Immucor Transplant Diagnostics, Inc
550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 USA
Tel: +1.203.328.9500 eller 888.329.0255 (i USA och Kanada), Fax: +1.203.328.9599
WWW.IMMUCOR.COM
Produktdokumentation och översättningar finns tillgängliga på: www.Immucor.com
PRODUKTINLAGA
LIFECODES ® HLA-SSO TYPNINGSSATSER
För in vitro-diagnostik
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
Beskrivning av symbolerna ..............................
1
Bruksanvisning ....................................................
6
Satser/reagenser enligt katalognummer ...........
2
A. Rening av genomiskt DNA ..............................
6
Användningsområde .......................................
5
B. DNA-förstärkning (PCR) ..................................
6
Översikt och förklaring ....................................
5
C. Hybridisering .................................................
7
Procedurens principer .....................................
5
D. Provanalys med Luminex Instrument ................
8
Reagenser .......................................................
5
Resultat ...............................................................
8
A. Identifiering ..............................................
5
Kvalitetskontroll ...................................................
9
B. Varningar och försiktighetsåtgärder .............
5
Procedurens begränsningar .................................
9
C. Förvaringsanvisningar ...............................
5
Felsökning ...........................................................
9
D. Rening eller användningsbehandling ...........
5
Förväntade värden ...............................................
10
E. Instabilitetsindikatorer ................................
5
Specifika prestandaegenskaper ............................
10
Instrumentkrav ................................................
5
Referenser ...........................................................
10
Provtagning och förberedelse ..........................
5
Begränsade licenser .............................................
10
Procedur .........................................................
6
Tillverkarens information ......................................
10
A. Tillhandahållet material ..............................
6
Använda varumärken ...........................................
10
Bilaga A ...............................................................
11
Gelelektrofores ..................................................
11
Geltolkning ........................................................
11
B. Material som behövs, men
inte tillhandahålls .......................................
C. Ytterligare material som användaren
ska tillhandahålla .......................................
6
6
BESKRIVNING AV SYMBOLERNA (produktetiketter och bilagor)
Partinummer
Katalognummer
Temperaturbegräsningar
Övre
temperatur
gräns
Sista
förbrukningsdatum
Skyddas
mot ljus
Tillräckligt för
N-tester
Får inte frysas
Observera –
Se bruksanvisningen
Se bruksanvisningen
Tillverkare
Europeisk
representant
Sida 1 av 11
EC REP
LC775TIVDSV.4 (02/14)
KITS/REAGENSER ENLIGT KATALOGNUMMER
LCT-A LIFECODES HLA-A SSO Typningssats, katalog nr. 628911
LM-A LIFECODES HLA-A Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-A
LIFECODES HLA-A Huvudblandning
‡
Produkt nr. 628410-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
628405
870 µl
2 till 8°C
628453
810 µl
2 till 8°C
Skyddas mot ljus
BM-A
LIFECODES HLA-A Sondblandning
DS
Förtunningslösning
628515
9,9 ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
50
Räcker till 50 prover
LCT-AE LIFECODES HLA-A eRES SSO Typningssats, katalog nr. 628913
LC-AE LIFECODES HLA-A eRES Typningssats att använda med Luminex
Reagens
Produkt nr. 628459 -50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
MX-A
LIFECODES HLA-A Huvudblandning
628405
870 µl
2 till 8°C
BM-A
LIFECODES HLA-A Sondblandning ‡
628453
810 µl
2 till 8ºC
Skyddas mot ljus
BM-AeRES
LIFECODES HLA-A eRES Sondblandning ‡
628455
810 µl
2 till 8ºC
Skyddas mot ljus
DS
Förtunningslösning
628515
19,7 ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
50
Räcker till 50 prover
LCT-B LIFECODES HLA-B SSO Typningssats, katalog nr. 628915
LM-B LIFECODES HLA-B Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-B
LIFECODES HLA-B Huvudblandning
‡
Produkt nr. 628510-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
628556
870 µl
2 till 8°C
628553
810 µl
2 till 8°C
Skyddas mot ljus
BM-B
LIFECODES HLA-B Sondblandning
DS
Förtunningslösning
628155
9,9 ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
50
Räcker till 50 prover
LCT-BE LIFECODES HLA-B eRES SSO Typningssats, katalog nr. 628917
LC-BE LIFECODES HLA-B eRES Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-B
LIFECODES HLA-B Huvudblandning
Produkt nr. 628559-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
628556
870 µl
2 till 8°C
BM-B
LIFECODES HLA-B Sondblandning ‡
628553
810 µl
2 till 8ºC
Skyddas mot ljus
BM-BeRES
LIFECODES HLA-B eRES Sondblandning ‡
628554
810 µl
2 till 8ºC
Skyddas mot ljus
DS
Förtunningslösning
628515
19,7ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
50
Räcker till 50 prover
‡
Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån.
OBSERVERA: Använd inte produkterna efter utgångsdatum.
OBSERVERA: Avvikelser från det rekommenderade protokollet och material som krävs inklusive LIFECODES Taq-polymeras har inte validerats.
