Slutrapport (2006-10-31) för projektet:
”Identifiera de främsta ”flaskhalsarna” för att uppnå höga halter av
ovanliga fettsyror i nya oljegrödor.”
Projekttid (2003-01-01 - - 2005-12-31)
Projektansvarig: Anders S. Carlsson
Medsökande: Sten Stymne
Inledning
Forskningsprogrammet som Stiftelsen Svensk Oljeväxtforskning har varit med och
delfinansierat (360 000 SKR) är mycket ambitiöst i sin målsättning. Det övergripande
målet för programmet är att på sikt utveckla nya oljegrödor som producerar råvarorna
för framtidens kemisk-tekniska industri. Som ett mått på entusiasmen inför uppgiften
stod att läsa i beskrivningen av forskningsprogrammet att ”vi är mycket optimistiska
om att kunna lösa den flaskhals som de låga halterna av de ovanliga fettsyrorna
utgör” och att ”vi har satt som mål att öka halterna av epoxy och acetylenfettsyror i
fröolja hos transgena växter till en för industrin intressant nivå”.
De senaste årens forskning har lärt oss att processerna i växten som vi arbetar med
är komplexa med många olika faktorer inblandade. Att lösa ”flaskhalsarna” fordrar
stora resurser, kräver en bred medverkan av olika forskargrupper och realistiskt tar
längre tid än tre år att realisera. Mot denna bakgrund är Stiftelsens långsiktiga syn på
sitt stöd särskilt uppmuntrande.
Trots vår begränsning och små finansiella resurser, har forskningsarbetet varit
mycket framgångsrikt och vi har kunnat identifiera flera viktiga pusselbitar inom
området. Detta har i sin tur tagit oss ett par steg närmare de framtida grödorna som
producerar industrioljor.
Vi vill också peka på nätverket av kollegor på nationell och internationell nivå som
fortsatt att utvecklas starkt under de senaste fem åren. Samarbete inom nätverket är
en utomordentlig viktig faktor för framstegen inom forskningsområdet och dess
fortsatta framgångsrika utveckling.
Under de gångna åren har forskningsprogrammet varit uppdelat på 4 områden enligt
nedan. Vart och ett av områdena inriktar sig på specifika problem i produktionen av
tekniska fettsyror i en transgen växt/gröda.
I. Undersöka en tänkbar störning/inhibering av det endogena Δ12-desaturas enzymet orsakad av
en homologibaserad protein interaktion från Δ12-epoxygenas enzymet eller Δ12-acetylenas
enzymet och/eller blotta närvaron i membranet av de ovanliga fettsyrorna i sig själva.
II. Studera aktivitetsnivån av epoxygenas och acetylenas enzymen samt deras samspel med det
endogena Δ12-desaturas enzymet och dess betydelse för ackumuleringen av epoxy och
acetylenfettsyrorna.
III. Identifiera funktionen och karakterisera biokemiskt de enzym som medverkar till att föra bort
ovanliga fettsyror från cellmembran
IV. Identifiera funktionen och karakterisera biokemiskt de enzym som medverkar till att kanalisera
ovanliga fettsyror till fröoljan (triacylglycerol).
Den forskningsfinansiering som SSO har ställt till vårt förfogande har främst
finansierat forskningsarbete under område III och till en viss del också område IV.
Redogörelse för detta arbete och vilka resultat som forskningen har producerat
presenteras nedan.
1
Redogörelse för forskningsarbetet och resultat.
