Biokemi Bke2

Sluttentamen med svarsmallar Bke2/KE0003, 28:e Oktober 2002, 0900 - 1500.
Max poäng = 88 p. Preliminär gräns för godkänd = 46 p (52 %).
1. Utan biologiska membran skulle inget liv kunna existera.
a) Rita den kemiska strukturformeln för en membranlipid. (2.5p)
b) Beskriv med en enkel skiss uppbyggnaden av ett biologiskt membran. (1p)
c) Ge två exempel på energialstrande processer där biologiska membran är av central
betydelse. (1p)
d) Vad kallas den drivande kraften som gör att membraner hålls ihop (och som gör att
proteiner veckar sig) (0.5p)? Hur fungerar den (1p)?
(6p)
Svarsmall:
a) Lipidfigur: Glycerol (0.5p) med esterbindningar (0.5p) till fettsyror (R1, R2) på två
hydroxyler (0.5p) och fosfat på den tredje (0.5p) som i sin tur har en polär grupp bunden
(etanolamin, serin, kolin) (0.5p).
b) Membranfigur: Dubbellager, hydrofila huvuden utåt, hydrofoba svansar inåt (1p).
c) Membranet har en central betydelse vid oxidativ fosforylering (0.5p) och vid
fotosyntes (0.5p).
d) Hydrofoba effekten (0.5p). Hydrofoba delar av t.ex. lipider eller proteiner klumpar
ihop sig med varandra för att undgå kontakt med vatten (1p).
2. I proteiner ingår 20 olika aminosyror, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile,
Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val.
a) Placera varje aminosyra i en av följande 7 grupper: Sidokedjan innehåller 1) Svavel, 2)
Alkohol eller 3) Amid eller är 4) Alifatisk, 5) Aromatisk, 6) Sur eller 7) Basisk. (3p)
b) Aminosyrorna Cys, Gly och Pro har speciella egenskaper som är betydelsefulla för
strukturen hos det veckade proteinet. Ange för var och en av dessa tre aminosyror vilken
egenskap och vilken strukturell funktion aminosyran ofta har i proteiner. (3p)
c) I många enzymer hittar man i aktiva ytan histidin med viktig katalytisk funktion. Vilka
egenskaper hos histidin gör den lämplig att delta i enzymatiska reaktioner? Ge ett
exempel på en enzymmekanism och vilken roll histidin har i denna reaktion. Ge ett
exempel på någon annan funktion som histidin kan ha. (3p)
(9p)
Svarsmall:
a) 1. Svavel: Cys, Met
2. Alkohol: Ser, Thr, (Tyr)
3. Amid: Asn, Gln
Sidan 1 av 12
4. Alifatisk: Ala, Gly, Ile, Leu, Pro,Val
5. Aromatisk: Phe, Trp, Tyr
6. Sur: Asp, Glu
7. Basisk: Arg, His, Lys
(3p totalt, -0.5p för varje fel placerad aminosyra)
b) Cystein (Cys) kan para ihop sig och bilda disulfidbryggor (0.5p) som binder ihop olika
delar av polypeptidkedjan och stabiliserar proteinets tertiär-struktur (0.5p).
Glycin (Gly) har ingen egentlig sidokedja utan bara väte på alfa-kolet vilket ger större
vridbarhet runt alfa-kolet (phi och psi-vinklarna) (0.5p). Gly sitter ofta där det är trångt
(där större sidokedja inte får plats) eller där det behövs en kraftig böj i huvudkedjan
(0.5p).
Prolin (Pro) har en sidokedja som är kovalent bunden till peptidkvävet så att den bildar en
ringstruktur där phi-vinkeln är fixerad och inte kan rotera (0.5p). Detta ger minskad
flexibilitet och stabilisering av huvudkedjan. Prolin passar inte i alfa-helix och hindrar
dess bildning. Pro kan fungera som "helix-brytare" i änden av en helix och förekommer
ofta i böjar tillsammans med Gly (0.5p).
c) Histidin har pKa-värde omkring 6-7 och den kan gärna uppta/avge proton vid
fysiologiskt pH och delta i syra/bas-katalys (1p). His ingår t.ex. i den katalytiska triaden i
serin-proteaser, där den tar upp och avger en proton (1p). His binder gärna till
metalljoner, t.ex. till järn i hemoglobin, myoglobin och cytokromer (1p).