Sida 2 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
KITS/REAGENSER ENLIGT KATALOGNUMMER
LCT-C LIFECODES HLA-C SSO Typningssats
Katalog nr.628919
LM-C LIFECODES HLA-C Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-C
BM-C
DS
TAQ
Produkt nr. 628810-50
Förvaring
Produktnummer
LIFECODES HLA-C Huvudblandning
LIFECODES HLA-C Sondblandning
Påfyllningsvolym
628803
‡
628802
Förtunningslösning
628155
LIFECODES Taq-polymeras
870 µl
2 till 8°C
810 µl
2 till 8°C
Skyddas mot ljus
9,9 ml
628075
50
Räcker till 50 prover
18 till 30ºC
25 µl
-10ºC till -30ºC
LCT-CE LIFECODES HLA-C eRES SSO Typningssats, katalog nr. 628921
LC-CE LIFECODES HLA-C eRES Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-C
LIFECODES HLA-C Huvudblandning
‡
Produkt nr. 628850-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
628803
870 µl
2 till 8°C
628804
810 µl
2 till 8°C
Skyddas mot ljus
BM-CeRES
LIFECODES HLA-C eRES Sondblandning
DS
Förtunningslösning
628515
19,7 ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
LCT-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 SSO Typningssats
MX-DR1
LIFECODES HLA-DRB1 Huvudblandning
‡
Räcker till 50 prover
, Katalog nr.628923
LM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Typningssats att använda med Luminex
Reagens
50
Produkt nr. 628751-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
628753
870 µl
2 till 8°C
628752
810 µl
2 till 8°C
Skyddas mot ljus
BM-DR1
LIFECODES HLA-DRB1 Sondblandning
DS
Förtunningslösning
628155
9,9 ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
50
Räcker till 50 prover
‡
Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån.
OBSERVERA: Använd inte produkterna efter utgångsdatum.
OBSERVERA: Avvikelser från det rekommenderade protokollet och material som krävs inklusive LIFECODES Taq-polymeras har inte validerats. .
Sida 3 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
KITS/REAGENSER ENLIGT KATALOGNUMMER
LCT-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eRES SSO Typningssats, katalog nr. 628925
LC-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eRES Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-DR1
LIFECODES HLA-DRB1 Huvudblandning
‡
Produkt nr. 628759-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
628753
870 µl
2 till 8°C
628752
810 µl
2 till 8ºC
Skyddas mot ljus
628755
810 µl
2 till 8ºC
Skyddas mot ljus
BM-DR1
LIFECODES HLA-DRB1 Sondblandning
BM-DR1eRES
LIFECODES HLA-DRB1 eRES Sondblandning
DS
Förtunningslösning
628515
19.7ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
‡
50
Räcker till 50 prover
LCT-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 SSO Typningssats, katalog nr. 628927
LC-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-DRB3,4,5
LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Huvudblandning
‡
Produkt nr. 629200-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
629201
870 µl
2 till 8°C
629202
810 µl
2 till 8ºC
Skyddas mot ljus
BM-DRB3,4,5
LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Sondblandning
DS
Förtunningslösning
628515
19,7 ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
50
Räcker till 50 prover
LCT-DQB LIFECODES HLA-DQB1 SSO Typningssats, katalog nr. 628929
LM-DQB LIFECODES HLA-DQB Typningssats att använda med Luminex
Reagens
MX-DQB
LIFECODES HLA-DQB Huvudblandning
‡
Produkt nr. 628610-50
Produktnummer
Påfyllningsvolym
Förvaring
628305
870 µl
2 till 8°C
628304
810 µl
2 till 8°C
Skyddas mot ljus
BM-DQB
LIFECODES HLA-DQB Sondblandning
DS
Förtunningslösning
628155
9,9 ml
18 till 30ºC
TAQ
LIFECODES Taq-polymeras
628075
25 µl
-10ºC till -30ºC
50
Räcker till 50 prover
‡
Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån.
OBSERVERA: Använd inte produkterna efter utgångsdatum.
OBSERVERA: Avvikelser från det rekommenderade protokollet och material som krävs inklusive LIFECODES Taq-polymeras har inte validerats. .
Sida 4 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
ANVÄNDNINGSOMRÅDE
DNA-typning av HLA-alleler klass I och klass II.
ÖVERSIKT OCH FÖRKLARING
DNA-baserad HLA-typning med PCR-förstärkt DNA är en vanlig laboratorieprocedur. PCR-förstärkning av DNA används i syfte att anrika en viss DNA-region.
Vid HLA-typning används en efterföljande analys som ska fastställa egenskaperna hos förstärkt DNA. Flera analystyper, som t ex. SSP (1), direkt SSOP (2),
RFLP (3) och omvänd SSOP punktblottningsteknik (4) har använts vid HLA-typning. LIFECODES HLA-SSO typningssats använder, precis som SSOP och
omvänd punktblottningsteknik, sekvensspecifika oligonukleotider (SSO) för att identifiera de HLA-alleler som förekommer i ett PCR-förstärkt prov. Det är SSOsatsen och inte metoderna som avgör förmågan att urskilja olika alleler i ett PCR-förstärkt prov. Medan omvänd punktblottningsteknik och SSOP används
enzymetiketter och kolorimetriska substrat som kräver vidareutveckling, är LIFECODES-analysen är ett homogent multiplexsystem. Det innebär att SSOanalyserna sker samtidigt och hela analysen utförs i ett och samma reagensrör med tillsats av en enskild reagens.
PROCEDURENS PRINCIPER
Själva LIFECODES HLA-SSO-typningen är baserad på hybridisering av etiketterade enkelsträngade PCR-produkter till SSO-sonder. Vid PCR-förstärkning av
DNA används vanligtvis ekvimolara mängder av både framåt- och bakåtprimerer för att skapa en dubbelsträngad DNA-produkt. Men om mängden av en primer
överskrider de övriga, kan reaktionen generera några enkelsträngade DNA-produkter utöver de dubbelsträngade. Under LIFECODES-förstärkningens initiala
cykler genereras dubbelsträngat DNA. När den begränsande primeren är slut använder återstående primerer den dubbelsträngade produkten som mall för att
skapa enkelsträngat DNA. Den här metoden ger alltså både dubbel- och enkelsträngade produkter, som båda vid denaturering deltar i hybridiseringsreaktionen.
