DNA

Laboration – DNA
Datum:16/11-20/11 2015
Labgrupp: 11
Laboranter: Johanna Olsson & Kent Johansson
Material och metod
Materiallista hänvisas till labhandledning s.3 (BIMA15 ht 2015, Lab III: DNA.)
Uppsamling och isolering av DNA
Laborationen inleds med toppsning av laboranternas insida av kinder för att samla in
celler som sedan DNA ska utvinnas från. Bomullstoppsen får lufttorka för att undvika
nedbrytande enzymer från saliv i 2h, och därefter stoppas bommulsänden ner i 400µl
PBS. Anledningen till att bomullstoppsen fick stå i PBS var för att så många celler som
möjligt skulle släppa från bomulstoppsen. 400µl lyseringsbuffert tillsätts för att spränga
cellkärnorna, och 20µl QIAGEN Protease tillsätts för att bryta ned kärnmembran och
proteiner. Blandningen puls-mixas i 15s och inkuberas i 56°C i 10min. Anledningen till
att provet inkuberas i just 56°C är för att QIAGEN Proteaset har störst reaktionsförmåga
vid denna temperatur. 400µl etanol tillsätts för att fälla ut DNA från lösningen som sedan
pulsmixas innan 700µl av provet överförs i en QIAamp kolonn som centrifugeras 6000 x
g i 1min. Vätskan i uppsamlingsröret hälls ut och resterande prov tillsätts. Provet
centrifugeras åter i 1min och vätskan i uppsamlingsröret hälls ut. Syftet med dessa 2
centrifugeringar är att skilja DNA från lösningen på PBS, lyseringsbuffert AL, etanol och
QIAGEN Protease. Detta för att DNA:et ska renas ytterligare genom att tvättas med
tvättbuffert AW1. DNA:et tvättas med tvättbuffert AW1 genom att tvättbufferten hälls på
och provet centrifugeras i 6000g i 1min. Vätskan i uppsamlingsröret hälls ut och
tvättbuffert AW2 hälls på och provet centrifugeras i 3min för att bli av med all tvättbuffert
som innehåller oönskade ämnen. QIAamp kolonnen placerades i ett rent 1,5ml
eppendorfrör och 150µl elueringsbuffert tilsätts och inkuberas i 5min. Elueringsbufferten
lösgör DNA:et från kiselmembranet i QIAamp kolonnen. Provet centrifugeras igen för att
få ut DNA:et i eppendorfröret.
Spektrofotometri
Spektrofotometri utförs för att undersöka hur rent det utvunna DNA:et är och hur
koncentretrat det är. Därför görs två mätningar, en med 260nm och en med 280nm.
Med 260nm mäts koncentrationen DNA och med 280nm mäts renheten på provet.
Renheten beräknas genom att räkna ut absorbanskvoten, 𝐴𝑏𝑠𝑘𝑣𝑜𝑡 = 260𝑛𝑚 ÷ 280𝑛𝑚.
DNA-koncentrationen beräknas genom:
A260 ∗ 50 ∗ 𝑠𝑝ä𝑑𝑛𝑖𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟𝑛, 𝑑ä𝑟 𝑠𝑝ä𝑑𝑛𝑖𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟𝑛 ä𝑟 10.
Proven späds till 1:10 med TE-buffert för att fylla ut kyvetterna till en volym av 1mL.
Proven hålls som nämt i kyvetter som placeras i spektrofotometern. Ljus med längd av
260nm sänds genom provet och absorbansen mäts upp. Därefter sänds ljus med längd
av 280nm genom provet och absorbansen mäts.
PCR
PCR(polymerase chain reaction) är en metod för att duplicera en utvald DNA-region.
Metoden använder sig av cykliska temperaturskiftningar för att styra processen, där
varje komplett cykel ger en fördubbling av mängden DNA. Tillväxttakten är alltså
exponentiell och därför kan stora mängder DNA produceras relativt snabbt från en liten
startmängd. Detta görs genom att denaturera DNA:et, alltså sära strandsen vid en
temperatur på 94-98°C. Därefter tillsätter man en primer som binder in till en viss
gensekvens för att “ringa in” vilken del av genen som ska dupliceras. Detta görs vid en
temperatur
på
37-65°C.
Därefter
höjs
temperaturen
till
den
optimala
arbetstemperaturen, vilken är 72°C, för polymeraset som skapar en ny kopierad DNAsträng. Temperaturen höjs åter till 94-98°C för att upprepa processen tills önskad
mängd DNA erhållits. I detta specifika fallet upprepades processen 35ggr. I första
processen använde vi en temperatur på 96°C. I andra processen krävde våra primers,
MA090 och MA025, 60°C.
MA090 och MA025 avgränsar DNA-regionen för en del av cystatin-C-genen.
I tre rör tillsätts en PCR-blandning innehållande DNA, 5µl polymeraset AmpliTaq Gold
spädd 1:10 för att kopiera DNA, 1µl var av primers MA090 och MA025 för att välja
vilken region som skall kopieras, 2,5µl vatten för att spä ut provet, 2µl
dNTP(DeoxyNucleotide mix) som utgör byggstenarna till det nya DNA:et, 1µl
DMSOsom underlättar inbindningen av primers, 2,5µl PCR buffert spädd 1:10 för att ge
optimalt pH-förhållande för reaktionen. PCR-bufferten innehåller även MgCl2, som är en
kofactor till polymeraset och underlättar för en fullständig denaturering av DNA. Utöver
detta tillsätts 10µl DNA-koncentrat i två av rören och 10µl vatten i det tredje röret.
