Forskningsplan

Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Protokoll
Prospektiv kartläggning av samhällsförvärvad norovirusenterit
Bakgrund
Noro- och sapovirus, som tillsammans bildar gruppen humana calicivirus, orsakar
mer än hälften av alla akuta infektiösa gastroenteriter (GE) och mer än 90% av alla
icke-bakteriella GE i västvärlden [1]. I USA beräknas minst 23 miljoner individer
insjukna i calicivirusenterit varje år [2]. Noro- och sapovirus ger akut sjukdom med
kräkningar och diarré (”vinterkräksjuka”,) som vanligen pågår i något eller några dygn
hos friska personer. Antalet utbrott av norovirusenterit (NVE har ökat sedan 2003 [3].
Trots att symtomen snabbt går över utan behandling utgör NVE ett betydande
medicinskt och vårdhygieniskt problem inom den moderna sjukvården. Norovirus är
mycket smittsamt och den genogrupp av norovirus, GII [4] som hittats i majoriteten
av utbrotten sedan 2003 tycks överföras lättare från person till person än tidigare
varianter [3]. Vanliga hygienrutiner för undvikande av smittspridning är ofta
otillräckliga. Mekanismerna bakom den dramatiska smittspridningen särskilt i
sjukhusmiljö är ofullständigt klarlagda. Att med ledning av kliniska symtom skilja NVE
från andra orsaker till diarré och kräkning kan i många fall vara omöjligt, vilket
försvårar bedömning av adekvat vårdnivå och behov av isolering på infektionsklinik.
Cirkulerande stammar av norovirus genomgår en ständig genetisk förändring,
"antigen drift", vilket ger förutsättningar för nya utbrott varje säsong [4]. Flera nyligen
publicerade studier har påvisat långvarigt bärarskap hos såväl immunsupprimerade
som immunfriska individer [5, 6]. Betydelsen av detta bärarskap är okänd men en
snabb genetisk förändring hos viruset har påvisats hos immunfriska bärare [6, 7].
NVE har potential att orsaka överdödlighet liknande den vid influensaepidemier [3, 8].
Omfattningen av och vilka grupper av individer som drabbas av överdödlighet är inte
känd. Man beräknar dock att 200 000 barn under 5 år dör på grund av
calicivirusenterit varje år i utvecklingsländer [9].
Calicivirus påvisades ursprungligen med hjälp av elektronmikroskopi [10] vilket är en
kostsam och tidskrävande procedur. Vid Virologiska laboratoriet har vi utvecklat en
modern realtids-PCR-baserad diagnostik som snabbt och enkelt kan påvisa norooch sapovirus med hög sensitivitet och specificitet i prov från feces och/eller kräkning
[11]. Metoden tillåter också en ungefärlig skattning av mängden virus i provet.
Syfte
Studiens syfte är i första hand att karlägga symtombild, sjukdomsduration och längd
av bärarskap vid samhällsförvärvad NVE genom diagnostik av norovirus med realtids
PCR hos sjukhusvårdade patienter. Studien syftar också till att kartlägga mortaliteten
vid NVE.
Primära frågeställningar:
Hur många patienter med NVE förblir bärare av virus i tarmen under lång tid (>3
veckor)?
Leder NVE till ökad dödlighet? I så fall hos vilka individer och i vilka åldersgrupper?
Sekundära frågeställningar:
Vilka andra sjukdomar har patienter med NVE?
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Kan svalprovtagning användas för att detektera norovirus (hos patienter med
kräkningar)?
Hur varierar mängden norovirus i kräkning resp feces i relation till sjukdomsduration
(skattas genom semikvantitativ realtids PCR-metodik?
Vilka virusgenotyper dominerar vid samhällsförvärvad NVE?
Finns det något samband mellan virusgenotyp eller långvarigt bärarskap av virus i
tarmen och inflammationsmarkörer (IP10, CRP, cytokiner etc) i serum/blod/feces?
Finns det något samband mellan virusgenotyp och kliniska symtom respektive längd
av bärarskap?
Hur utvecklas virusgenomet hos långtidsbärare över tid hos immunfriska respektive
immunsupprimerade långtidsbärare?