Bakgrund
Industriellt intressanta oljor produceras i hög mängd och lagras upp i fröer hos olika
vilda växter runt om i världen. Till mellan 60 och 90 % består dessa olika oljor av en
så kallad teknisk fettsyra. Beroende av vilken olja, kan fettsyran vara av typen epoxy,
acetylen, hydroxy, konjugerad eller annan fettsyra. För att dessa biologiskt baserade
tekniska fettsyror skall kunna komma i fråga som råvaror för den kemisk-tekniska
industrin, krävs att fettsyrorna går att producera i jordbruksgrödor med hög
avkastning. När vi och andra forskargrupper har överfört denna produktion av
fettsyror till transgena oljegrödor eller modellväxter, har endast låga mängder av de
tekniska fettsyrorna lagrats upp i fröoljan. När vi sökt efter orsaken till den låga
avkastningen har vi gjort observationen att fettsyrorna lagras inte bara upp i fröoljan
hos de transgena växterna utan återfinns också i fetter som bygger upp
cellmembranen. I de vilda växter från vilka vi har hämtat produktionsegenskapen för
de tekniska fettsyrorna, återfinns dessa endast i fröoljan. Eftersom de fysikaliska
egenskaperna av många av de tekniska fettsyrorna är ganska annorlunda jämfört
med vanliga fettsyror, är det tänkbart att själva bortförande av de tekniska fettsyrorna
från membranen är en väsentlig mekanism för att uppehålla membranintegritet och
cellviabilitet. Vår slutsats är att vilda växter med hög halt av en teknisk fettsyra har
också utvecklade mekanismer, som dels håller cellmembranen rena från tekniska
fettsyror och dels selektivt lagrar upp dess i fröoljan. Forskningsarbetet under
delområde 3 och 4 handlar om att förstå och identifiera dessa mekanismer och göra
det möjligt att kombinera dem med produktionen av de tekniska fettsyrorna.
Sedan tidigare hade vi identifierat ett enzym från jäst som
visade sig kunna öka oljebildningen i jäst (Figur 1). Enzymet,
PDAT (phospholipid diacylglycerol:acyltransferas), visade
sig också ha en kapacitet att överföra vissa tekniska fettsyror
från membranfett till fröoljan (TAG) enligt figur 2. Vi visste
också att det fanns samma typ av enzym hos växter t.ex.
flera enzym i modellväxten Arabidopsis med hög likhet till
jäst PDAT. Under delprogram 3 och 4 har vi gått vidare och
undersökt dessa växt-PDAT enzym.
Figur 1. Jäst PDAT uttryckt i
jäst och i jämförelse med en
kontroll (vector). Resultatet
visar att PDAT medför en
kraftigt ökad olje-bildning
(TAG)
Membranfett
Vanlig fettsyra
Fettsyra
modifierande
enzyme
DAG
Tekniska fettsyror
(t.ex. hydroxy,
epoxy, acetylen,
konjugerade)
PDAT
OH
CPT
DGAT1
CoA
CoA
OH
TAG (fröolja)
Figur 2. Skiss av PDAT enzymets funktion.
PDAT flyttar den mellersta fettsyran på en
membranlipid (fosfolipid) till en diacylglycerol
och bildar på så sätt en triacylglycerol (TAG)
molekyl.
I Arabidopsis finns sex gener (homologer)
vars protein sekvens har en hög likhet med
varandra och med det ursprungliga PDAT
enzymet från jäst. Proteinsekvenser för dessa
sex växthomologer har lagts in i ett
fylogenetiskt diagram (Figur 3) som visar hur
lika varandra de är. Av detta kan man se att
två av proteinerna bildar en grupp (PDAT1
och PDAT ?) och en annan grupp utgörs PLA
2
At1g04010
PSAT
Mus LCAT
Råtta LCAT
Människa LCAT
Människa PLA2
At1g27480 ?
At3g03310
PLA 1
At4g19860
PLA 2 ? Fröspecifikt
At5g13640
PDAT 1
At3g44830
PDAT ? Fröspecifikt
1 och PLA ?. Av de återstående två
visar Atg27480 en nära likhet med
PDAT-liknande
proteiner
från
människa, mus och råtta och det
sjätte (PSAT) en mer avlägsen
likhet till desamma. Det kan noteras
att två av homologerna, PLA 2? och
PDAT? är fröspecifika och därför
intressanta kandidater för att
modifiera fröoljan.
Figur 3. Fylogenetiskt diagram över PDAT-liknande
växtgener. I diagrammet visas också liknande gener
från mus, råtta och människa.