Var och en av de olika sonderna är ev. homolog till en sekvens inom förstärkt DNA som är unik för en allel eller en grupp av alleler. Dessa sonder är alltså
utformade så att var och en av dem prioriterar hybridiseringen av en kompletterande region, som ev. förekommer i den förstärkta DNA-produkten. Förstärkt DNA
hybridiseras även mot en eller flera konsensussonder som ska är homologa till sekvenserna i samtliga alleler i ett lokus. SSO-typningen kan påverkas av typen
av biologiskt material, reningsmetod, den genomiska DNA-produktens mängd och integritet. Den signal som erhålls för konsensussonden/-sonderna kan
således fungera som en indikator för en framgångsrik förstärknings- och hybridiseringsprocess. Den signal som konsensussonden ger kan även användas för att
normalisera signalen från allelspecifika sonder, och korrigera för ev. varierande mängder av den kopierade produkten i hybridiseringsreaktionen. Analysen av
resultaten från SSO-typningen kan användas för att fastställa närvaro eller frånvaro av särskilda DNA-sekvenser i förstärkt DNA, samt identifiera möjliga alleler i
provet.
Vid LIFECODES HLA-SSO-typningen fästs sonder vid Luminex Microspheres som är avsedda för Luminex Instrument. Upp till 100 olika populationer av
Luminex Microspheres kan blandas och analyseras av Luminex Instrument, eftersom varje population av mikrosfärer kan urskiljas med hjälp av unika
fluorescerande signaturer eller färger. Olika SSO-sonder kan kopplas till varje färgmikrosfär. På så sätt kan en kombination av olika sonder särskiljas från
varandra genom att de kan associeras med en viss färgmikrosfär. Luminex Instrument kan även kvantifiera de relativa mängderna etiketterade PCR-produkter
som hybridiseras i varje Luminex Microsphere. Den relativa signalen som erhålls med SSO-sonderna vid LIFECODES-analysen kan därför, precis som med
andra SSOP-metoder, användas för att fastställa sondernas positiva eller negativa reaktivitet med det förstärkta DNA-provet (se avsnittet Resultat). Härmed
erhålls den information som krävs för att fastställa provets HLA-fenotyp.
REAGENSER
A. Identifiering
I tabellerna i avsnittet Satser/Reagenser efter katalognummer hittar du kompletta listor över produkter och katalognummer.
B. Varningar och försiktighetsåtgärder
1.
2.
3.
4.
5.
För in vitro-diagnostik.
Använd separata pipetter till för- och efterhantering av PCR.
Bioriskvarning: Alla biologiska prover och blodprover ska behandlas som potentiellt smittsamma. Följ allmänna säkerhetsåtgärder vid hantering.
Förtunningslösning, sondblandningar, Taq-polymeras och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin innehåller farliga föreningar. Låt inte dessa
komma i kontakt med hud och ögon. Bortskaffa materialen efter användning i enlighet med lokala föreskrifter. Se
materialsäkerhetsdatabladen för ytterligare info.
Resultatet från dessa satser används inte som enda grund, på vilken man fattar ett kliniskt beslut som påverkar patienten.
C. Förvaringsanvisningar
1.
2.
3.
Information om korrekta lagringstemperaturer hittar du på förpackningens etikett.
Sondblandningar och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin är ljuskänsliga. FÖRVARAS MÖRKT, FÅR EJ FRYSAS.
Använd inte produkterna efter deras utgångsdatum.
D. Rening eller användningsbehandling
Se “Provtagning och förberedelse.”
E. Instabilitetsindikatorer
1.
2.
Om salter har fällts ut ur lösningen under transport eller förvaring, måste dessa återlösas före användning. Vortexa i rumstemperatur
(18°C till 30°C).
Använd inte R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin som har frysts under transport eller förvaring.
INSTRUMENTKRAV
1.
2.
Luminex Instrument och XY Platform (produktnummer 888300, 888310)
Följande termocykler har validerats: 96-Well Gene Amp® PCR system 9700 inställd i 9600-läget (baskategori nr. N8050200, Gold Block kat. nr. 4314878),
Veriti™ 96-Well termocykler inställd på 9700 MAX-läget (kategori nr. 4375786). Eppendorf Mastercycler® Nexus inställd i SAFE-läget (kat.
nr. 6333000.014). Se Tabell 2 för maximal ramphastghet. Observera: andra termocykler och ramphastigheter har inte validerats.
PROVTAGNING OCH FÖRBEREDELSE
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
Mänskligt DNA kan renas från helblodprover, lättcellsskikt eller bukala svabbprover med hjälp av en validerad process som uppfyller kriterierna
nedan.
DNA extraherad från blod bevarat i EDTA och ACD (Acid Citrate Dextrose) har testats och har visat förväntade resultat i denna analys. DNA
extraherat från blod bevarat i heparin kan inte användas i denna analys. Andra konserveringsmedel har inte testats.
Isolerat DNA ska ligga i 10 mM TRIS, pH 8,0-9,0 eller i nukleasfritt vatten. Vid förekomst av ett kelatbildande medel som t ex. EDTA, får inte den
slutgiltiga koncentrationen av det kelatbildande medlet överskrida 0,5 mM.