Förekommer viremi vid NVE hos vuxna och i så fall i vilken frekvens?
Metod
Realtids-PCR
För påvisning av virus görs först extraktion av viral nukleinsyra (från faeces eller
kräkning) med Magnapurerobot och därefter realtids-PCR i flera parallella reaktioner
med reagens som kan påvisa norovirus genogrupp I och II, sapovirus, rotavirus,
adenovirus och astrovirus. Metoden har till huvuddelen utvecklats vid
viruslaboratoriet, SU, och har konstruerats för att påvisa majoriteten av kända
subtyper av dessa virus [11].
Sekvensering
Sekvensering av olika virusstammar kommer att göras för att avgöra om skillnader i
virusgenomets nukleotidsekvens kan förklara skillnader i bärarskapets längd eller
symtombild. Stammar från olika prov från samma patient kommer analyseras för att
studera virusets mutationsbenägenhet över tid hos immnfriska respektive
immunsupprimerade långtidsbärare. För att genotypa och subgenotypa norovirus
sekvenseras en del av genomet och jämförs mot kända stammar från genbanken. En
PCR reaktion med flera specifika primers används för att amplifiera överlappande
fragment av ORF1 och ORF2 (ca 1000 baspar, position 4500 och 5500 i genomet)
[12]. Efter rening av amplicon görs en cyklisk sekvensering med samma primers som
i PCR-reaktionen och med BigDye terminator kit (Applied Biosystems) som innehåller
fluorescensmärkta ddNTP. Varje amplicon sekvenseras i båda riktningar (sense och
antisense) med ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Sekvenserna analyseras
därefter med dataprogrammet Sequencher.
Studiens upplägg
Patienter som läggs in på infektionskliniken, SU/Östra på misstanke om gastroenterit
tillfrågas om deltagande i studien. Provtagning sker med flockad pinne (svabb) från
svalg (om kräkning) och ändtarmsöppning i samband med inklusion. Dessutom tas
serum och EDTA blodprov. Symtom och vitalparametrar registreras i webbaserat
CRF. I samband med utskrivning tas nytt prov med flockad pinne från
ändtarmsöppningen. Samtliga patienter kontaktas dag 7 efter insjuknandet för
intervju av studiesköterska. Samma dag tar patienten själv prov för norovirusPCR
från ändtarmsöppningen och skickar detta till Virologiska laboratoriet. Patienter som
är positiva med norovirusPCR dag 7 följs upp med ny provtagning och telefonintervju
dag 14, 21, 28, 56, och 84 eller tills provet blir negativt.
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Studiepopulation och statistisk styrka
Under tre år tillfrågas alla vuxna (≥18 år) patienter som har diarré och/eller
kräkningar och blir inlagda på infektionskliniken under NVE säsong (november till och
med april) om deltagande i studien. Uppskattningsvis 400 patienter per år beräknas
bli inkluderade. Kontroller och provtagning sker enligt ovan. Uppgift om mortalitet på
sjukhus och efter 30 och 90 dagar efter insjuknandet kommer att inhämtas genom
journalgenomgång.
Långtidsbärare av norovirus kommer att identifieras. Dessa kommer att undersökas
särskilt noggrant. Prover positiva för norovirus med PCR kommer att sekvenseras för
att studera viral evolution över tid. Om möjligt kommer vi att jämföra immunfriska och
immunsupprimerade långtidsbärares virusstammar mot varandra.
Kontroller
Studiens karaktär är deskriptiv och ingen intervention förkommer. I den del där vi
studerar mortaliteten på sjukhus kommer för varje fall 2 åldersmatchade kontroller
utan gastroenterit väljas bland patienter som vårdas under samma tidsperiod på
medicinkliniken, SU/Östra.
Data från en retrospektiv studie tyder på att mortaliteten är högst vid
samhällsförvärvad NVE i åldersgruppen >80 år. 30-dagarsmortaliteten var 18,5%
jämfört med 8,5% hos åldersmatchade kontroller (Gustavsson et al opublicerade
data). Vi beräknar att studien kommer inkludera 500 patienter med
samhällsförvärvad NVE och att knappt hälften av dessa kommer vara >80 år
(n=200). Ovanstående antaganden ger studien en statistisk styrka på 80 % att
upptäcka en ökning av 30-dagarsmortaliteten från 10 till 20% hos patienter äldre än
80 år.