PDAT 1
Efter att ha isolerat fram växt PDAT enzymet (PDAT 1) och studerat detta i speciella
enzymsystem har vi visat (publikation 1) att också växtenzymet kan föra över
tekniska fettsyror från en membranlipid och till diacylglycerol (DAG) och producera
triacylglycerol (TAG) (Figur 2). Vår hypotes var att detta skulle kunna ha en betydelse
vid ackumuleringen av tekniska fettsyror i fröoljan. När vi uttryckte PDAT 1 i
Arabidopsis fann vi inte någon påverkan på oljeupplagringen i fröet. Det är möjligt att
detta PDAT1 enzym har en roll i växten som mer har att göra med att hålla
membranen rena från främmande fettsyror som den deponerar i form av
triacylglyceroler (vilka sedan snabbt bryts ner) än att det har en roll i oljeupplagringen
i växtens frön. Vi har visat att PDAT1 har en hög specificitet att flytta tekniska
fettsyror som t.ex. hydroxy- och epoxy-fettsyror vilka också kan anses representera
främmande fettsyror i membranet. Enzymet är dessutom ungefär lika aktivt i
vävnader som rot, blad, blommor och frön vilket talar för en allmän eller generell
uppgift i hela växten.
Vi fann ingen uppmätbar påverkan på halten av tekniska fettsyror i fröoljan när PDAT
1 uttrycktes i transgena Arabidopsis som redan producerade tekniska fettsyror (t.ex.
epoxyfettsyror). Det är möjligt att det krävs betydligt högre halter av de tekniska
fettsyror än de förhållandevis låga halter som föreligger i våra transgena Arabidopsis
linjer för att en inverkan från PDAT 1 skall gå att uppmäta.
Vi har också tittat på effekten av att stänga av PDAT 1 i Arabidopsis med hjälp av TDNA mutationsteknik. Effekten av ett icke-funktionellt PDAT 1 gav ingen effekt på
vare sig oljehalt eller sammansättningen fettsyror. Detta indikerar att antingen har
PDAT 1 ingen direkt roll vid normala växtförhållanden (men skulle kunna ha en roll
vid olika typer av stress) eller så finns det andra enzym i Arabidopsis som
kompenserar för ett icke-funktionellt PDAT 1. Samtidigt visar våra resultat från en
studie (publikation 3) att enzymet kan inverka på tillväxthastigheten av en växt. I
försök där normala Arabidopsis linjer odlades sida vid sida av Arabidopsis linjer med
överaktivt PDAT1, visade resultaten att linjer med överaktivt PDAT 1 växte fortare
och med en större biomassaproduktion. Vi har ännu inga förklaringar till denna
observation annat än hypotesen om att enzymet kan hålla cellmembran mer
funktionsdugliga genom att rensa bort ovanliga fettsyror (t.ex. oxiderade) och därför
skulle membranen kunna fungera bättre med ökad tillväxthastighet som resultat.
Vi har även isolerat och studerat motsvarande PDAT enzym från en vild växt med
produktion av tekniska fettsyror. Crepis palaestina lagrar upp ungefär 60 % av
epoxyfettsyran vernolsyra i sina frön. PDAT 1 och dess nära homolog At5g44830
3
klonades från Crepis p. och uttrycktes i Arabidopsis enskilt eller tillsammans med
epoxygenaset (också från Crepis p.). Det var endast i Arabidopsis linjer med både
Crepis PDAT 1 och epoxygenaset var uttryckta där resultaten indikerade en liten
förändring i halten av epoxyfettsyran. Med ledning av dessa försök går det inte att
säga säkert, men det är möjligt att det krävs betydlig högre halter av epoxyfettsyror
än de 6 % som dessa transgena växter innehöll, för att inverkan av PDAT 1 skall klart
kunna fastslås.
Lösligt PDAT
Arbetet med PDAT enzymet har också utvecklats i ytterligare en riktning. Det
intressanta med PDAT är att det har visat sig kunna överföra fettsyror från
fosfolipider till diacylglyceroler och på så sätt bilda triacylglycerol (olja). Vidare att
vissa arter som i sina frön lagrar upp ovanliga fettsyror i oljan uppvisar hög PDAT
aktivitet med en specificitet för de ovanliga fettsyrorna. Detta faktum gör att PDAT
kan vara ett av nyckelenzymerna för att få höga halter av ovanliga fettsyror i
transgena växter. En tanke väcktes om möjligheten att utnyttja detta enzym och flytta
fettsyror från fosfolipider och till andra molekyler/ämnen än bara diacylglyceroler.
