Immucor Transplant Diagnostics, Inc
550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 USA
Tel: +1.203.328.9500 eller 888.329.0255 (i USA och Kanada), Fax: +1.203.328.9599
WWW.IMMUCOR.COM
Produktdokumentation och översättningar på: www.Immucor.com
PRODUKTINLAGA
LIFECODES HLA SSO TYPNINGSPAKET används till Luminex®
För invitrodiagnostik.
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
Symboler .....................................................
1
Bruksanvisning ..............................................
5
Reagenser med katalognummer ...............
2
A. Rening av genomiskt DNA .......................
5
Användningsområde .................................
4
B. Förstärkning .............................................
5
Översikt och förklaring ..............................
4
C. Hybridisering............................................
7
Procedurens principer ...............................
4
D. Analys med Luminex ...............................
7
Reagenser ...................................................
4
Resultat...........................................................
7
A. Identifiering ..........................................
4
Kvalitetssäkring .............................................
7
B. Varningstexter......................................
4
Procedurens begränsningar .........................
7
C. Förvaringsanvisningar .........................
4
Felsökning ......................................................
8
D. Rening eller förbehandling ...................
4
Förväntade värden .........................................
8
E. Instabilitetsindikatorer ..........................
4
Specifika funktionsegenskaper ....................
8
Instrumentkrav ...........................................
4
Referenser ......................................................
8
Provtagning och förberedning ..................
4
Begränsad licens ...........................................
9
Procedur .....................................................
5
Använda varumärken ....................................
9
A. Tillhandahållet material ........................ 5
B. Material, reagenser och utrustning som
behövs, men inte tillhandahålls ............ 5
Bilaga A ..........................................................
Gelektrofores ...............................................
Geltolkning ...................................................
9
9
9
SYMBOLER (Produktetiketter och dokumentbilagor)
Partinummer
Katalognummer
Temperaturomfång
Övre
temperaturgräns
Utgångsdatum
Förvaras mörkt
Lämpligt för
N-tester
Får ej frysas
Varning – Se
bruksanvisning
Se
bruksanvisning
Tillverkare
Europeisk
auktoriserad
representant
Sida 1 av 9
EC REP
LC775IVDSV.17 (02/14)
REAGENSER MED KATALOGNUMMER
LM-A LIFECODES HLA-A Typningspaket används till Luminex
Reagens
Produktnr 628410-50
Produktnummer
Fyllnadsvolym
Förvaring
Räcker till 50 prover
MX-A
LIFECODES HLA-A Huvudblandning
628405
870 µL
2 till 8°C
BM-A
LIFECODES HLA-A Sondblandning ‡
628453
810 µL
2-8 °C Förvaras mörkt
DS
Förtunning
628155
9,9mL
18 till 30°C
LC-AE LIFECODES HLA-A eRES Typningspaket används till Luminex
Reagens
Produktnr 628459-50
Produktnumme
r
Fyllnadsvolym
MX-A
LIFECODES HLA-A Huvudblandning
628405
870 µL
BM-A
LIFECODES HLA-A Sondblandning‡
628453
810 µL
BM-AeRES LIFECODES HLA-A eRES Sondblandning‡
628455
810 µL
DS
628515
19,7mL
Förtunning
Förvaring
Räcker till 50 prover
Produktnr 628510-50
Produktnummer
Fyllnadsvolym
MX-B
LIFECODES HLA-B Huvudblandning
628556
870 µL
BM-B
LIFECODES HLA-B Sondblandning ‡
628553
810 µL
DS
Förtunning
628155
9,9mL
Förvaring
Räcker till 50 prover
Produktnr 628559-50
Produktnumme
r
Fyllnadsvolym
MX-B
LIFECODES HLA-B Huvudblandning
628556
870 µL
BM-B
LIFECODES HLA-B Sondblandning ‡
628553
810 µL
BM-BeRES
LIFECODES HLA-B eRES Sondblandning‡
628554
810 µL
DS
Förtunning
628515
19,7mL
Förvaring
Räcker till 50 prover
Produktnr 628810-50
Produktnummer
Fyllnadsvolym
MX-C
LIFECODES HLA-C Huvudblandning
628803
870 µL
BM-C
LIFECODES HLA-C Sondblandning ‡
628802
810 µL
DS
Förtunning
628155
9,9mL
‡
Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån.