Provröret inehållande vatten agerar blank.
Klyvning med restriktionsenzym
För att avgöra vilken genotyp en person har kan PCR-produkten klyvas med ett
restriktionsenzym. Restriktionsemzymet försöker klyva på den sekvens som är
utmärkande för ena genotypen men saknas i den andra.
I detta fall används SacII och klyningsstället försvinner om basen G ersatts med A på
den platsen. I fallet att SacII inte klyver på klyvningsstället påvisas att personen i fråga
innehar B allelen. Om däremot SacII klyver på klyvningsstället är det en påvisning om
att personen innehar A allelen. Det finns en möjlighet att vara heterocygot i detta fall.
Det innebär att DNA biten klyvs delvis. Man kan genom gelelektrofores ta reda på om
man är homocygot A, homocygot B eller heterocygot A/B. Ursprungssekvensen är
493bp och vid ett homozygot B-resultat kommer ingen klyvning att ske och endast ett
DNA-band av storleken 493bp att kunna detekteras. Vid ett homozygot A-resultat
kommer en total klyvning att ske, vilket resulterar i två DNA-band med storlekarna 350
respektive 143bp. Vid ett heterozygot resultat kommer tre band av storlek 493, 350
samt 143bp att återfinnas.
Experimentellt blandades 12µl PCR-produkt, 1,5µl buffert C spädd 1:10 samt 1,5 µl
enzym SacII i ett eppendorfrör. Blandningen inkuberades i 37 °C över natten.
Gelelektrofores
Gelelektrofores är en metod man kan använda för att separera DNA-fragment med
avseende på storlek. Tekniken utnyttjar det faktum att DNA är negativt laddat genom att
sätta en spänning över ett medium. DNA-fragmenten vandrar då genom mediet i
riktning mot anoden med en hastighet beroende på deras storlek. Ju mindre fragment,
desto snabbare vandrar det. Valet av medium avgörs av storleken på fragmenten. I
detta fall används agaros, då det täcker storleken 100-70.000bp. Våra fragment
förväntas kunna variera mellan 143-493bp i storlek.
Ramen för gelgjutning sätts ihop. 1g agaros och 50mL TBE-buffert hälldes i en E-kolv
och värmdes 2 x 30min i microvågsugn till lösningen blivit klar och ganska lättflytande.
5µl SYBR safe DNA gel stain och den lösta gelen får en rödaktig färg. SYBR safe DNA
gel stain tillsätts för att vid fotografering med UV eller blått ljus, kunna se var DNAbanden befinner sig. Lösningen hälls i ramen och ramen täcks med aluminiumfolie då
SYBR safe DNA gel stain är ljuskänslig. Ramen får stå och stelna i ca 30min. Efter
30min monteras ramen isär och en fast gel av agaros, TBE-buffert och SYBR safe DNA
gel stain har erhållits. Proven tillreds enligt tabell 1.
Prov nr
Prov
Prov volym
H2O
6 x Ficoll
1
Markör
10µl
5µl
3µl
2
Blank
10µl
5µl
3µl
3
Kontroll
Allt (15µl)
--
3µl
4
PCR-produkt 1
10µl
5µl
3µl
5
Klyvning 1
Allt (15µl)
--
3µl
6
PCR-produkt 2
10µl
5µl
3µl
7
Klyvning 2
Allt (15µl)
--
3µl
Tabell 1: Mängder till tillredning av prov för elektrofores på agarosgel.
Ficoll-lösning tillsätts till proven för att dels tynga ner proverna så de ej rinner ut i
bufferten samt för att den ger en blå färg som vandrar lite snabbare än DNA-banden
och påvisar ungefär hur långt elektroforesen har gått.
Gelen läggs i elektroforeskärlet och TBE-buffert hälls på tills brunnarna täcks. Därefter
adderas proverna till brunnarna med pipett. Proverna vandrar under 45minuter under
100 V spänning, och fotograferas därefter på UV-ljusbord.
Resultat
Resultaten för spektrofotometri återfinns i tabell 2. Kvoterna avviker något från
optimalkvoten på 1,8 men är inte så pass avvikande att det skulle påvisa avsaknad av
DNA. Koncentrationerna styrker även att det finns DNA i proven.
Prov
260nm
280nm
Kvot
DNA
konc(µg/mL)
ABS Johanna
0,0282
0,0180
1,567
14,1
ABS Kent
0,0401
0,0210
1,910
20,05
Tabell 2: Resultat för spektrofotometriska mätningar av DNA koncentration och renlighet av prov vid
260nm och 280nm.
Resultaten för gelelektrofores återfinns i bild 1. Det framgår tydligt ur klyvningsmönstret
att båda laboranterna är av genotyp homozygot A.
Bild 1: Prov fr. v. markör(1), blank(2), kontrol(3), PCR-produkt 1(4), klyvning 1(5), PCR-produkt 2(6),
klyvning 2(7). Bilden är ett fotografi av agarosgelen efter elektroforesen. Gelen visar att både Johanna
(klyvning 1) och Kent (klyvning 2) är homocygota A.