Vi har klonat PDAT genen från både jäst och växter (Publikation 1). Enzymet är
membranbundet vilket begränsar dess aktivitet till just membran. Därför prövade vi
att göra det ”lösligt” och möjliggöra att det kan blandas tillsammans med råmaterial i
en lösning och vara aktivt i denna. Vi gjorde därför en genkonstruktion av PDAT där
den membranbindande delen togs bort och uttryckte den modifierade genen i jästen
Pichia med en sekretionsfaktor kopplad till enzymet. Den transformerade jästen
producerade ett lösligt och mycket aktivt PDAT vilket utsöndrades i mediet. Vi har nu
studerat enzymet utan andra substrat än tillsatta och utan interfererande
enzymreaktioner. Tänkbara applikationer är inom livsmedelsindustrin där ett lösligt
PDAT skulle kunna användas för att modifiera halvfabrikat vid brödtillverkning eller
vid livsmedelsproduktion där fett/vatten blandningar ingår. Man kan också spekulera i
framtida applikationer där ett lösligt PDAT kanske kan användas till att impregnera
fibrer med fettsyror, modifiera vanliga växtoljor till högkvalitativa tekniska oljor för
industriell användning osv. Ett manuskript över dessa arbeten är under bearbetning
och förväntas kunna insändas till publikation inom någon månad.
LPA 1
I det fylogenetiska diagrammet (Figur 3) bildar två av PDAT homologerna (Atg03310
och Atg19860) en egen grupp. I samarbete med en fransk forskargrupp (se nedan)
har vi kunnat isolera och karakterisera en av homologerna, Atg03310. Enzymet
studerades genom att Atg03310 genen från Arabidopsis uttrycktes i jäst. Studierna
kunde fastslå att enzymet funktionellt är ett fosfolipas 1 (PLA 1) dvs ett enzym som
frisläpper en fettsyra från första positionen av en fosfofolipid (Fig 4 och Publikation
6). Resultaten visade att enzymaktiviteten ökade ackumuleringen av olja i jästcellen
genom att frisläppa fettsyror som sedan används av DGAT enzymet för produktion av
olja (TAG). Upptäckten är intressant eftersom det visar på en väg att öka halten av
ackumulerad olja dvs. genom att öka mängden tillgängligt fettsyramaterial för de
oljeproducerande enzymen. Medan PLA 1 enzymet är aktivt i många olika vävnader
har vi och andra kunnat visa att aktiviteten av den närmaste homologen i Arabidopsis
Atg019860, är begränsad till fröet. Det är möjligt att detta enzym därför skulle kunna
ha ännu större inverkan på ackumuleringen av fröolja än det nu karakteriserade PLA
1. Vår hypotes, som grundar sig på den stora likheten mellan gensekvenserna av
PLA 1 och Atg019860, är att den sistnämnda är ett fröspecifikt växt PLA. Det kan
4
Membranfett
noteras att av de olika PDAT
TAG (olja)
homologerna så är det just det
Vanlig fettsyra
fröspecifika PLA som visat sig vara
Fettsyra
högst uttryckt i vilda växter med
modifierande
enzyme
höga halter av tekniska fettsyror.
Det är därför tänkbart att detta
DAG
fröspecifika PLA enzym har en
OH
CoA
viktig roll att frisläppa tekniska
PLA 1
fettsyror från membranlipider och
CoA
OH
göra dessa tillgängliga för de
Fri
fettsyra
oljeproducerande enzymen. Vi har
CoA
klonat det fröspecifika PLA och
Figur 4. Skiss av PLA 1 enzymets funktion. PLA 1 frisläpper
uttryckt det i Arabidopsis samt
den yttersta fettsyran på en membranlipid (fosfolipid). Efter
aktivering till en fettsyra-CoA kan den användas av DGAT1
analyserat de transgena linjerna.
enzymet för tillverkning av TAG.
Resultaten hitintills tyder på att det
uttryckta fröspecifika PLA bryts ner
i Arabidopsis. Det är ett känt fenomen att en gen som uttrycks för mycket i växten
kan sätta igång en nedbrytning av densamma. Om det är detta som händer med PLA
eller något annat vet vi inte än utan det får fortsatt forskning utvisa liksom att
fastställa vilken biologiska betydelsen PLA har i växten.