Sida 2 av 9
50
2 till 8°C
2 till 8°C
Förvaras mörkt
2 till 8°C
Förvaras mörkt
18 till 30°C
LM-C LIFECODES HLA-C Typningspaket används till Luminex
Reagens
50
2 till 8°C
2 till 8°C
Förvaras mörkt
18 till 30°C
LC-BE LIFECODES HLA-B eRES Typningspaket används till Luminex
Reagens
50
2 till 8°C
2 till 8°C
Förvaras mörkt
2 till 8°C
Förvaras mörkt
18 till 30°C
LM-B LIFECODES HLA-B Typningspaket används till Luminex
Reagens
50
Förvaring
50
Räcker till 50 prover
2 till 8°C
2 till 8°C
Förvaras mörkt
18 till 30°C
VARNING: Använd ej produkterna efter utgångsdatum.
LC775IVDSV.17 (02/14)
LM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Typningspaket används till Luminex
Reagens
Produktnr 628751-50
Produktnummer
Fyllnadsvolym
MX-DR1
LIFECODES HLA-DRB1 Huvudblandning
628753
870 µL
BM-DR1
LIFECODES HLA-DRB1 Sondblandning ‡
628752
810 µL
DS
Förtunning
628155
9,9mL
Räcker till 50 prover
2 till 8°C
2 till 8°C
Förvaras mörkt
18 till 30°C
LC-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eRES Typningspaket används till Luminex
Reagens
MX-DR1
BM-DR1
BM-DR1eRES
DS
LIFECODES HLA-DRB1
Huvudblandning
LIFECODES HLA-DRB1
Sondblandning ‡
LIFECODES HLA-DRB1 eRES
Sondblandning ‡
Förtunning
Produktnr 6287519-50
Fyllnadsvolym
Förvaring
628753
870 µL
2 till 8°C
628752
810 µL
628755
810 µL
628515
19,7mL
Produktnummer
2 till 8°C
Förvaras mörkt
2 till 8°C
Förvaras mörkt
18 till 30°C
MX-DRB3,4,5
BM-DRB3,4,5
DS
Produktnr 629200-50
Produktnummer
Fyllnadsvolym
Förvaring
629201
870 µL
2 till 8°C
Sondblandning ‡
629202
810 µL
Förtunning
628515
19,7 mL
LIFECODES HLA DRB 3,4,5
Huvudblandning
LIFECODES HLA DRB 3,4,5
LM-DQB LIFECODES HLA-DQB Typningspaket används till Luminex
Reagens
Fyllnadsvolym
MX-DQB
LIFECODES HLA-DQB Huvudblandning
628305
870 µL
BM-DQB
LIFECODES HLA-DQB Sondblandning ‡
628304
810 µL
DS
Förtunning
628155
9,9mL
Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån.
Sida 3 av 9
50
Räcker till 50 prover
2-8ºC
Förvaras mörkt
18 till 30ºC
Produktnr 628610-50
Produktnummer
‡
50
Räcker till 50 prover
LC-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Typningspaket används till Luminex
Reagens
50
Förvaring
Förvaring
50
Räcker till 50 prover
2 till 8°C
2 till 8°C
Förvaras mörkt
18 till 30°C
VARNING: Använd ej produkterna efter utgångsdatum.
LC775IVDSV.17 (02/14)
ANVÄNDNINGSOMRÅDE
DNA-typning av HLA-alleler klass I och klass II.
ÖVERSIKT OCH FÖRKLARING
DNA-baserad HLA-typning med PCR-förstärkt DNA är en vanlig laboratorieprocess. PCR-förstärkning av DNA används i syfte att anrika en viss DNA-region. Vid
HLA-typning används en efterföljande analys som ska fastställa egenskaperna hos förstärkt DNA. Flera analystyper, som t ex. SSP (1), direkt SSOP (2), RFLP
(3) och omvänd SSOP punktblottningsteknik (4) har använts vid HLA-typning. LIFECODES HLA-SSO typningspaket använder, precis som SSOP och omvänd
punktblottningsteknik, sekvensspecifika oligonukleotider (SSO) för att identifiera de HLA-alleler som förekommer i ett PCR-förstärkt prov. Det är SSOuppsättningen och inte metoderna som avgör förmågan att urskilja olika alleler i PCR-förstärkningen. För omvänd punktblottningsteknik och SSOP används
enzymetiketter och kolorimetriska substrat vilket kräver vidareutveckling, medan LIFECODES-analysen är ett homogent multiplexsystem. Det innebär att SSOanalyserna sker simultant och hela analysen utförs i ett och samma reagensrör vid tillsättningen av en enskild reagens.