3. Proteiners struktur kan beskrivas i fyra nivåer. Beskriv kortfattat, med högst två
meningar för varje:
a) Primär struktur (1p)
b) Sekundär struktur och namnen på de två viktigaste sekundärstrukturelementen (1p)
c) Tertiär struktur (1p)
d) Kvartenär struktur (1p).
(4p)
Svarsmall:
a) Primärstruktur är aminosyrasekvensen (1p).
b) Sekundärstruktur bildas när avsnitt av polypeptidkedjan veckar ihop sig med
regelbundna vätebindingar i sekundärstruktur-elementen alfa-helix eller beta-flak (1p).
c) Tertiärstruktur beskriver hela polypeptidkedjans veckning, hur sekundärstrukturelement och sidokedjor är packade (1p).
d) Kvartenärstruktur beskriver hur olika subenheter sitter ihop i ett oligomert
protein/proteinkomplex (1p).
Sidan 2 av 12
4. X, Y och Z är tre proteiner som återstår i ett prov efter inledande rening av ett E. colicellextrakt. Du laddar provet på en gelfiltreringskolonn och resultatet ser du i figuren
nedan.
a) Beskriv kortfattat principen för gelfiltrering samt ordna proteinerna X-Z i trolig
storleksordning från det minsta till den största. (2p)
b) Som du ser så har du inte lyckats att fullständigt isolera komponenten Y vilken du
önskar rena för att så småningom använda för enzymkinetikstudier. Man vet dock att
Y och X har skilda isoelektriska punkter (Y=7.5 respektive X=5.2). Du bestämmer
dig för att försöka binda Y till en jonbytare med en negativt laddad ligand t.ex. CMSepharose vid pH 6.5 för vidare rening. Protein Y binder mycket riktigt till denna till
skillnad från X. Varför? (2p)
c) Nu gäller det att få Y att lossna från CM-jonbytaren. Du springer till kemikaliehyllan
och märker till din fasa att natriumkloriden är slut (liksom andra lämpliga salter).
Däremot finns det gott om olika buffertsubstanser. Föreslå ett alternativt sätt att få Y
att släppa från jonbytaren. (1p)
(5 p)
Gelfiltrering på Sephacryl
A280
1
Y
Z
200
300
X
0.5
0
0
100
400
500
Volym (ml)
Svarsmall:
a) Gelfiltreringskromatografi används för att separera proteiner/molekyler med avseende
på storlek (0.5 p). Systemet består av två faser - en fast och en mobil (0.5p). Den
fasta fasen utgörs t.ex. av kulor av en tvärbunden polysackarid och den flytande fasen
vanligen av en buffert. Separationen beror av molekylernas förmåga att tränga in i
gelkulornas porer (0.5p). Små molekyler tränger lättare in än stora och separationen
sker följdaktligen i fallande storleksordning. Storleken på molekylerna i provet bör
vara Z < Y < X. (0.5p).
b) Vid pH 6.5 kommer Y som befinner sig under sin isoelektriska punkt ha en postiv
nettoladdning och bör binda till den negativt laddade CM-gruppen. X däremot bör
vara negativt nettoladdat vid detta pH och binder följaktligen inte. (2p)
c) Genom att tillverka en buffert med pH 8-8.5 kan du troligen eluera Y som bör bli
negativt laddat när pH höjs över dess isoelektriska punkt. (1p)
Sidan 3 av 12
5. Enzymet E som följer Michaelis-Menten-kinetik har Km 1 mM. Initiala
reaktionshastigheten v0 är 0.1 mM/min vid en substratkoncentration på 10 mM och
enzymkoncentrationen [E]tot 0.1 nM. Vad blir den initiala hastigheten v0
a) om vi dubblar substratkoncentrationen vid samma enzymkoncentration, [S] = 20 mM?
b) om [S] är lika med 1 mM vid samma enzymkoncentration?
c) om vi istället dubblar enzymkoncentrationen vid samma substratkoncentration,
[S] = 10 mM, [E]tot = 0.2 nM?
