyclisk elektrontransport i fotosyntesen,
d.v.s. vilken metabolit produceras? (1p)
e) Förklara hur den cykliska elektrontransporten fungerar, dvs. vilken väg
elektronerna flödar och vad det ger upphov till. (3p)
(11p)
Svarsmall:
a) ATP och NADPH kommer ifrån fotosyntesens ljusreaktion. (1p)
b) Den största delen glyceraldehyd-3-fosfat används för att (i) återbilda/regnerera
ribulos-1,5-bisfosfat (1p) för vidare användning i Calvin-cykeln. Nettoöverskottet
som bildas används för syntes av hexoser (1p), dels (ii) direkt i stroma hos
kloroplasten där det ombildas till hexos (glukos-1-fosfat) och sen stärkelse för
korttidslagring (0.5p). (iii) En del glyceraldehyd-3-fosfat transporteras ut till cytosolen
(0.5p) där det omvandlas till hexoser (glukos-1-fosfat, och fruktos-6-fosfat) och sen
sukros för vidare transport i växten (0.5p). Förutom som energikälla så används en
betydande del av kolhydraterna för syntes av cellulosa (via glukos-1-fosfat) för
uppbyggnad av cellväggen (0.5p).
c) Elektronerna tas från vatten (1p) och lämnas till NADP+ (1p).
d) Cyklisk elektrontransport leder till syntes av ATP (1p) utan samtidig reducering av
NADPH.
e) I cyklisk elektrontransport förs elektroner från ferredoxin till plasoquinonpoolen,
vidare till cytokrom b/f-komplexet, till fotosystem I och tillbaka till ferredoxin (0.5p
för varje komponent som identifieras, max 2p). Detta driver en protonpump/ger
upphov till protongradient (1p), som i sin tur driver ATP-syntes.
14. I litteraturen finns beskrivet tre former av DNA, A, B och Z-DNA. Den vanliga
formen anses vara B-DNA.
a) Längs helixen av den vanliga DNA-formen bildas två tydliga "diken". Vad kallas
dessa på engelska? (1p)
Sidan 6 av 8
b) Vilket av A, B och Z-DNA vrider sig åt motsatt håll relativt de andra två? (0.5p)
c) Åt vilket håll är den vanliga vridningen på DNA, höger eller vänster? (0.5p)
d) Varför antar inte dubbelsträngat RNA den vanligare B-formen utan mer formen för
A-DNA? (1p)
(3p)
Svarsmall:
a) Minor groove (0,5p) och major groove (0,5p)
b) Z-DNA (0,5p)
c) Höger (0,5p)
d) Ribosen har en hydroxylgrupp bundet till 2'-kolet, deoxyribosen har bara ett väte på
den positionen. Det extra syret gör att RNA av B-form inte kan bildas, d v s steriskt
hinder. (1p)
15. Hur vet ett bakteriellt RNA-polymeras var det skall börja transkriptionen av ett
nytt RNA?
(2p)
Svarsmall:
Sigmafaktorn känner igen och binder till promotorsekvensen uppströms om genen
(1p). RNA-polymeraset i sin tur binder till sigmafaktorn (1p).
16. Antag att nedanstående DNA-sekvens transkriberas till RNA. Rita ut RNA
sekvensen och markera 5’ och 3’ ändar. Antag att translationen av RNAt sker vid
första start kodonet – markera dessa nukleotider.
5´ A A C A T G G C G C T G C A T G 3´
3´ T T G T A C C G C G A C G T A C 5´
(4p)
Svarsmall:
RNA (kopia av 5’-3’ strängen). Två olika möjligheter – båda rätt. T byts mot U. 1p
för sekvensen. 1p för U istället för T. 1p för 5´och 3´på rätt ställe. 1p för AUG.
5’AACAUGGCGCUGCAUG 3’
eller
5’CAUGCAGCGCCAUGUU 3’
17. Markera för varje påstående om det är sant eller falskt:
a) Ett kodon (codon) kodar oftast för samma aminosyra i både bakterier och
människa.
b) Ribosomen är uppbyggd av proteiner och RNA.
c) mRNA i bakterier är uppbyggt av exoner och introner.
d) Vid replikationen syntetiseras den nya strängen i 5’-3’ orientering.
e) Vid transkription syntetiseras RNA i 3’-5’ orientering.
f) Translationen av ett normalt protein avslutas genom att ribosomen kommer fram
till sista nukleotiden av mRNA molekylen och därför faller av.
g) Varje kodon består av 4 nukleotider som avläses till en specifik aminosyra.
h) DNA är totalt ointressant, har ingen betydelse för cellens funktion utan är enbart
något som möjligtvis kan intressera Arkiv X-freaks.
(4p)
Svarsmall:
a) sant, b) sant, c) falskt – exoner och introner finns bara i eukaryot RNA, d) sant, e)
falskt, f) falskt - ribosomen faller av när den når ett stoppkodon i mRNA, g) falskt – 3
nukleotider, h) otroligt falskt! 0.5p för varje korrekt svar.
Sidan 7 av 8
18. En gen, Mon, har skickats till dig. Genen har "sticky ends" där 5’-änden har ett
GATC-överhäng och 3’-änden ett TTAA-överhäng. Du har blivit ombedd att ligera in
genen i plasmiden pBMN-Z. Beskrivning av genen, plasmiden och restriktionsenzym
finns beskrivna nedan. Beskriv momenten du måste utföra för att ligera in genen Mon
till plasmiden pBMN-Z. Du behöver ej redogöra för efterföljande steg (transformation
etc.)
Mon
(2p)
Svarsmall:
Plasmiden pBMN-Z klipps upp med restriktionsenzymerna; BamHI (0.5 p) resp.
EcoRI (0.5 p). Därefter ligeras pBMN-Z och genen (Mon) samman med hjälp av
enzymet (DNA) ligas (1 p).
Sidan 8 av 8