PROCEDURENS PRINCIPER
Själva LIFECODES HLA-SSO-typningen är baserad på hybridisering av etiketterade enkelsträngade PCR-produkter till SSO-sonder. Vid PCR-förstärkning av
DNA används vanligtvis ekvimolara mängder av både framåt- och bakåtprimerer för att skapa en dubbelsträngad DNA-produkt. Men om mängden av en
primer mycket överskrider de övriga, kan reaktionen generera några enkelsträngade DNA-produkter utöver de dubbelsträngade. Under LIFECODESförstärkningens initiala cykler genereras dubbelsträngat DNA. När den begränsande primeren är slut använder återstående primerer den dubbelsträngade
produkten som mall för att skapa enkelsträngat DNA. Den här metoden ger alltså både dubbel- och enkelsträngade produkter, som båda vid denaturering deltar i
hybridiseringsreaktionen.
Var och en av sonderna är ev. homolog till en sekvens i kopierad DNA-produkt, som är unik för en allel eller en grupp av alleler. Dessa sonder är alltså
utformade så att var och en av dem prioriterar hybridiseringen av en kompletterande region, som ev. förekommer i den kopierade DNA-produkten. Förstärkt
DNA hybridiseras också mot en eller flera konsensussonder som ska är homologa till sekvenserna i samtliga alleler i ett lokus. SSO-typningen kan påverkas
av typen av biologiskt material, reningsmetod, den genomiska DNA-produktens mängd och integritet. Den signal som erhålls för konsensussonden/-sonderna
kan således fungera som en indikator för en framgångsrik förstärknings- och hybridiseringsprocess. Den signal som konsensussonden ger kan även användas
för att normalisera signalen från allelspecifika sonder, och korrigera för ev. varierande mängder av den kopierade produkten i hybridiseringsreaktionen.
Analyserna av resultaten från SSO-typningen kan användas för att fastställa närvaro eller frånvaro av en viss DNA-sekvens i förstärkt DNA, samt identifiera
möjliga alleler i provet.
Vid LIFECODES HLA-SSO-typningen fästs sonder vid Luminex Microspheres som är avsedda för Luminex. Upp till 100 olika populationer av Luminex
Microspheres kan blandas och analyseras av Luminex eftersom varje population av mikrosfärer kan urskiljas med hjälp av unika fluorescerande signaturer eller
färger. Olika SSO-sonder kan kopplas till varje färgmikrosfär. På så sätt kan en blandning av olika sonder särskiljas från varandra genom att de kan associeras
med en viss färgmikrosfär. Luminex kan även kvantifiera de relativa mängderna etiketterade PCR-produkter som hybridiseras i varje Luminex Microsphere. Den
relativa signalen som erhålls med SSO-sonderna vid LIFECODES-analysen kan därför, precis som med andra SSOP-metoder, användas för att fastställa
sondernas positiva eller negativa reaktivitet med det kopierade DNA-provet (se avsnittet Resultat). Härmed erhålls den information som krävs för att fastställa
provets HLA-fenotyp.
REAGENSER
A. Identifiering
I tabellerna i avsnittet Reagenser efter katalognummer hittar du kompletta listor över produkter och katalognummer.
B. Varningstexter
1.
2.
3.
4.
5.
För invitrodiagnostik.
Använd separata pipetter för för- och efterhantering av PCR.
Bioriskvarning: Alla biologiska prover och blodprover ska behandlas som potentiellt smittsamma. Följ allmänna säkerhetsåtgärder vid hantering.
Förtunning, sondblandningar, Taq-polymeras och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin innehåller farliga föreningar. Låt inte dessa komma i
kontakt med hud och ögon, och avyttra materialen efter användning i enlighet med lokala föreskrifter. Se säkerhetsinformationen för
ytterligare info.
Resultatet från dessa paket används ej som enda grund, på vilken ett kliniskt beslut som påverkar patienten fattas.
C. Förvaringsanvisningar
1.
2.
3.
Information om korrekta lagringstemperaturer hittar du på förpackningens etikett.