Förekomst av alkohol, rengöringsmedel eller salter kan påverka DNA-förstärkningen negativt.
Den slutliga DNA-koncentrationen bör vara 10 – 200 ng/µL.
Mätningen av absorberingen i DNA-proverna vid 260 och 280 nm bör ge en proportion på 1,65 till 2,0.
DNA-produkten kan användas omedelbart efter isoleringen, eller lagras vid -20 °C i upp till ett år. Upprepad infrysning/upptining bör undvikas
eftersom det kan försämra DNA-kvaliteten.
Sida 5 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
PROCEDUR
Observera: Avvikelser från det rekommenderade protokollet och materialet som behövs har inte validerats.
A. Tillhandahållet material (Se tabellerna i avsnittet Satser/Reagenser efter katalognummer finns mer information)
•
•
•
•
•
Lämplig huvudblandning (MX)
Lämplig sondblandning (BM)
Förtunningslösning (DS)
Tröskeltabell, träffmönstertabell(er)
LIFECODES Taq-polymeras* (LIFECODES kategori nr. 628075)
B. Material som behövs men inte tillhandahålls
Följande material har validerats för användning med satsen:
•
•
•
•
Luminex Sheath Fluid (1x Lifecodes kategori nr. 628005)
Nukleasfritt vatten (Lifecodes kategori nr. 757003; 20 ml)
•
PCR-rör och hattar - Corning Thermowell Tube Strips
(Costar® kategori nr. 6542, LIFECODES kategori nr.
®
888640) eller Corning Thermowell PCR 96 brunnar
®
(kategori nr. CLS6551) eller Themoscientific AB Gene
Superplate 96-brunn PCR-platta (kategori nr. AB-2100)
Costar®-platta (Costar® kategori nr. 6509, LIFECODES
kategori nr. 888630)
•
®
•
Thermowell genomskinlig polyetylentejp (Costar® No. 6524
(LIFECODES kategori nr. 888635 )
R-fykoerytrin konjugerad streptavidin (SA-PE), 1 mg/ml
(LIFECODES kategori nr. 628511)
Luminex kalibreringssatser (Luminex 100/200
kalibreringssats, Luminex 100/200 prestandakontroll,
LIFECODES kategori nr. 628018 respektive 628019)
•
C. Ytterligare material som användaren ska tillhandahålla
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Vortexmixer
Kompressionsmatta av silikon Axygen Scientific nr. CM-FLAT eller motsvarande
Badsonikator
Mikrocentrifug med spärrfiltermunstycken
Pipettorer, flerkanaliga pipettorer och munstycken (1-20 µl, 20-200 µl, 1 000 µl)
Kalkylprogramvara för analys
Värmeblock
70 % isopropanol eller 20 % blekmedel
Hållarbricka – Applied Biosystems nr. 403081 (att använda endast med 9700 termocykler)
BRUKSANVISNING
ANMÄRKNINGAR:
•
Sondblandningar och SA-PE är ljuskänsliga: förvaras mörkt och får ej frysas.
•
Värm kulorna till 55 - 60 °C i minst 5-10 minuter så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen.
•
Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt solubiliserade.
•
Var mycket försiktig vid alikvoteringen, använd kalibrerade pipetter. Annars får du ev. ingen reagens och provet misslyckas.
•
Alla temperaturangivelser måste iakttas noggrant. Så små fluktuationer som +/- 0,5°C kan påverka resultatet.
•
I hybridiseringsfasen får proverna inte förbli i utspätt tillstånd vid 56°C i mer än fem minuter (se avsnittet Resultat).
•
Vi rekommenderar att de kopierade proverna analyseras så snart som möjligt. Om proverna inte kan köras i Luminex samma dag,
kan den kopierade produkten lagras i upp till tre dagar vid 2-8 °C innan den används. Vid en längre förvaring
rekommenderas -20ºC under upp till en vecka fram till tidpunkten för analysen. Den kopierade produkten kan bara frysas
och tinas en gång. Upprepad infrysning och upptining gör att de kopierade proverna bryts ned, vilket ger sämre resultat vid
analysen.
A. Rening av genomiskt DNA, med valfri metod. Slutgiltig koncentration ska ligga på 10 – 200 ng/µL. Justera vid behov med
sterilt vatten. Se till att alla prover håller samma koncentration.
B. DNA-förstärkning (PCR)
1. Värm huvudblandningen till rumstemperatur (18 till 30°C).
2. Vortexa försiktigt reagenserna I cirka 10 sekunder. På så sätt garanteras salthalterna i lösningen. Snurra försiktigt (5-10 sekunder) i
mikrocentrifug så att innehållet hamnar på botten av röret.
3. Använd Tabell 1 nedan när du förbereder komponenterna för förstärkning av n+1 reaktioner. Använd mängdanvisningarna för
respektive komponent per reaktion (utom för DNA). Den slutgiltiga volymen ska vara 50µL per reaktion med sterilt vatten. Vortexa
försiktigt.