PSAT
Tack vare ett sammanträffande på
Membranfett
en konferens med kollegor från en
Vanlig fettsyra
fransk forskargrupp vid CNRS i
Strasbourg,
Frankrike
kunde
Fettsyra
modifierande
Sterol
identifieringen av PSAT rullas upp.
enzyme
De franska kollegorna är experter
på steroler och hade i sin forskning,
som är inriktad på att kartlägga
PSAT
produktionen av växtsteroler, börjat
CoA
titta på PDAT homologerna. Efter
OH
Sterol ester
den första kontakten utvecklades
samarbetet väl och resulterade i
Figur 5. Skiss av PSAT enzymets funktion. PSAT flyttar
kloningen och karakteriseringen av
den mellersta fettsyran på en membranlipid (fosfolipid) till
det första sterolester producerade
en fri sterol belägen i membranet. Sterol estrar som
växtenzymet någonsin (Publikation
därigenom bildas ansamlas i droppar utanför membranet.
4). PSAT (Phospholipid:Sterol Acyl
Transferas) är aktivt i hela växten och fungerar genom att flytta fettsyror från
membranlipider till steroler under bildning av sterolestrar (Figur 5). Det finns många
olika steroler i växten och en av deras funktioner är att fungera som strukturelement i
cellmembran där deras rigida molekylstruktur utgör ett stabiliserande inslag bland
membrankomponenterna. Att PSAT har högre specificitet till mellanprodukter i
sterolbiosyntesen än till slutprodukten sterol, pekar på att vi har hittat enzymet som
kontrollerar halten av steroler i membranet! Det kan i sammanhanget påpekas att
LCAT enzym inom humana system (likhet med PSAT, se figur 3) har stor betydelse
för regleringen av kolesterolhalten i blodet. Vi postulerar att PSAT har en roll att
reglera halten av fria steroler i cellmembranet genom att öka eller minska
produktionen av sterolestrar som ansamlas utanför membranet. Denna reglering har
5
betydelse för att garantera att membranet alltid har en rätt sammansättning av olika
steroler och därigenom en rätt fluiditet för att växten skall ha förmåga att tåla olika
typer av klimatstress som kyla och torka.
Betydelsen av ett väl fungerande PSAT kan tydligt ses i figur 6. Figuren visar
resultatet av en köldbehandling av Arabidopsis där vi har stängt av PSAT enzymet
genom att slå ut genen för PSAT och som odlats med normala Arabidopsis. I
växterna med icke-funktionellt PSAT blir växten köldkänslig i så måtto att bladen
tynar bort och dör vid temperaturer av 8°C
eller lägre. Det är möjligt att PSAT skulle
kunna användas för att förbättra tåligheten
mot kyla hos vissa grödor.
Sterolestrar har också förts fram såsom
nutritionellt intressanta näringsämnen. I och
med vår upptäckt av det första sterolester
producerande enzymet (PSAT) skulle det
vara möjligt att påbörja arbete med att Figur 6. Effekt av ett par månaders tillväxt vid
utveckla
nya
oljegrödor
såväl
som låg temperatur. Till vänster - Arabidopsis med
cerealiegrödor med förhöjt sterolester icke funktionell PSAT. Till höger – Arabidopsis
med fungerande PSAT.
innehåll.