Sondblandningar och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin är ljuskänsliga, FÖRVARA MÖRKT; FÅR EJ FRYSAS.
Använd ej produkterna efter deras respektive utgångsdatum.
D. Rening eller förbehandling
Se ”Provtagning och förberedning”.
E. Instabilitetsindikatorer
1.
2.
Om salter har fällts ut ur lösningen under transport eller förvaring, måste dessa återlösas före användning. Vortexa i rumstemperatur
(18°C till 30°C).
Använd inte R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin som har frysts under transport eller förvaring.
INSTRUMENTKRAV
1.
2.
Luminex och XY-plattform (produktnummer 888300, 888310)
Termocykler utrustad med uppvärmt lock, inställningsbara ramptider, ett minsta termiskt område på 2°C till 100°C och en noggrannhet på minst +/0,5°. Villkoren för termocyklers kan behöva ändras för att profilerna ska kunna optimeras. En termoprofil kan erhållas genom att kontakta Technical
Service på telefon. +1 (203) 328-9500 eller i USA och Kanada (888) 329-0255.
PROVTAGNING OCH FÖRBEREDNING
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Mänskligt DNA kan renas från helblodprover, lättcellsskikt eller bukala svabbprover med hjälp av en validerad process som uppfyller kriterierna nedan.
DNA extraherad från blod bevarat i EDTA och ACD (Acid Citrate Dextrose) har testats och har visat förväntade resultat i denna analys. DNA
extraherat från blod bevarat i heparin kan inte användas i denna analys. Andra konserveringsmedel har inte testats.
Isolerat DNA ska ligga i 10 mM TRIS, pH 8,0-9,0 eller i sterilt vatten. Vid förekomst av ett kelatbildande medel som t ex. EDTA, får inte den
slutgiltiga koncentrationen av det kelatbildande medlet överskrida 0,5 mM.
Förekomst av alkohol, rengöringsmedel eller salter kan påverka DNA-förstärkningen negativt.
Slutgiltig DNA-koncentration bör vara 10 – 200 ng/µL.
Mätning av absorberingen i DNA-proverna vid 260 och 280 nm bör ge en proportion på 1,65 till 2,0.
Sida 4 av 9
LC775IVDSV.17 (02/14)
g.
DNA-produkten kan användas omedelbart efter isoleringen, eller lagras vid -20 °C i upp till ett år. Upprepad infrysning/upptining bör undvikas eftersom
det kan försämra kvaliteten.
PROCEDUR
A. Tillhandahållet material (I tabellerna i avsnittet Reagenser efter katalognummer finns mer information)
•
•
Lämplig huvudblandning (MX)
Lämplig sondblandning/sondblandningar (BM)
•
Förtunning (DS)
Tröskeltabell(er), träffmönstertabell(er)
B. Material, reagenser och utrustning som behövs, men inte tillhandahålls (listat eller motsvarande)
•
•
•
•
•
•
•
•
R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin (SA-PE), 1 mg/mL (Lifecodes
kategorinr. 628511)
Luminex Sheath Fluid (1X eller 20X, Lifecodes kategorinr. 628005
eller 628025)
Rekombinant Taq-polymeras
Vortexmixer
Sterilt vatten (Lifecodes kategorinr. 757003; 20 mL)
PCR-rör och hattar (AB Gene® 0,2 mL Thermo Strip, nr. AB0451/G)
Termocykler (PCR) 96 brunnar (Costar® nr. 6509)
Microseal™-film (Bio-Rad. nr. MSA-5001) eller -tejp
(Costar® nr. 6524)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Termocykler (se Instrumentkrav, sidan 3)
Badsonikator (Fisher Scientific, nr. FS15 eller FS20)
Mikrocentrifug
Spärrfiltermunstycken
Luminex kalibreringskulor (Cal 1, Cal 2, Con 1 och Con 2, Lifecodes
kat.nr. 628006, 628007, 628008 respektive 628009)
Pipettorer, flerkanaliga pipettorer och munstycken (1-20µL, 20-200µL, 1000µL)
Kalkylprogramvara för presentation av kommaseparerade filer (csv)
Värmeblock (Fisher Scientific standardvärmeblock, nr. 13259-030)
70 % isopropanol eller 20 % blekmedel
BRUKSANVISNING
ANMÄRKNINGAR:
•
Sondblandningar och SA-PE är ljuskänsliga: förvaras mörkt och får ej frysas.