(3p)
Svarsmall:
När [S] = 10 mM, [S] >> Km (substratkonc mycket större än Km), och alltså är v0 = Vmax
= 0.1 mM/min
a) 0.1 mM/min. För varje substratkoncentration större än 10 mM gäller fortfarande att v0
= Vmax = 0.1 mM/min (1p)
b) 0.05 mM/min. När [S] = Km gäller att v0 = Vmax/2 , eller 0.05 mM/min (1p)
c) 0.2 mM/min. Hastigheten är proportionell mot enzymkoncentrationen. Dubbelt så hög
enzymkoncentration ger dubbel hastighet. (1p)
6. Aktiviteten hos enzym-molekyer kan regleras på olika sätt.
a) Ett vanligt sätt är att andra ämnen än substrat eller produkt kan binda till speciella
regulatoriska bindingsställen och påverka enzymets struktur så att det inhiberas eller
aktiveras. T.ex. Fosfofruktokinas 1 (PFK-1), som katalyserar bildningen av fruktos-1,6bisfosfat från fruktos-1-fosfat i glykolysen, inhiberas av citrat och aktiveras av AMP. Vad
kallas den typen av regleringsmekanism?
b) En annan mekanism används ofta vid hormonell kontroll, t.ex. för att styra nedbrytning
och syntes av glykogen. När hormonerna adrenalin (epinephrine), glukagon eller insulin
binds till receptorer på cellytan ger det en signal inuti cellen att sätta på eller stänga av
enzymerna glykogen-syntas och glykogen-fosforylas med denna mekanism. Vad kallas
mekanismen?
c) En tredje mekanism som vi stött på kontrollerar aktiviteten hos serin-proteaserna från
bukspottkörteln, trypsin, kymotrypsin och elastas, som används i matsmältningen. Vad
kallas denna mekanism?
(3p)
Svarsmall:
a) Allosterisk reglering (1p)
Sidan 4 av 12
b) (Protein-)fosforylering (1p). Enzymet stängs av eller sätts på genom att en fosfatgrupp
sätts på eller tas av från ett speciellt fosforyleringsställe på enzymet. Utförs av proteinkinaser.
c) Proteolytisk aktivering (1p). Enzymet syntetiseras som ett inaktivt pro-enzym, och
aktiveras genom att en eller flera peptidbindingar i proteinet hydrolyseras av ett proteas.
7. Flödet genom en metabolisk reaktionsväg, t.ex. glykolysen, styrs genom att aktiviteten
för vissa nyckelenzymer regleras noggrannt.
a) Vilka steg brukar vara reglerade, dvs. vad är gemensamt för de reaktioner som de
reglerade enzymerna katalyserar? (1p)
b) Vad kallas det när ett enzym i början av en metabolisk reaktionsväg inhiberas av
produkten från ett senare steg? (1p)
c) Vad kallas det när en produkt från ett tidigt steg aktiverar ett enzym i slutet av en
metabolisk reaktionsväg? (1p)
(3p)
Svarsmall:
a) Metaboliskt irreversibla steg (1p) brukar regleras, dvs. reaktioner med stort negativt
delta-G. Mycket energi frigörs från substraten, ofta genom att ATP förbrukas.
Alternativa svar som ger poäng: Det första determinerade steget i en reaktionsväg (eller
liknande, 0.5p). Steg där reaktionsvägar grenar sig ('branch-point enzyme', eller liknande,
0.5p).
b) 'Feed-back'-inhibering (1p)
c) 'Feed-forward'- aktivering (1p)
8. En del enzymer kräver ytterligare funktionella enheter än de aminosyror som ingår i
polypeptidkedjan, s.k. co-enzymer. Människor och högre djur saknar förmågan att helt
själva syntetetisera många av de co-enzymer som behövs. Istället måste vi få dem i oss
via födan. De flesta essentiella ämnen som kallas vitaminer är prekursorer för sådana coenzymer.
a) Ett co-enzym kan fungera som co-substrat eller prostetisk grupp. Vad är skillnaden?
b) Vitaminet niacin (nikotinsyra) behövs till ett co-enzym, vilket (förkortning är OK)? I
vilken typ av reaktioner ingår detta co-enzym och vilken funktion har det i cellen? Är det
ett co-substrat eller en prostetisk grupp?
c) Vitamin B2, riboflavin, behövs till ett annat co-enzym, vilket (förkortning är OK)?
Brukar det vara ett co-substrat eller en prostetisk grupp? Detta co-enzym deltar i liknande
reaktioner och har liknande funktion, men har en förmåga som ovanstående co-enzym
saknar. Vilken?