4. Pipettera lämplig mängd genomiskt DNA (100 till 300 ng) i PCR-rören.’
5. Alikvotera huvudblandningen i PCR-rören med genomiskt DNA. (Den sammanlagda volymen av huvudblandningen och genomiskt DNA
ska vara 50µL för respektive reaktion.) ’
6. Förslut rören väl för att undvika avdunstning vid PCR.
7. Placera proverna i termocyklern och kör programmet, se Tabell 2 och Tabell 3.
Sida 6 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
Tabell 1. Reagenskomponenter vid förstärkning
Mängd per PCR provreaktion
Komponent
LIFECODES Huvudblandning
15 µl
Genomiskt DNA10-200ng/µl
Totalt av ~200ng
LIFECODES Taq-polymeras
0,5 µl (2,5 U)
Nukleasfritt vatten
Till 50 µl slutvolymen
Tabell 2. Termocyklernas villkor för förstärkning
Termocykler
Gen Amp® PCR System 9700
Veriti™ 96-Well termocykler
Eppendorf Mastercycler® Nexus
Läge (ramphastighet)
9 600 läge
(3,5°C/sec)
9 700 MAX läge
(3,9°C/sek.)
SAFE läge, MAX ramp
(3,0°C/sek.)
Tabell 3. Termocyklernas villkor för förstärkning
Steg
Temperatur och inkubationstid
Antal cykler
1
95º C i 5 min
1
95º C i 30 sek.
2
60º C i 45 sek.
8
72º C i 45 sek.
95º C i 30 sek.
3
63º C i 45 sek.
32
72º C i 45 sek.
4
72º C i 15 min.
1
5
Konstant 4º C
1
Observera: för att vara säker på provförstärkningen, se produktens gelelektrofores (Bilaga A).
C. Hybridisering
•
•
1.
2.
3.
4.
5.
Kontrollera att hybridiseringens buffertkomponenter i LIFECODES sondblandning solubiliseras och att kulorna är helt
suspenderade.
Starta Luminex och XY-plattformen och låt värma upp i 30 minuter.
Värm sondblandningen i 55 - 60 °C i minst 5-10 minuter, så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen.
Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt uppslammade.
Kombinera 15 µl av den lämpliga sondblandningen med 5 µl av platsspecifik PCR-produkt i varje brunn av en termocykler 95
brunnplatta (Costar® nr. 6509). Observera: Satserna A eRES, B eRES och DRB1 eRES kräver två brunnar per prov, en för
eRES-sondblandningen och en för standardsondblandningen. eRES-sondblandningen och standardsondblandningen
behöver inte utföras på samma gång. Båda sondblandningarna krävs för att uppnå eRES-resultat för dessa satser. eRESsatser innehåller endast en standardsondblandning. När du alikvoterar sondblandningen till mer än 10 brunnar, ska du försiktigt
vortexa sondblandningen efter varje uppsättning av tio. Täta plattan med polyetylentejp (Costar® nr. 6524).
Placera kompressionsmattan av silikon ovanpå plattan före hybridiseringen.
Hybridisera proverna enligt följande inkubationsförhållanden:
Tabell 4. Termocyklerns
villkor för hybridisering
6.
97ºC för 5 minuter
47ºC för 30 minuter
56ºC för 10 minuter
56ºC HOLD
Medan proverna hybridiseras, förbered en 1:200 förtunningslösning/SA-PE-blandning. Kombinera 170 µL förtunningslösning (DS) och
0,85 µL 1 mg/ml SA-PE per prov. Här rekommenderas att förtunning för n+1 prover tillverkas, i händelse av pipetteringsförlust. (Se
Tabell 5).
Sida 7 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
7.
Förvara förtunningen/ SA-PE-blandningen i mörker, i rumstemperatur; SA-PE är ljuskänsligt! Förtunningslösningen kan värmas i
45 °C i 5 minuter och vortexas vid ankomst, så att alla komponenter ligger kvar i lösningen. Förtunningen ska hålla rumstemperatur
(18-30 °C) innan du blandar. Förbered omedelbart före användning och avyttra ev. rester.
Antal prover
Tabell 5. Förberedelse av
förtunningslösning
1
5
10
20
50
Förtunningslösning
(DS)
170 µl
850 µl
1 700 µl
3 400 µl
8 500 µl
SA-PE
0.85 µl
4,25 µl
8,5 µl
17 µl
42,5 µl
Anmärkning: STÄNG INTE AV HYBRIDISERINGSPROGRAMMET INNAN BRICKAN HAR AVLÄGSNATS FRÅN TERMOCYKLERN!
8. Vid väntan i 56 °C, medan brickan befinner sig i termocyklern, späd proverna med 170 µL förtunning/ SA-PE-blandning. Det är viktigt
att alla prov späds ut inom 5 minuter (efter 10 minuters väntan (HOLD) i 56°C).
9. Ta ut provbrickan från termocyklern och placera i Luminex Instrument.
D. Provanalys med Luminex Instrument*
Bäst resultat får du om du analyserar proverna i Luminex Instrument omedelbart. Proverna kan läsas upp till 30 minuter efter utspädning.
Om du inte ska läsa proverna omedelbart, förvara dem i mörker.
1. Starta Luminex Instrument mellan 30 minuter och 4 timmar innan proverna ska analyseras.
2. Innan proverna analyseras i Luminex Instrument, ställ in den körning som ska användas vid analysen.
a) Välj Create a New Batch (Skapa ny batch) i File-menyn (Arkivmenyn).
•
Om du t ex. analyserar HLA-DRB1, lägg till Batch för HLA-DRB1.
•
En Batchmall öppnas och döps, i det här fallet, till HLA-DRB1.
•
Tänk på att mallversionerna är partispecifika och motsvarar partinumren på paketen.
•
Följ de stegvisa anvisningarna på skärmen när du skapar batchar.