•
Värm kulorna till 55 - 60 °C i minst 5-10 minuter så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen.
•
Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt uppslammade.
•
Var mycket försiktig vid alikvoteringen, använd kalibrerade pipetter. Annars får du ev. ingen reagens och provet misslyckas.
•
Alla temperaturangivelser måste iakttas noggrant. Så små fluktuationer som +/- 0,5 °C kan påverka resultatet.
•
I hybridiseringsfasen får proverna inte förbli i utspätt tillstånd vid 56 °C i mer än fem minuter (se avsnittet Resultat).
•
Vi rekommenderar att de kopierade proverna analyseras så snart som möjligt. Om proverna inte kan köras i Luminex samma dag,
kan den kopierade produkten lagras i upp till tre dagar vid 2-8 °C innan den används. Vid längre förvaring rekommenderas
–20ºC under upp till en vecka fram till tidpunkten för analysen. Den kopierade produkten kan bara frysas och tinas en gång.
Upprepad infrysning och upptining gör att de kopierade proverna bryts ned, vilket ger sämre resultat vid analysen.
A. Rening av genomiskt DNA, med valfri metod. Slutgiltig koncentration ska ligga på 10 – 200 ng/µL. Justera vid behov med
sterilt vatten. Se till att alla prover håller samma koncentration.
B. DNA-förstärkning (PCR)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Värm huvudblandningen (MX) till rumstemperatur (18 till 30 °C).
Vortexa försiktigt reagenserna i cirka 10 sekunder. På så sätt garanteras salthalterna i lösningen. Snurra försiktigt (5-10 sekunder) i
mikrocentrifug så att innehållet hamnar på botten av röret.
Använd Tabell 1 nedan när du förbereder komponenterna för förstärkning av n+1 reaktioner. Använd mängdanvisningarna för
respektive komponent per reaktion (utom för DNA). Den slutgiltiga volymen ska vara 50µL per reaktion med sterilt vatten. Vortexa
försiktigt, centrifugera ner och lägg på is.
Pipettera lämplig mängd genomiskt DNA (100 till 300 ng) i PCR-rören.
Alikvotera huvudblandningen i PCR-rören med genomiskt DNA. (Den sammanlagda volymen av huvudblandningen och genomiskt
DNA ska vara 50µL för respektive reaktion.)
Förslut rören väl för att undvika avdunstning vid PCR.
Placera proverna i termocyklern och kör programmet, se Tabell 2.
Tabell 1. Reagenskomponenter vid förstärkning
förstärkning
Komponent
Mängd per PCRprovsreaktion
LIFECODES
Huvudblandningen
Genomiskt DNA
10-200 ng/µL
Taq-polymeras
Sterilt vatten
Tabell 2. Termocyklerns förutsättningar för
15 µL
Totalt ~200 ng
0,5 µL (2,5 U)
Till 50 µL slutgiltig
volym
Anmärkning: För att provet säkert ska kopieras, se bilaga A –
Produktgelelektrofores.
Sida 5 av 9
95 °C i 5 min
Ant. cykler: 1
95 °C i 30 sek
60 °C i 45 sek
72 °C i 45 sek
Ant. cykler: 8
95 °C i 30 sek
63 °C i 45 sek
72 °C i 45 sek
Ant. cykler: 32
72 °C i 15 min
Ant. cykler: 1
LC775IVDSV.17 (02/14)
C. Hybridisering
•
•
1.
2.
3.
4.
5.
Kontrollera att hybridiseringens buffertkomponenter i LIFECODES sondblandning solubiliseras och att kulorna är
helt uppslammade.
Starta Luminex och XY-plattformen och låt värma upp i 30 minuter.
Värm sondblandningen i 55 - 60 °C i minst 5-10 minuter, så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen.
Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt uppslammade.
Alikvotera 5 µL av lokusspecifik PCR-produkt i en termocykler med 96 brunnar (Costar® nr. 6509).
Alikvotera 15 µL av lämplig sondblandningen i respektive brunn. eRes-paketet kräver två brunnar per prov, en för eRes
sondblandning och en för standardsondblandningen. eRes-sondblandningen och standardsondblandningen behöver inte köras
samtidigt. Båda sondblandningarna krävs för att erhålla eRes-resultat. Vid alikvotering av sondblandning till mer än 10 brunnar ska
man försiktigt vortexa sondblandningen efter varje uppsättning om tio. Försegla plattan med polyetentejp (Costar® No. 6524).
