Cirkulerande cellfritt DNA

Cirkulerande cellfritt DNA
- en introduktion
Anne Ricksten
Equalismöte 2016-11-14
Vad är cirkulerande fritt DNA (cfDNA)?
 Extracellulärt DNA som finns i cirkulationen
 Fragmenterat DNA, medelstorlek på ca 180 bp
 Kan detekteras i blod, urin och likvor
 Upptäckten av extracellulärt DNA i humant blod
gjordes redan 1948
 Kommande decennier påvisades DNA
extracellulärt hos många levande arter
 Finns i mkt låga nivåer hos friska personer
 Förhöjda nivåer vid olika sjukdomstillstånd och
trauma
3
Mekanismer bakom cfDNA
 Nekros av celler
 Apoptos av celler
 Aktiv frisättning av DNA från viabla celler
4
cfDNA kan vara inblandat vid tumörspridning
 cfDNA finns i exosomer
 Exosomer är små virusliknande partiklar som
transporterar genetiskt material och
signalsubstanser från en cell till en annan.
6
Förutom DNA frigörs även andra
nukleinsyror




Mitokondrie DNA
mRNA
Icke-kodande RNA
mikroRNA
8
Stort intresse för cfDNA som ny biomarkör
 Källa för genetiskt material från:
-fostervävnad
- solida tumörer
- transplanterade organ
 Tillstånd som tidigare, eller fortfarande,
kräver invasiv provtagning
9
Kliniska applikationer
 NIPT (non-invasive prenatal testing)
- i mammans blod finns små mängder DNA från
fostret som kan användas för fosterdiagnostik
 Solida tumörer
- upprepad provtagning ger information om tumörstatus,
uppföljning av behandlingseffekt, resistensutveckling mm
 Organtransplantation
- vid rejektion ökar mängden cfDNA från det transplanterade
organet
10
”Liquid biopsy”
11
Utmaningar med cfDNA
 Förekommer i mycket låga koncentrationer,
2-10 ng/ml plasma hos friska individer
 Fragmenterat, små DNA molekyler
 Kort halveringstid pga Dnase aktivitet
 Hög risk för bakgrund av gDNA pga lyserade
blodceller
12
Nya tekniker som gör det möjligt att detektera DNA
vid mkt låga koncentrationer
 NGS, djupsekvensering
 Digital PCR
13
Anders Ståhlberg,GU
Forskningsstudie vid SU
 Transplantationscentrum på SU
 Kan cfDNA analys ersätta invasiv
provtagning?
 Klinisk användbar markör?
15
Analys av cfDNA i blod: egna erfarenheter





Preanalytisk hantering av provet
Extraktionsmetod
Kvantifiering av total mängd cfDNA
Preamplifiering
Analysmetod
17
Preanalytisk hantering av blodprov
 Stor risk för bakgrund pga genomiskt DNA från
lyserade celler
 Plasma eller serum?
 Tid från provtagning till hantering?
 Provtagningsrör?
18
 Plasma ger mindre bakgrund än serum
 EDTA-rör vid snabb hantering
 Specialrör vid provtagning då provet inte kan tas
om hand direkt
 Undvik frysning!
19
Tvåstegs centrifugering av plasma
 2000xg i 10 min överför supernat. med
god marginal till Eppendorfrör
 16000xg i 15 min överför supernat. till nytt
Eppendorfrör
 Förvaras vid -80C
20
Biobank/serum
 Forskningsstudier baserade på
biobanksprover
 Biobanksprover är ofta serumprover
 Medveten om risken med bakgrund
 Hur länge proverna frysförvarats
21
Extraktionsmetod