•
När du namnger en batch, lägg inte in kommatecken i namnet eftersom all information efter ett komma går
förlorad vid exportering av data.
b) Mer information om hur du skapar batchar och multibatchar finns i bruksanvisningen till Luminex.
c) Klicka på utmatningsikonen för att mata ut platthållaren. Placera termocyklerns platta med proverna i platthållarens
XYP-värmeblock.
d) Klicka på ikonen för inmatning av plattan. Nu är proverna klara att analyseras. En inledande fas utförs innan själva
körningen startas.
e) När proverna har körts igenom instrumentet följer en saneringsfas med 70 % isopropanol eller 20 % vanligt blekmedel, följt av två
tvättfaser. Om instrumentet inte ska användas mer under dagen, kan det stängas av nu.
3. När en batch är klar, exporteras dina data som en kommaseparerad fil (csv). Dessa filer döps till ’OUTPUT.CSV och sparas
i en mapp med samma batchnamn som matades in i Luminex IS. Dessa data är nu tillgängliga för typning enligt
nedanstående anvisningar.
*I bruksanvisningen till Luminex hittar du information om instrumentets hanteringsprocedurer, inkl. initiering, kalibrering, underhåll och avstängning.
RESULTAT
Så här kan typningen gå till:
De genererade CSV-filerna kan öppnas och dess data bearbetas i vanliga kalkylprogram som t ex. Microsoft Excel, Lotus 123, Corel
Quattro Pro eller motsvarande programvara. Analysen består av följande faser:
1) Se till att antalet event för respektive SSO i varje prov är minst 60. Du hittar den här informationen under DataType (Datatyp):
Count (Räkna) i CSV-filen.
2) Kontrollera att värdena för respektive provs konsensussonder ligger över det lägsta medianvärdet för fluorescensintensitet eller MFI.
Lägsta tröskelvärdet är partispecifikt. Du hittar det i tröskelvärdestabellen.
Varning:
•
För att resultaten ska bli tillförlitliga måste tillräcklig mängd data hämtas in av Luminex Instrument.
3) Samla in minst 60 händelser för varje SSO genom att dra ifrån sondens bakgrundskontrollvärde från provets värde, erhålls en
korrigerad uppsättning bakgrundsdata. Bakgrundskontrollens värden återfinns i tröskelvärdestabellen och är partispecifika.
Bakgrundsvärdena är genomsnittliga MFI-värden för respektive kula och ska kompensera för bakgrundsbrus orsakat av avvikelser.
4) Genom att, för respektive prov, dela varje sonds korrigerade bakgrundsdata med motsvarande konsensussonds korrigerade
bakgrundsvärde, erhålls en normaliserad uppsättning data.
MFI (sond) – MFI (kontrollämne för sonden)
MFI (konsensus) – MFI (kontrollämne för konsensus)
5)
6)
Vid respektive sond anges det normaliserade värdet i tröskelvärdestabellen.
När samtliga sonder har tilldelats värden kan träffmönstret (d v s kombinationen av alla positiva och negativa uppgifter för ett givet prov)
jämföras med de medföljande träfftabellerna för sonder.
Varning:
•
Varje lokus och varje sondblandning har en separat tröskelvärdestabell.
Sida 8 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
•
•
•
Dessa tröskelvärdestabeller är partispecifika. Kontrollera att partinumret i tabellen matchar partinumret på typningspaketet.
Om ett normaliserat värde för en viss sond hamnar över maxgränsen för en negativ uppgift, och under minimigränsen för en positiv
uppgift, ska sondens prov anses resultatlöst. Provet ska typas, först genom att värdet antas vara negativt och sedan genom att värdet
antas vara positivt.
I avsnittet FÖRVÄNTADE VÄRDEN finns mer information om tröskelvärden.
KVALITETSKONTROLL
Det rekommenderas att en negativ och en positiv kontroll körs med varje prov, till exempel ett blindprov med vatten och ett tidigare typbestämt prov. Consensus
sekvensspecifika oligonukleotid (SSO) sonder, som listas i tröskeltabellen, hybridiseras till respektive lokusspecifika alleler. Värden som inhämtas med
Consensus SSO från positiva kontroller ska överskrida tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges i arbetsbladet med tröskeltabellen. Värden som inhämtas
med Consensus SSO från blindprov med ska ligga under tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges I arbetsbladet med tröskeltabellen.
LIFECODES sondblandningar innehåller en eller flera SSO-konsensussonder identifierade i arbetsbladen för typningspaketet. Dessa konsensussonder
hybridiserar till alla alleler och fungerar som interna kontroller för att verifiera förstärkning och för att bekräfta att hybridisering skett. Om minimivärdet inte
inhämtas för dessa SSO, kan det inträffa att provet inte ger rätt typ. Provet får då upprepas.
Analysen bör köras enligt rekommendationen i förpackningen, samt enligt övriga kvalitetskontrollmetoder i enlighet med gällande lokala, delstatliga, federala
och/eller andra kontrollorgan.
PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR
De beskrivna förutsättningarna för PCR och utvärdering kräver noggranna kontroller. Avvikelser från dessa parametrar kan leda till felaktigheter.
Alla instrument ska kalibreras enligt tillverkarens anvisningar och användas inom ramen för tillverkarens parametrar.
1)
2)
3)
4)
5)
Kulorna värms upp i förväg och ska vara väl uppslammade före användning. På så sätt garanteras att hybridiseringsbuffertens komponenter finns
med i lösningen.