Chi Squared test kommer att användas för att jämföra proportioner.
Inklusion
Inklusionskriterier: 1. Ålder ≥18år 2. Kräkning och eller diarré 3. Symtomduration ≤5
dagar
Exkluderade patienter skall föras in i Reject Log.
Innan patienten inkluderas skall denne/a informeras muntligt och skriftligt (se
patientinformation) av behandlande läkare eller studiesköterska och ge sitt skriftliga
samtycke till deltagande i studien.
Varje inkluderad patient får ett unikt studienummer. Nyckel till studienummer skall
föras och förvaras av studiesköterska.
I journalen skall noteras att : ”Patienten inkluderas i NVE-studien som syftar till att
kartlägga symtom och bärarskap vid NVE. Patienten erhöll studienummer
NV001….X. Ansvarig för studien på Infektion SU/Östra är Överläkare Lars-Magnus
Andersson.”
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Kontroller och provtagning
Efter inklusion registreras vitalparametrar och resultat av rutinprovtagning (hämtas
från inskrivningsjournal, för detaljer se CRF). Prov för norovirusPCR tas med flockad
pinne från svalg (om kräkning senaste 24 timmarna) och ändtarmsöppning.
Dessutom tas serum och EDTA-blod. Observera att proverna (svalg,
ändtarmsöppning, serum och EDTA-blod) endast skall märkas med patientens
studienummer. För studien unika remisser märkta med studienummer skall följa med
proverna till Viruslaboratoriet. Nytt prov för norovirusPCR tas från äntarmsöppning i
samband med utskrivning. Studiesköterska kontaktar patienten dag 7, 14, 21, 28, 56,
och 84 för intervju och provtagning med norovirusPCR.
CRF
Data förs in i webbaserat CRF. I CRF kan inkluderade patienter endast identifieras
med hjälp av studienummer. CRF är lösenordsskyddat och endast
forskningssjuksköterska och forskare har tillgång till CRF.
Ansvariga för studien
Johan Westin
Infektion och Virologen
SU/Östra
41685 Göteborg
tel 031-3435526
epost: [email protected]
Lars Gustavsson
Medicinkliniken
Kungälvs sjukhus
Lars-Magnus Andersson
Infektion
SU/Östra
41685 Göteborg
tel 031-3435841
e-post: [email protected]
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Referenser
1. Widdowson MA, Monroe SS, Glass RI. Are noroviruses emerging? Emerging
infectious diseases. 2005 May;11(5):735-7.
2. Mead PS, Slutsker L, Griffin PM, Tauxe RV. Food-related illness and death in the
united states reply to dr. hedberg. Emerging infectious diseases. 1999 Nov;5(6):8412.
3. Kroneman A, Verhoef L, Harris J, Vennema H, Duizer E, van Duynhoven Y, et al.
Analysis of integrated virological and epidemiological reports of norovirus outbreaks
collected within the foodborne viruses in Europe Network from 1 July 2001 to 30
June 2006. Journal of clinical microbiology. 2008 Sep;46(9):2959-65.
4. Donaldson EF, Lindesmith LC, Lobue AD, Baric RS. Norovirus pathogenesis:
mechanisms of persistence and immune evasion in human populations.
Immunological reviews. 2008 Oct;225:190-211.
5. Kirkwood CD, Streitberg R. Calicivirus shedding in children after recovery from
diarrhoeal disease. J Clin Virol. 2008 Nov;43(3):346-8.
6. Siebenga JJ, Beersma MF, Vennema H, van Biezen P, Hartwig NJ, Koopmans M.
High prevalence of prolonged norovirus shedding and illness among hospitalized
patients: a model for in vivo molecular evolution. The Journal of infectious diseases.
2008 Oct 1;198(7):994-1001.
7. Nilsson M, Hedlund KO, Thorhagen M, Larson G, Johansen K, Ekspong A, et al.
Evolution of human calicivirus RNA in vivo: accumulation of mutations in the
protruding P2 domain of the capsid leads to structural changes and possibly a new
phenotype. Journal of virology. 2003 Dec;77(24):13117-24.