Produktion av tekniska fettsyror
Inom forskningsprogrammet har vi fortsatt att studera bildningen av olika tekniska
fettsyror för att försöka förstå orsaken bakom de låga halterna av dessa fettsyror i
transgena växter. Nedan berörs tre av fettsyra typerna
Acetylen och epoxyfettsyror
Hydroxy
Oljesyra
Dessa fettsyror bildas genom
fettsyra
Hydroxylas
OH
aktivitet
av
enzymen
O
O
acetylenas och epoxygenas
PC
Acetylen
PC
(Fig. 7). Enzymen använder
Acetylenas
fettsyra
D12-desaturas
O
linolfettsyra som substrat och
PC
O
byter ut en dubbelbindning mot
O
O
Epoxygenas
PC
en acetylenbindning (trippel
Epoxy
PC
fettsyra
bindning) eller sätter in en
Linolsyra
Konjugas
syreinnehållande epoxygrupp. I
Konjugerad
transgen
Arabidopsis
där
fettsyra
O
acetylenas eller epoxygenas
PC
enzymet är uttryckt så ser vi
som tidigare nämnts endast Figur 7. Översikt av produktionsvägar för olika tekniska fettsyror i
en växt. Enzymen, hydroxylas, acetylenas, epoxygenas och
låga halter av de tekniska konjugas, är alla så kallade Δ12 desaturas liknande enzym pga
fettsyrorna. Samtidigt ser vi den stora likhet de har med Δ12 desaturas (enzymet som tillverkar
dessutom en kraftig nedgång i linolsyra). Substraten som enzymen använder är oljesyra för
hydroxylas och linolsyra för de tre sistnämnda. Linolsyra bildas
halterna av substratet för dessa genom att delta Δdesaturas sätter in en andra dubbelbindning på
två enzym dvs. linolfettsyran. Vi oljesyra. Alla enzym modifierar fettsyran när den sitter på en
har undersökt om den låga fosfolipid (PC).
substrat nivån i de transgena växterna kan vara en orsak till låga halter av tekniska
fettsyror. Arabidopsis linjer som uttryckte acetylenas enzymet eller epoxygenas
enzymet och producerade låga halter av acetylen eller epoxyfettsyror jämfördes med
andra linjer där acetylenas eller epoxygenas uttrycktes tillsammans med Δ12
6
desaturas dvs. enzymet som producerar substratet linolfettsyra. Resultaten visade att
halten av linolfettsyra ökade 2-4 gånger och halten epoxyfettsyror ökade med
ungefär 30%. Detta visar vikten av hög substrat tillgång för ackumulering av
epoxyfettsyror, men vi vet fortfarande inte varför substrattillgången går ner i
transgena växter som uttrycker epoxygenas.
I linjer som uttryckte acetylenas och acetylenas tillsammans med Δ12 desaturase,
såg vi till vår förvåning att fastän tillgången på substrat för acetylenas enzymet ökade
kraftigt (2-4 gånger) så minskade halten av acetylen fettsyror kraftigt med ung 50 %.
Idag har vi ingen förklaring till detta resultat.
Vi har noterat att acetylenas enzymet inte bara producerar acetylen fettsyror i de
transgena växterna utan också små mängder av en speciell linolfettsyra (en trans
linolfettsyra). Efter att grundligt ha undersökt enzymet i både växt och jäst system
kunde vi visa att acetylenas enzymet kan fungera både som ett desaturas och som
ett acetylenas (Publikation 5). När substratet är oljesyra fungerar acetylenaset som
ett desaturas och bildar två olika typer av linolfettsyra genom att sätta in en andra
dubbelbindning i oljesyran. När vanlig så kallad cis linolfettsyra bildas kan
acetylenaset använda detta och bilda en acetylen fettsyra. Men de flesta gångerna
(tre gånger av fyra) bildas en så kallad trans linolfettsyra och denna kan inte utnyttjas
av enzymet för att producera acetylen fettsyror. Det vill säga att acetylenas enzymet
bildar en massa fettsyror som fungerar som ett slags återvändsgränd, dvs. de kan
inte utnyttjas vidare som substrat för enzymet. Denna upptäckt har visat oss att
enzymen som tillverkar tekniska fettsyror har komplexa mekanismer som är viktiga
att förstå för att vi skall kunna optimera en produktion av tekniska fettsyror i nya
oljegrödor.