Inkubation vid 47°C respektive 56 °C kräver precision på hög nivå (+/- 0,5 C). Använd termocykler. Temperaturen ska kontrolleras på plattan i en
termocykler med 96 brunnar, med hjälp av en termoomkopplare (t ex. Bio-Rad, VPT-0300 eller motsvarande). Temperaturen i och mellan
brunnarna får inte avvika mer än +/- 0,5 C.
Tiden vid 56 °C är kritisk och får inte överskrida sammanlagt 15 minuter. Här ingår 10 minuters inkubation plus max 5 minuter för spädning
av samtliga prov med förtunning/ SA-PE-blandningen.
Efter spädning är proven stabila i rumstemperatur i upp till 2 timmar (förvaras mörkt). Det kan ta hela 1,5 timme att köra en hel 96-brunnsplatta
genom Luminex, och för att garantera att det sista provet analyseras inom tvåtimmarsgränsen bör analysen startas max. 30 minuter efter
spädningen.
Blanda inte komponenter från olika paket och partier.
På grund av HLA-typningens komplexa natur bör endast kvalificerad personal hantera datatolkningen och typningsuppgifterna.
FELSÖKNING
PROBLEM
Låg kulräkning
MÖJLIG ORSAK
Sondblandningen är inte ordentligt suspenderad
Instrumentet fungerar
inte som det ska
Kalibrering ej utförd
Provets flödesväg blockeras
CON tröskelfel
Provet gick inte att
förstärka/resultatet
blev dåligt*
Lågt DNA
Nålen avlägsnas och sonikeras. Gör en backspolning.
Om problemet kvarstår, kontakta Immucor Transplant
Diagnostics, Inc. +1-888-329-0255
Kontrollera DNA-produktens koncentration och renhet.
Salter i huvudblandning saknas
i lösningen
Värm Huvudblandning vid 37 °C i 5 minuter, vortexa
försiktigt och centrifugera helt kort.
Dålig Taq-polymeras
Använd validerad LIFECODES Taq-polymeras katalog
nr. 628075.
Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att
angivna parametrar efterföljs.
Värm förtunningslösningen i 45 °C i 5 minuter före
användning och vortexbehandling. Förvara i
rumstemperatur.
Byt ut R-fykoerytrin konjugerat streptavidin.
Förstärkningsförhållandena följer inte de angivna
parametrarna
Lågt medianvärde för fluorescensintensitet (MFI)
Flerfaldiga SSO-fel
alternativt provet
producerar ej HLAtypningsresultat
Allelspecifik förstärkning
LÖSNING
Förvärm, sonikera och vortexa sondlösningen och
upprepa analysen.
Kalibrera instrumentet. (Se bruksanvisningen till
Luminex IS.)
Förstärkningsförhållandena
följer inte angivna parametrar
Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att
angivna parametrar efterföljs.
Förorenat DNA-prov
Återisolera DNA från blodprovet.
Delvis nedbruten DNA-produkt
Avdunstning i samband med hybridisering
Om du inte använder hela plattan, låt en rad på
respektive sida om analysproverna vara tom, så att
plattan kan förseglas ordentligt.
* PCR-förstärkning kan bekräftas med gelelektrofores (se bilaga A).
Sida 9 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Värden kan normalt bestämmas som positiva och negativa. I vissa sällsynta fall kan värdena vara resultatlösa. ”Resultatlöst värde” innebär att varken positiva
eller negativa värden har kunnat iakttas. Om ett prov innehåller resultatlösa värden för en viss SSO-sond, ska provet typas med den sond som är negativ och
därefter med den sond som är positiv. Tre utfall finns:
1. Ett av alternativen (dvs. positiv eller negativ) matchar.
2.
3.
•
•
•
Båda alternativen ger matchningar.
•
Provet kan analyseras på nytt eller också kan allelerna från båda typningarna rapporteras.
Inget av alternativen ger matchning.
•
I det här fallet finns troligtvis flera sonder med felaktiga uppgifter. Provet måste analyseras på nytt och möjligtvis kopieras om.
Om fler än två sonder är resultatlösa, ska hela provet analyseras om.
Om ett träffmönster inte resulterar i en HLA-typning, ska provet kopieras om och analyseras på nytt. Eventuellt måste även DNA återisoleras ur provet,
samt kopieras och analyseras på nytt.
Som angavs i avsnittet Procedurens begränsningar, är det mycket viktigt att protokollet följs exakt. Eventuella avvikelser kan leda till en
misslyckad typning.
SPECIFIKA PRESTANDAEGENSKAPER
När LIFECODES HLA SSO typningssats används enligt proceduren som beskrivs i produktinlagan kan DNA-typning av HLA i klass I och klass II fastställas.
HLA-A eRES-satsen visar en 98,46 % överensstämmelse (94,24 % lägre gräns på 95 % konfidensintervall). Satserna HLA-B eRES, DRB1 eRES och DRB 3, 4,
5 100 % överensstämmelse (97,72 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) och HLA-C eRES-satsen visar 99,23 % överensstämmelse (95,75 % undre gräns
på 95 % konfidensintervall) för 130 prover utvärderade vid jämförelse med resultat som inhämtats med tvåriktad sekvensering. Satserna HLA-A, B, C och DQB
visar 100 % överensstämmelse (92,9 % under gräns på 95 % konfidensintervall) och DRB-satserna visar 98 % överensstämmelse (89,4 % lägre gräns av 95 %
konfidensintervall) för 50 prover som bedöms i jämförelse med resultaten som erhålls med Pel-Freez SSP UniTray-metoden. HLA-DRB1-satsen visar 98 %
överensstämmelse (91,1 % lägre gräns konfidensintervall) för 60 prover utvärderade vid jämförelse med resultat som inhämtats med LIFECODES HLA-DRBsats.
