Bilaga 1 - Populärvetenskaplig sammanfattning Den populärvetenskapliga sammanfattningen ska publiceras på Jordbruksverket webbplats. Språket ska därför vara lättförståeligt även för de som inte arbetar med försöksdjur samtidigt. Titel l studier av nervsystemets tidiga utveckling under embryogenesen i zebrafisk. Försökets varaktighet lFrån beviljat datum och 5 år framåt, dvs förmodligen 2013-2018 Sökord (nyckelord, max 5) lZebrafisk, nervsystemets utveckling Försökets syfte (enligt 3 kap 1 § SJVFS 2012:26)- markera med kryss Grundforskning Vilka effekter sjukdomar, ohälsa eller annat awikande tillstånd har på människor, djur eller växter samt hur de ska undvikas, förebyggas, diagnosticeras eller behandlas Utvärdering , påvisande, reglering eller modifiering av fysiologiska tillstånd hos människor, djur eller växter Forskning som syftar till förbättring av djurens välfärd Utveckling, tillverkning eller testning av kvalitet, effekt och säkerhet av läkemedel, livsmedel, foder och andra ämnen eller produkter Artskydd Skydd av den naturliga miljön för att bevara människors eller djurs hälsa eller välfärd Rättsmedicinska undersökningar Användning i högskoleutbildning eller i utbildning som syftar till att förvärva, upprätthålla eller utveckla yrkesfärdigheter Upprätthållande av kolonier av genetiskt förändrade djur som inte används i andra försök x l 2(12) Diarienummer Beskriv försökets mål (de vetenskapliga frågorna, eller de vetenskapliga, kliniska behoven som ska mötas). Utvecklingen av det centrala nervsystemet (CNS) är en oerhört komplex process. Forskningen har visat att nervceller och stödceller (glia) bildas genom att stamceller i det tidiga CNS delar sig asymmetriskt och "knoppar av" en stor mängd dotterceller, .::!!-::::: =:!"fe:-s:;!:c:--:!; !!!! ~e~.'~e!!e:- !)~~ ~!!~. ~~~:~e! !:;t:--e~e~~t fe~~me!": §; =tt ~t=mce!!e~ '.'e~::!" ~~~~~= 3'.' ~!!~= ~~2~~ ~~!!~!" '-'!~ ~lika tidpunkter. Detta sker på ett högst reproducerbart sätt, dvs det är alltid en viss nervcellstyp som föds först, en annan senare ~te . Man pratar om tidsmässiga skeenden i stamceller, s.k. temporala förlopp. Detta mycket spännande forskningsfält är dock i ~in linda, och man har en mycket dålig insikt i hur dessa förlopp styrs: t.ex. hur många celltyper kan en viss stamcell bilda över iden, och vilka gener styr detta? För att få en inblick i detta är det essentiellt att kunna följa individuella stamceller inne i ett utvecklande nervsystem. Man måsta sålunda kunna märka in/lysa upp en enda stamcell, och sen följa dess delningar och ~otterceller över tiden. Vi har tidigare använd bananflugan som modellsystem för att uppnå denna upplösning, och har på det lviset lyckats bidra med ett flertal genombrott i förståelsen av temporala förlopp i CNS. Det är dock mycket stora skillnader i stamcellsbiologin mellan bananflugor och ryggradsdjur. Vi ämnar därför använda den kunskap vi vunnit från bananflugan till att studera temporala förlopp i hjärnan hos zebrafisk- en organism som ligger betydligt närmare oss evolutionärt sett. =tt ~år forskning kommer att fokusera på en viss region av hjärnan, där man vet att tre olika celltyper bildas över tiden från en specifik grupp av stamceller: först kommer s.k. motornervceller (de som till slut kontaktar och kontrollerar musklemas ~ammadragning), följt av serotoninceller (mycket viktiga modulatoriska celler) och slutligen gliaceller (hjärnans stödceller). ~enom att märka in enskilda stamceller från denna region kommer vi undersöka huruvida dessa tre celltyper alla tillverkas av ~amma stamcellstyp, eller om det istället handlar om tre