Konjugerade fettsyror
Konjugerade fettsyror är mycket reaktiva och polymeriserar snabbt i luft och är därför
utomordentligt lämpade som ingredienser i lacker och färger. Idag finns kommersiellt
bara de konjugerade fettsyrorna från tungträdsoljan att tillgå och dess användning är
starkt begränsad beroende på dess höga pris. Gener för produktion av konjugerade
fettsyror har klonats och dessa har uttryckts i transgena växter. Detta har endast
resulterat i låga mängder av dessa fettsyror dvs. samma problem som med många
andra tekniska fettsyror. De konjugerade fettsyrorna förs inte vidare från
membranerna till oljan i de transgena växterna och därmed begränsas mängderna av
dessa fettsyror som kan erhållas samt att cellfunktionerna störs i de transgena
växterna. För att undersöka vilka mekanismer som ligger bakom bortförandet av
konjugerade fettsyror från membraner i frön som naturligt
ackumulerar dessa tekniska fettsyror har vi utvecklat
metoder att studera in-vitro syntesen och metabolismen
av dessa fettsyror i membranfraktioner av frön från
Momordica charantia, bittergurka (se figur 8). Då de
konjugerade fettsyrorna är utomordentligt reaktiva och
analysen av dessa är problematisk har vi först utvecklat
pålitliga analysmetoder för dessa fettsyror. Preliminära
försök med membranfraktioner från Momordica visar att
dessa har god in-vitro aktivitet och stabilitet av det enzym
som bildar konjugerade fettsyror. Detta öppnar för vidare Figur 8. Bittergurka (Momordica
experiment för att fastställa vilka enzymsystem som är charantia) Till höger visas en
involverade i den vidare metabolismen av de mogen gurka och till vänster ett
övermoget exemplar med de
nysyntetiserade konjugerade fettsyrorna.
röda fröerna väl synliga.
7
Bildning av wax estrar
Det är allmänt vedertaget att det behövs så kallade aktiverade fettsyror (dvs. fettsyror
bundna som en thioester till antingen acyl-CoA eller ACP molekyl) för att acylera dem
till en hydroxygrupp på en molekyl. Under arbetet med att studera bildningen av
sterol estrar genom PSAT observerade vi att förutom sterolestrar bildades ytterligare
en opolär molekyl i systemet när vi tillsatte fria fettsyror. Efter noggranna studier
kunde vi karakterisera molekylen till en waxester (molekyl som består av en fettsyra
bunden till en fettalkohol) och resultaten publicerades nyligen (Publikation 2). Denna
waxester bildades utan att aktiverade fettsyror tillsattes och fettsyrorna acylerades
helst till långa fettalkoholer och aktiviteten var med säkerhet orsakad av ett enzym.
En hel del arbete återstår ännu bl.a. med att identifiera och klona den gen/gener som
ligger bakom enzymaktiviteten. Man kan spekulera att ett isolerat enzym i ett
optimerat system skulle kunna användas i bioreaktorer för producera special
designade waxestrar för användning inom kosmetika eller läkemedelsindustrin eller
för tillverkninga av specialsmörjmedel.
Publicerade arbeten från projektet (lämnas som bilaga).
1. Ulf S., Carlsson A.S., Lenman M., Dahlqvist A., Huang H., Banaś W., Banaś A.
and Stymne S. (2004) Cloning and Functional Characterisation of a
Phospholipid:Diacylglycerol Acyltransferase from Arabidopsis. Plant Phys.
135: 1324-1335.
2. Neal A, Banaś A, Banaś W, Ståhl U, Carlsson AS and Stymne S (2006)
Microsomal preparations from plant and yeast acylate free fatty acids without
prior activation to acyl-thioesters. BBA- Molecular and Cell Biology of Lipids.
Accepted (2006-02-27)
3. Banaś, W., Carlsson, A. S., Banaś, A. and Stymne, S. (2005) Effect of
overexpression of the PDAT gene on Arabidopsis growth rate. Acta
Physiologiae Plantarum 27(4):33.
4. Banaś, A., Carlsson, A. S., Huang, B., Lenman, M., Banaś, W., Lee, M., Noiriel,
A., Benveniste, P., Schaller, H., Bouvier-Navé, P., and Stymne, S. (2005)
Cellular sterol ester synthesis in plants is performed by an enzyme
(phospholipid:Sterol acyltransferase) different from the yeast and mammalian
ACATs. J. Biol. Chem 280(41): 34626 –34634.
5. Carlsson A.S., Thomaeus S., Hamberg M. and S. Stymne (2004) Properties of
two multifunctional plant fatty acid acetylenase/desaturase enzymes. Eur. J.
Biochem. 271: 2991-2997.
6. Noiriel A., Benveniste, P., Banas A., Stymne S. and Bouvier-Nave P. (2004)
Expression in yeast of a novel phospholipase A1 cDNA from Arabidopsis
thaliana. Eur. J. Biochem. 271:3752-3764
Anders S Carlsson
8