(7p)
Sidan 5 av 12
Svarsmall:
a) Ett co-substrat lämnar enzymet efter reaktionen (0.5p) och en ny molekyl kan komma i
dess ställe. Co-substratet regenereas av ett annat enzym nån annanstans. En prostetisk
grupp däremot sitter normalt bunden till enzymet hela tiden (0.5p) och måste regenereras
på plats innan enzymet kan katalysera en ny reaktion.
b) Niacin görs om till nikotinamid som ingår i NAD+ (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid)
NADH, NADP+ och NADPH (1p, en räcker), som ingår i redox-reaktioner (oxidationer
och reduktioner) och tar emot eller avger elektroner. Fungerar som elektronbärare (1p)
och reduktionsmedel i cellen. Är co-substrat (1p).
c) Riboflavin behövs till FAD (Flavin-Adenin-Dinukleotid) och FMN (1p, en räcker). Är
prostetiska grupper (1p). Ingår liksom NAD+/NADH i oxidationer och reduktioner och
kan ta emot och avge två elektroner, men kan också ta emot och avge en elektron i taget
(1p).
9. Enzymet glycerolkinas saknas i fettvävnad. Glycerol-3-fosfat är en av byggstenarna i
biosyntesen av triacylglycerol. Fettceller är specialiserade på syntes och nedbrytning av
triacylglyceroler, men de kan inte direkt använda glycerol eftersom de saknar enzymet
glycerolkinas, som katalyserar reaktionen glycerol + ATP ® glycerol-3 fosfat + ADP.
Förklara hur och från vilket ämne fettvävnaden kan erhålla glycerol-3-fosfat som behövs
för syntes av triacylglycerol.
(4p)
Svarsmall:
Från glukos (1p). Glukos bryts ned i glykolysen (1p) till intermediärerna
dihydroxyacetonfosfat (DHA) (1p) och glyceraldehydfosfat som är i jämvikt med
varandra via enzymet triose-fosfat-isomeras. DHA reduceras vidare (1p) till glycerol-3fosfat enligt: Dihydroxyacetonfosfat + NADH + H+ ® glycerol-3-fosfat + NAD+.
10. Vilken av följande aminosyror spelar en avgörande roll i transporten av
ammoniumjoner från perifiära vävnader till levern? (1p)
a.
b.
c.
d.
Serin
Metionin
Glutamin
Arginin
(1p)
Svarsmall:
c. Glutamin (1p)
Sidan 6 av 12
11. Varför bildas laktat (mjölksyra) i musklerna vid kraftig fysisk ansträngning? Vad
händer med laktatet? Varför kvarstår en ökad syreförbrukning/ökat syrgasbehov även en
viss tid efter att den fysiska ansträngningen har upphört?
(6p)
Svarsmall:
Vid kraftig fysisk ansträngning räcker inte syret till för att ta om hand om allt puryvat
från glykolysen (1p), via omvandling till acetyl-CoA, vidare oxidering i citronsyracykeln
och andningskedjan. Istället omvandlas (reduceras) pyruvatet till laktat. Laktatet
transporteras från musklerna till levern (1p) där det via glukoneogenesen omvandlas till
glukos (1p) som transporteras ut i blodet och tillbaka till musklerna (Cori-cykeln) (1p).
Laktatet produceras dock i snabbare takt än det hinner tas om hand i Cori-cykeln, och
överskottet tas om hand efter att ansträngningen har upphört (1p). Det blir ett fortsatt högt
syrgasbehov, eftersom det krävs mycket energi för att omvandla laktat till glukos (1p) (i
form av ATP, 6 mol per mol laktat).
12. Du har försovit dig och rusar iväg på seminarieredovisning utan att äta frukost. Vid
ett-tiden på dagen känner du att det börjar bli svårt att koncentrera sig och du får
huvudvärk etc. Förklara kortfattat vilket samspel som råder mellan lever, muskel och
fettvävnad vid ovan nämda situation. Ange endast huvuddragen i de metaboliska vägarna
(max. 1sida inkl. eventuell figur).
(10p)
Svarsmall:
Under natten har levern använt en stor del av sitt glykogen till att bibehålla glukoshalten i
blodet. Fram emot lunch börjar leverglykogenet ta slut (1p). Blodsocker-halten sjunker
och man blir trött och får koncentrationssvårigheter. Muskelproteiner börjar brytas ned
(1p). Alanin transporteras till levern för syntes av glukos via glukoneogenesen (1p),
glukos transporteras ut i blodet (1p). Fettsyror från fettvävnad frisätts (1p) och
transporteras ut i blodet för att användas som energi i muskel och lever (1p). Glycerol
från triaylglycerolerna transporteras till levern (1p) för syntes av glukos (1p). Brist på
oxalacetat i levercellerna medför att ketonkroppar produceras och utsöndras i blodet (1p).