8. Kanerva M, Maunula L, Lappalainen M, Mannonen L, von Bonsdorff CH, Anttila
VJ. Prolonged norovirus outbreak in a Finnish tertiary care hospital caused by GII.42006b subvariants. The Journal of hospital infection. 2009 Mar;71(3):206-13.
9. Patel MM, Widdowson MA, Glass RI, Akazawa K, Vinje J, Parashar UD.
Systematic literature review of role of noroviruses in sporadic gastroenteritis.
Emerging infectious diseases. 2008 Aug;14(8):1224-31.
10. Kapikian AZ, Wyatt RG, Dolin R, Thornhill TS, Kalica AR, Chanock RM.
Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with
acute infectious nonbacterial gastroenteritis. Journal of virology. 1972
Nov;10(5):1075-81.
11. Nenonen NP, Lindh M, Hannoun C. Experience of a real time Taqman system
detecting Norovirus Genogroup I and II strains implicated in gastroenteric outbreks,
West Sweden. manuscript. 2009.
12. Nenonen NP, Hannoun C, Horal P, Hernroth B, Bergstrom T. Tracing Norovirus
outbreak strains i bivalves. Abstract. 2007;13th international Bioinformatics
Workshop on Virus Evolution and Molecular Epidemiology, Lisbon, Portugal.
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Screening och Inklusion
Ja
Ålder  18 år
Kräkning och /eller diarré
Symtomduration  5 dagar
Skriftligt samtycke
Nej
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Dag 0 (inklusionsdagen)
Studienummer och initialer
Dagens datum
Insjuknandedatum
Inskrivningsdatum
Annan sjukdom
Diabetes, Hjärtkärlsjukdom, immunbrist (hiv,
prednisolon, organtx, cellgift,
remicade/mabthera), njursvikt, malignitet,
kronisk infl tarmsjukdom, inflammatorisk
systemsjukdom
Ålder
Kön
CRP (om taget)
Hb
K
krea
laktat
Allmäm fecesodl ja/nej/resultat
Clostridietoxin ja/nej/resultat
Bltr (hämtas från inskrivningsjournal)
Puls
POX
Temperatur
Andningsfrekvens
Symtom (vid något tillfälle sedan insjuknandet)
Ja
Feber  38 grader Celsius
Diarré (dag 0 antal, dag -1 antal etc)
Kräkning (dag 0 antal, dag -1 antal etc)
Illamående
Omgivningsfall (hushåll,arbete,skola eller motsv.)
Pinnprov från svalg
Pinnprov från ändtarm
Serumprov
EDTA-blodprov
Resultat svabb svalg
Noro, typ, sapo, adeno,
astro, entero, rota ct
Resultat svabb ändtarm
Noro, typ sapo, adeno,
astro, entero, rota ct
Nej
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Utskrivning
Dagens datum
Symtom (samma dygn som utskrivning)
Ja
Feber  38 grader Celsius
Diarré ( antal)
Kräkning (antal)
Illamående
Utskrivningsdiagnos
Pinnprov från ändtarm
Avliden (datum)
Resultat svabb ändtarm
Noro, typ, sapo, adeno,
astro, entero, rota ct
Nej
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Dag 7
Dagens datum
Symtom (samma dygn)
Ja
Diarré ( antal)
Kräkning (antal)
Om nej datum för symtomfrihet
Datum för två normala avföringar
Pinnprov från ändtarm
Avliden (datum)
Resultat svabb ändtarm
Noro, typ sapo, adeno,
astro, entero, rota ct
Nej
Samhällsförvärvad NVE, Westin et al.
Dag 14, 21, 28, 56, 84
Dagens datum
PCR pos dag 7, 21, 14, 28, 56, 84 (eller
Ja
symtom)
Symtom (detta dygn) (om ja ovan)
Diarré ( antal)
Kräkning (antal)
Om nej datum för symtomfrihet
Datum för två normala avföringar
Pinnprov från ändtarm
Avliden (datum)
Resultat svabb ändtarm
Noro, typ sapo, adeno,
astro, entero, rota ct
Nej