REFERENSER
1.
2.
Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225
Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163
3.
4.
Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290
Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231
BEGRÄNSADE LICENSER
Taq-polymeras tillverkas för Immucor Transplant Diagnostics av Promega Corp. Den är licensierad till Promega enligt amerikanska patent nr.
5,338,671 och 5,587,287 och deras utländska motsvarigheter. Vid köp av den här produkten erhålls en begränsad icke överförbar licens enligt
amerikanska patent nr. 5,981,180 eller utländsk motsvarighet, som innehas av Luminex Corporation för utförandet av flertaliga HLA-typningsanalyser av kliniska
prover.
_______________________________________________________________________________________________________________
INFORMATION OM TILLVERKAREN:
Tillverkare: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, CT 06902. Tel.: 203-328-9500, 888-329-0255
Fax: 203-328-9599
Auktoriserad representant: Emergo Europe, Molenstraat 15, 2513 BH, Haag, Nederländerna, Tel.: (31) (0) 70 345 8570,
Fax: (31) (0) 70 346 7299
Europeisk teknisk service: Tel.: +32/3 385 4791
Dokumentets senaste revidering och utgivning: Rev. 4; 2014-02-11
ANVÄNDA VARUMÄRKEN
AB Gene®
Costar®
Microseal™
IDNA™ Agarose
GelStar™
AB Gene House
Corning Incorporated
Bio-Rad Laboratories, Inc.
Lonza Group, Ltd.
Lonza Group, Ltd.
Luminex®
Gene Amp®
Veriti™
Mastercycler®
LIFECODES®
Sida 10 av 11
Luminex Corporation
Roche Molecular System
Applied Biosystem
Eppendorf
Immucor Inc.
LC775TIVDSV.4 (02/14)
BILAGA A
Gelelektrofores
PCR-reaktionerna som utförs med LIFECODES HLA-SSO typningssatser är avsedda att generera både dubbel- och enkelsträngade produkter, dvs. de
produkter som i huvudsak hybridiseras till SSO. Vid kvalitetskontroll eller felsökning av ett experiment kan ev. en gelelektrofores krävas för att kontrollera
förekomsten av förstärkt DNA i PCR-reaktionen
Erforderligt material (listat eller motsvarande material)
•
•
•
Elektrofores agaros (Lonza Group, Ltd. IDNA® agaros nr. 50170)
Elektroforesinstrument/nätanslutning
1 x gelbuffert (40xTAE, Promega nr. V4281)
•
•
•
GelStar® Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. nr. 50535)
UV Transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. modell TM36)
Bildhanteringssystem
Den relativa migrationen av den enkelsträngade produkten beror på gelkoncentrationen och vilket buffertsystem som används. Ungefärliga migrationer vid varje
förstärkning listas nedan för prover som körs i 2 %-ig agarosgel i 1x TAE-buffert.
Elektroforesens förutsättningar
1.
2.
Ta ut GelStar® Nucleic Acid Stain (Lonza Group nr. 50535) ur frysen och låt tina. Förvara mörkt.
Den gel som används här måste vara 2 %-ig, dvs. till en 200 ml gelbädd används 4 gram agaros till 200 ml 1X TAE (späd från 40X TAE). Tillsätt 10 µl
GelStar® Nucleic Acid Stain till den smälta agarosen. När gelen öses, lämna rikligt med utrymme för DNA-produktens stigning (3-5 cm). VAR FÖRSIKTIG:
GelStar® är en potentiell carcinogen.
ANMÄRKNING: Det går att köra geler med 20 µl av 10 mg/ml etidiumbromid i stället för GelStar® Nucleic Acid Stain. Produktbandets intensitet är lägre med gel
som innehåller etidiumbromid än geler med GelStar®. VAR FÖRSIKTIG: Etidiumbromid är en känd carcinogen.
3. Förvara gelen mörkt och låt stelna.
4. Lägg i en blandning av 2,5 µl av varje PCR-produkt och 2,5 µl 2 X laddningsbuffert med synlig färg per prov, per förstärkning. Kör gelen i mörker vid cirka
160 V i ungefär 45 minuter, eller tills provet har körts så länge att det går att iaktta separata band för enkel- och dubbelsträngad produkt (bromofenolblå
band eller annan synlig markör migrerar 3-5 cm från brunnarna).
5. Fotografera med UV-transilluminator och ett GelStar® gult fotofilter (Lonza Group Ltd. nr. 50536).
OBSERVERA: Vid hantering av GelStar® Nucleic Acid Stain eller etidiumbromid, samt vid fotografering av gel med UV-transilluminator, ska
skyddsutrustning bäras.
Gelanalys
HLA-A
HLA-B
HLA-C
HLA-DRB1
HLA-DRB
3,4,5
HLA-DQB
Dubbelsträngad(e) (bp)
~420
~370, ~340
~476, ~447
~280
~280
~260, ~160
Enkelsträngad(e) (bp)
~240
~200
~250, ~200
~180
~180
~170, ~100
Geltolkning
Förstärkning
Icke-förstärkning
Brunn
Dubbelsträngat DNA
Enkelsträngat DNA
----(Bright)
--------(mindre ljust)
Primerband
Sida 11 av 11
LC775TIVDSV.4 (02/14)