olika stamcellestyper, aktiva vid olika tidpunkter, som var och en ~noppar av bara en celltyp. Vi kommer i dessa studier även få svar på hur stamcellens delningsmönster ser ut, hur många celler ~v varje typ som görs, samt om enskilda stamceller följer samma program va~e gång de utvecklas eller styrs av stokastiska processer. Dessa frågor, som är av ytterst central betydelse för vår förståelse av hur hjärnan bildas, har länge stått obesvarade. Parallellt med att vi undersöker hur dessa stamceller bildar sina olika celltyper tänker vi även undersöka de genetiska ~tyrmekanismer som ligger till grund för deras beteende. studier från bananflugan har visat att temporala förlopp i hjärnstamceller styrs av en kaskad av reglergener som är aktiva vid olika tidpunkter under utvecklingen. Genom ett samarbete med prof. Johan Ericson vid Karolinska institutet har vi tillgång till en lista som talar om vilka gener som i möss är aktiva i dessa stamceller vid de tidpunkterna då de gör motornervceller respektive serotoninceller. Med hjälp av denna lista har vi indentifierat ~tt antal reglergener som utifrån sin aktivitetsprofil möjligen är med och bestämmer när en viss nervcellstyp ska sluta att bildas pch nästa påbörjas. Genom att successivt inaktivera dessa kandidatgener och analysera hur bildandet av de olika celltyperna påverkas hoppas vi kunna identifiera nya gener som är med och styr temporala förlopp i ryggradsdjur. Vilka nyttor förväntas komma ur försöket (vilka vetenskapliga framsteg kommer att nås, hur kan människor eller djur dra nytta av försöket)? En ökad kunskap om hur stamceller i hjärnan beter sig under embryonalutvecklingen är av central betydelse inte bara för vår allmänna förståelse av hjärnans funktion utan även för våra möjligheter att i framtiden kunna förebygga och bota sjukdomar och skador som drabbar CNS. Det är t.ex. redan känt att ett flertal sjukdomar i hjärnan orsakas av felaktigheter i bildningen av vissa nervcellstyper under embryonal utvecklingen. Ett stort hopp står dessutom till det framtida användandet av cellbaserade terapier där sjuka eller skadade nervceller ersätts med nya friska celler. Dessa metoder kan aldrig bli säkra eller effektiva utan ökad kunskap om de genetiska program som styr hur dessa celler bildas naturligt under fosterstadiet Utöver dessa generella nyttor så är de specifika celltyper som undersöks i dessa studier av stort kliniskt intresse. En ökad förståelse för hur motornervceller, serotoninceller samt gliaceller bildas kommer att leda till ökade möjligheter att förebygga och behandla sjukdomar såsom ALS, depression, plötslig spädbarnsdöd, samt multipel skleros (MS). Vilka arter ska användas och antalet individer? lZebrafisk, Danio rerio. Vilka är de förväntade negativa effekterna på djuren och vilken är den förväntade svårhetsgraden? Ringa svårighetsgrad. Vi förväntar oss inga negativa effekter på de vuxna djuren. Endast ringa negativa effekter på tidiga embryon, och då före den tidpunkt då de själv söker föda . 3R-aspekter 1. Ersätta (Replace) Förklara varför djur måste användas och varför djurfria alternativ inte kan användas. Utvecklingen av CNS är en oerhört komplex process, som utspelar sig i en intrikat tredimensionell miljö där alla celler är mer eller mindre beroende av ett specifikt cellulärt samspel för att utvecklas korrekt. Därför är det oftast absolut nödvändigt att studier av nervsystemets utveckling görs in vivo, i fixerade eller levande embryon. l vissa sammanhang kan man få viss inblick i stamcellers beteende genom in vitro-studie r, men ett stort problem med denna metodik är