Ketonkropparna används av bl.a. musklerna till energi (1p). Ketonkroppar bär åtminstone
en del av skulden till att man får huvudvärk.
13. Varför produceras mindre ATP av det NADH som genereras i cytosolen och sedan
transporteras in i mitokondrierna via glycerolfosfat-skytteln jämfört med det NADH som
produceras i mitokondrierna (2p)? Hur mycket energi i form av ATP erhålls (1p)?
(3p)
Svarsmall:
NADH-ekvivalenter från cytosolen transporteras in som glycerolfosfat i mitokondrierna
(1p). Glycerolfosfat omvandlas till dihydroxyaceton av det membranbundna
Sidan 7 av 12
enzymkomplexet glycerolfosfatdehydrogenas där två elektroner överförs till FAD (1 p)
som då reduceras till FADH2, som i sin tur lämnar över elektronerna till Q i
andningskedjan. Endast 1.5 ATP bildas vid oxidationen av FADH2 (1p) medan oxidation
av NADH som bildats i mitokondrien ger 2.5 ATP.
14. Fotosyntes.
a) Illustrera med en skiss huvudkomponenterna i fotosyntesens ljusreaktion (5p).
Besvara sedan följande frågor:
b) Var sker fotosyntesens ljusreaktion hos växter? (1p)
c) Vad heter den vanligaste ljusinfångande komponenten hos växter? (1p)
d) Varifrån tas elektronerna? (1p)
e) Vilken är den slutliga elektron-mottagaren? (1p)
(9p)
Svarsmall:
a) I figuren ska finnas fotosystem II (PS II, P680) (1p), cytokrom bf-komplex (1p) och
fotosystem I (PS I, P700) (1p). Max 2p till för: antennkomplex eller LHC (light
harvesting complex) (0.5p), syre-genererande komplex eller Z (0.5p), plastokinon-pool
(0.5p), plastocyanin (0.5p), ferredoxin (0.5p), ATP-syntas (0.5p), ferredoxin-NADPoxidoreduktas (0.5p).
b) Fotosyntesen sker i kloroplasternas tylakoidmembran (1p).
c) Klorofyll (1p).
d) Från vatten (1p).
e) NADP+ (1p).
Sidan 8 av 12
15. Vilket av följande alternativ är en korrekt beskrivning av nukleinsyror?
a) Ett antal nukleotider sammanhållna med N-glykosidbindningar.
b) Polymerer av nukleotider sammanlänkade med 3' ® 5' fosfodiesterbindningar.
c) De är alltid dubbelsträngade molekyler.
d) Polymerer av nukleotider sammanlänkade med eterbindingar.
(1p)
Svarsmall:
Alternativ b) är korrekt. (1p)
16. Vilka av följande påståenden gäller för nukleotiden tymidin?
a) Kan baspara med adenin i DNA.
b) Ersätts av uridine i RNA.
c) Har en metylgrupp som kan delta i hydrofoba interaktioner.
d) Har samma koncentration som adenin i DNA.
e) Alla påståenden ovan är korrekta.
(1p)
Svarsmall:
Alla påståenden är korrekta. (1p)
17. Skriv RNA sekvensen som syntetiseras vid transkription av nedanstående DNA (2p).
Markera 5’-respektive 3’-ände på RNAt (1p). Antag att initieringen av translationen sker
på ert RNA – vilket är det första (start) kodonet (1p)?
5’ A
A
C
C
T
A
C
C
A
A
T
G T
G G C
3’ T
T
G G
A
T
G G T
T
A
C A
C
C
T
G A
C
T 3’
G A 5’
(4p)
Svarsmall:
5’ AACCUACCAAUGUGGCUCU 3’
1p för sekvensen. 1p för U istället för T. 1p om 3’ och 5’ ändar är rätt markerade.
AUG = start codon 1p
Sidan 9 av 12
18. I bakterier kan transkriptionen av vissa gener starta under speciella förhållanden, t.ex.
när bakterien värms upp ('heat-shock'-gener induceras) eller vid t.ex. sporulering. Gener
som uttrycker s.k. 'housekeeping'-proteiner är dock påslagna hela tiden. Beskriv hur
RNA-polymeraset hos bakterier, som består av olika subenheter/faktorer, kan känna igen
olika typer av gener d.v.s. när de skall uttryckas eller vara “tysta”.