Vi har testat 3 olika kit för cfDNA extraktion
Utbyte (tillsätta markör DNA innan extraktion)
Fragmentstorlek
Inhiberande faktorer
22
Kvantifiering av total mängd cfDNA
 För låga nivåer för att kunna detekteras
med UV-kvantifiering
 Qubit mätning, baserad på fluorometrisk
kvantifiering
 Realtids PCR
23
Koncentrationsbestämning Qubit
Qubit (ng/µL)
160324
Qubit (ng/µL)
160414-1
Qubit (ng/µL)
160414-2
Qubit (ng/uL)
160502 Stefan
Utbyte totalt (ng/mL
plasma)
cf-DNA normal 1
NORGEN 4 mL
0,94
0,87
10,9
cf-DNA normal 2
NORGEN 4 mL
0,43
0,38
4,8
cf-DNA normal 3
NORGEN 4 mL
-
0,212
25
11
81
6
0,154
4
3,3
57
4,6
QIAamp circ 1 mL
0,138
3,4
61
4,1
QIAamp circ 1 mL
0,214
6,4
2,02
NORGEN 1 mL
QIAamp 1 mL
0,23
2,82
0,22
2,69
QIAamp circ 1 mL
cf-DNA normal 4
NORGEN 4 mL
0,39
NORGEN 1 mL
QIAamp 1 mL
0,32
Low
3,28
0,066
1,89
QIAamp circ 1 mL
cf-DNA normal 5
NORGEN 1 mL
QIAamp 1 mL
cf-DNA normal 6
Low
1,44
0,069
2,02
24
Digital PCR för analys av cfDNA
25
Koncentrationsbestämning Qubit
Qubit (ng/µL)
160324
Qubit (ng/µL)
160414-1
Qubit (ng/µL)
160414-2
Qubit (ng/uL)
160502 Stefan
Utbyte totalt (ng/mL
plasma)
cf-DNA normal 1
NORGEN 4 mL
0,94
0,87
10,9
cf-DNA normal 2
NORGEN 4 mL
0,43
0,38
4,8
cf-DNA normal 3
NORGEN 4 mL
-
0,212
25
11
81
6
0,154
4
3,3
57
4,6
QIAamp circ 1 mL
0,138
3,4
61
4,1
QIAamp circ 1 mL
0,214
6,4
2,02
NORGEN 1 mL
QIAamp 1 mL
0,23
2,82
0,22
2,69
QIAamp circ 1 mL
cf-DNA normal 4
NORGEN 4 mL
0,39
NORGEN 1 mL
QIAamp 1 mL
0,32
Low
3,28
0,066
1,89
QIAamp circ 1 mL
cf-DNA normal 5
NORGEN 1 mL
QIAamp 1 mL
cf-DNA normal 6
Low
1,44
0,069
2,02
26
– Optimal mängd plasma vid
extraktion: 1-4 ml
– Större volymer ger inte mer
utbyte av cfDNA
Kvantifiering av cfDNA med realtids PCR
Fragmentstorlek cellfritt DNA
 Ca 60-500bp fragment
 180 bp fragment i
majoritet
180 bp
 Vid vissa tillstånd med
uttalad apoptos kan
längre cfDNA fragment
deteketeras (ca 5000bp)
29
PCR analys,1200 bp produkt.
gDNA (20ng-1ng) och cfDNA (2,5 och 4 ng) från samma individ
Budget 2014
31
Preamplifiering av cfDNA
 Vi har testat att amplifiera allt cfDNA
med två olika kit
 Specifik amplifiering av target
 Blandade prover med låga allelfrekvenser
 Slutsats: Ingen linjär amplifiering, dvs vissa
alleler amplifieras mer än andra
32
Konsekvenser av att cellfritt DNA är fragmenterat
180 bp
Intakt DNA
Cellfritt DNA
Assay längd
Känsliga mätningar kräver korta assays för att undvika onödiga förluster
SNP genotypning med digital PCR
Studiedesign, workflow
 Identifiering av SNPs homozygota hos patienten,
40 assays, (allel frekvensen är 0,5) på gDNA
 50% av assays är homozygota för AA eller BB
 Screening på cfDNA från patienten
 Testa dessa assays på donator gDNA
 Ca 25% (5) går bort pga samma homozygota SNPs
 Ca 50% (10) är heterozygota hos donatorn AA/AB eller
BB/AB
 Ca 25% (5) är homozygota hos donatorn men
heterozygota jämfört med patienten AA/BB eller BB/AA
36
Vi som jobbar med projektet:




Carina Wasslavik, Klinisk kemi, SU
Julia Asp, Klinisk kemi, SU
Jens Böhmer, Kardiologi, SU
TATAA-Biocenter,Göteborg
Tack!
Budget 2014
38