att så snart en stamcell tas ur dess naturliga miljö så ändrar den till viss eller stor del sin identitet och sitt beteende, varpå resultaten förlorar sin giltighet. Förklara hur ni har försäkrat er om att använda så få djur som möjligt. l 3(12) Diarienummer l denna undersökning kommer vi enbart att utföra försök på embryon medan vuxna fiskar hålls för avel. Tack vare att zebrafiskar lägger många ägg kan en betydligt mindre grupp vuxna djur hållas gående för experimenten än vad som vore fallet vid försök på andra ryggradsdjur, som t.ex. mus. Vidare kommer stammar endast att tas hem vid den tidpunkt de behövs för de planerade experimenten och kommer att avslutas så snart samtliga experiment de är avsedda för är avslutade, för att säkerställa att så få fiskar som möjligt används. Inga fler embryon än vad som är nödvändigt för att nå adekvat statistisk styrka kommer att användas. 3. Förfina (Refine) Förklara valet av art och varför den valda djurmodellen är den mest förfinade. Beskriv de insatser som görs för att minimera djurens eventuella lidande. Vi har tidigare utfört, och utför kontinu erligt, studier på nervsystemets utveckling i evertebrater (bananfluga). Även om detta system är ett utmärkt pionjärsystem där kunskap kan vinnas som vägleder försök i andra organismer så är skillnaden i biologin mellan bananfluga och ryggradsdjur många gånger för stor för att de erhållna resultaten ska vara brett tillämpbara på människan. Såvitt vi kan bedöma det är zebrafisk det ryggradsdjur som erbjuder den bästa kompromissen mellan förmåga att känna lidande och möjligheten att erhålla resultat som har bäring på människans biologi. Zebrafisk erbjuder dessutom ett antal fördelar som gör dem bättre lämpade för dessa studier än "högre" ryggradsdjur. Ett centralt metodologiskt krav för att kunna studera hur en hjärnstamcell ändrar sitt beteende med tiden är nämligen att i försök efter försök kunna komma tillbaka till samma stamcelL Detta är rent tekniskt mycket svårt att åstadkomma i däggdjur eftersom dessa embryon utvecklas inne i mamman. Zebrafiskar, däremot, utvecklas utanför mamman, vilket gör det enkelt att applicera olika cellinmärkningsmetoder såsom celltransplantation och injektion av självlysande markörer. Äggets genomskinlighet gör det dessutom möjligt att följa utvecklingen av cellinjer under mikroskop under långa tidsperioder, vilket är omöjligt i högre ryggradsdjur. Alla försök i denna studie utförs på embryon innan de är tre dagar gamla. På grund av försökens utformning, och embryonas låga ålder, förväntar vi oss inget, eller ett mycket ringa, lidande för dessa djur. De vuxna djuren som hålls för att producera dessa embryon är antingen av vildtyp eller är stammar som bär på gener för självlysande proteiner vilka är helt ofarliga för djuren. Dock föreligger det alltid en risk för minskad hälsa på grund av de genetiska varianter de är bärare av, samt på grund av normalt förekommande sjukdomar och skador. Därför tillämpas regelbunden tillsyn av djuren och sådana fiskar som uppvisar tecken på sjukdom eller lidande avlivas snarast efter nedsövning. Följande ska fyllas i av nämnden Försökets svårhetsgrad O Ringa svårhet O Måttlig svårhet O Avsevärd svårhet O Terminal O Terminal/organ Utvärdering i efterhand Försöket ska utvärderas i efterhand O Ja O Nej Om ja, ange i vilka delar och ur vilken aspekt. Tillägg eller ändringar som p åverkar den populärvetenskapliga sammanfattningen Observera att nämnden här endast ska notera ändringar eller tillägg som behövs för att den populärvetenskapliga sammanfattningen ska bli korrekt. l Diarienummer 4(12)