(2p)
Svarsmall:
Olika sigmafaktorer (1p) binder till olika promotor-sekvenser (1p) och dirigerar därmed
RNA polymeraset till rätt gen.
19. PCR är en mycket användbar metod för att kopiera DNA.
a) Beskriv, gärna med bild, hur PCR reaktionen fungerar (3p).
b) Varför är det viktigt att använda DNA-polymeras från termofila organismer, dvs
organismer som växer vid hög temperatur, vid PCR? (Skulle metoden fungera med
humant DNA-polymeras?) (1p)
(4p)
Svarsmall:
a)
Ingredienser
primer
1. denature »95 ºC
3. copy
DNA polymeras
new cycle
2. anneal
»50 ºC
72 ºC
DNA templat
i) 'Denaturation' (denaturering): DNA-strängarna i templatet denatureras (separeras från
varandra) vid hög temp ~95 ºC (1p). ii) 'Annealing': Temp sänks till runt 50 ºC då korta
DNA-oligos (primers) binder till komplementära sekvenser i ändarna av det DNA-avsnitt
man vill amplifiera (1p). iii) 'Extension' (elongering): Temp. höjs till ca 72 ºC då DNApolymeraset (Taq) aktiveras och börjar syntesen av komplementära strängar vilket
resulterar i två kopior av ursprungs DNAt (1p). Hela processen upprepas flera gånger
vilket medför att DNAt kopieras exponentiellt. En tydlig bild med all info räcker som
svar.
b) PCR fungerar enbart med DNA-polymeraser som är aktiva vid
elongeringstemperaturen, dvs ofta vid 72 ºC. Dessutom måste polymeraset “överleva” vid
Sidan 10 av 12
temperaturer över 95 ºC (då DNA strängarna smälts isär). Därför används DNApolymeraser som isolerats från bakterier som lever vid höga temperaturer, t.ex. i varma
källor (1p). Det går ej att använda humant DNA-polymeras eftersom polymeraset förstörs
vid höga temperaturer (endast 37 ºC i våra kroppar).
20. Du har en samarbetspartner i Ungern, som är väldigt duktig men lite slarvig. Hon har
satt in genen G som du är intresserad av i en plasmid, och skickat den till dig. Tyvärr har
hon blandat ihop plasmid A innehållande genen G och plasmid B utan gen, så de skickas
i samma eppendorfrör.
a) Du är bara intresserad av plasmid A, eftersom den innehåller din gen. Det är för liten
mängd plasmider i röret för att du ska kunna använda gel-elektrofores för att isolera
plasmid A. Hur gör du för att skilja på plasmiderna, med hjälp av de metoder du lärt dig
på laborationerna? (2p)
b) Du måste också kontrollera att du har fått de rätta plasmiderna. Du har kartor över de
två plasmiderna, och ser där vilka restriktionsenzym som klipper var. Du vet också att
genen G innehåller 1500 baspar, hela plasmid A 5000 baspar, och plasmid B följaktligen
ungefär 3500 baspar. Hur använder du den informationen för att kontrollera att du har fått
de rätta plasmiderna? (1p)
(3p)
Svarsmall:
a) Transformera in plasmiderna i kompetenta bakterier (0.5poäng). Sprid ut de
transformerade bakterierna på plattor innehållande IPTG och Xgal (0.5p) och ampicillin
(0.5p). Plocka sen en en vit koloni som bör innehålla plasmid A, och en blå koloni som
bör ha plasmid B. Sätt övernattskulturer av var och en och rena fram plasmiderna (0.5p).
b) Klipp båda plasmiderna med restriktionsenzymen Sac1 och HindIII (eller nån annan
lämplig blandning). Separera DNA-fragmenten med agaros-gel-elektrofores, uppskatta
deras storlek och jämför med förväntade värden. (1p) Med Sac1 och HindIII blir det två
band med båda plasmiderna. Det ena bandet ska vara exakt lika stort, ca. 3500 baspar.
Det andra bandet kommer med plasmid A att vara ca. 1500 baspar, medan det är pyttelitet
med plasmid B. Det kan också fungera att klippa med bara ett restriktionsenzym (det
Sidan 11 av 12
svaret ger också 1p). Då får man bara ett band med varje plasmid, som kommer att vara
olika stora, ca 5000 baspar med plasmid A och ca. 3500 med plasmid B, men ju större
DNA-fragmenten är desto närmare hamnar de på gelen och uppskattningen av storleken
blir mer osäker.
Sidan 12 av 12