Hybridisera proverna med följande inkubationstemperaturer:
97 °C i 5 minuter
47 °C i 30 minuter
56 °C i 10 minuter
56 °C vänta (HOLD)
Tabell 3. Termocyklerns förutsättningar
för hybridisering
6.
7.
Medan proverna hybridiseras, förbered en 1:200 förtunning/SA-PE-blandning. Kombinera 170 µL förtunning (DS) och 0,85 µL
1 mg/ml SA-PE per prov. Här rekommenderas att förtunning för n+1 prover tillverkas, i händelse av pipetteringsförlust. (Se Tabell 4)
Förvara förtunningen/ SA-PE-blandningen i mörker, i rumstemperatur; SA-PE är ljuskänsligt! Förtunningen kan värmas i 45 °C i 5
minuter och vortexas vid ankomst, så att alla komponenter ligger kvar i lösningen. Förtunningen ska hålla rumstemperatur (18-30 °C)
innan du blandar. Förbered omedelbart före användning och avyttra ev. rester.
Tabell 4. Förberedning av
förtunning Volymer
Antal prov
1
5
10
20
50
Förtunning (DS)
170 µL
850 µL
1700 µL
3400 µL
8500 µL
SA-PE
0,85 µL
4,25 µL
8,5 µL
17 µL
42,5 µL
Anmärkning: STÄNG INTE AV HYBRIDISERINGSPROGRAMMET INNAN BRICKAN HAR AVLÄGSNATS FRÅN TERMOCYKLERN!
8. Vid väntan i 56 °C, medan brickan befinner sig i termocyklern, späd proverna med 170 µL förtunning/ SA-PE-blandning. Det är viktigt
att alla prov späds ut inom 5 minuter (efter 10 minuters väntan (HOLD) i 56°C).
9. Ta ut provbrickan från termocyklern och placera i Luminex.
D. Analysera provet med Luminex*
Bäst resultat får du om du analyserar proverna i Luminex omedelbart. Proverna kan läsas upp till 30 minuter efter utspädning. Om du inte
ska läsa proverna omedelbart, förvara dem i mörker.
1. Starta Luminex mellan 30 minuter och 4 timmar innan proverna ska analyseras.
2. Innan proverna analyseras i Luminex, ställ in den körning som ska användas vid analysen.
a) Välj Create a New Batch (Skapa ny batch) i File-menyn (Arkivmenyn).
•
Om du t ex. analyserar HLA-DRB1, lägg till Batch för HLA-DRB.
•
En Batchmall öppnas och döps, i det här fallet, till HLA-DRB.
•
Tänk på att mallversionerna är partispecifika och motsvarar partinumren på paketen.
•
Följ de stegvisa anvisningarna på skärmen när du skapar batchar.
•
När du namnger en batch, lägg inte in kommatecken i namnet eftersom all information efter ett komma går förlorad vid exportering
av data.
3.
•
Mer information om hur du skapar batchar och multibatchar finns i bruksanvisningen till Luminex.
b) Klicka på utmatningsikonen för att mata ut platthållaren. Placera termocyklerns platta med proverna i platthållarens
XYP-värmeblock.
c) Klicka på ikonen för inmatning av plattan. Nu är proverna klara att analyseras. En inledande fas utförs innan själva
körningen startas.
d) När proverna har körts igenom instrumentet följer en saneringsfas med 70 % Isopropanol eller 20 % vanligt blekmedel,
följt av två tvättfaser. Om instrumentet inte ska användas mer under dagen, kan det stängas av nu.
När en batch är klar, exporteras dina data som en kommaseparerad fil (csv). Dessa filer döps till ’OUTPUT.CSV’ och sparas
i en mapp med samma batchnamn som matades in i Luminex IS. Dessa data är nu tillgängliga för typning enligt
nedanstående anvisningar.
*I bruksanvisningen till Luminex IS hittar du information om hanteringsprcedurer, inkl. initiering, kalibrering, underhåll och avstängning.
Sida 6 av 9
LC775IVDSV.17 (02/14)
RESULTAT
Så här kan typningen gå till:
De genererade CSV-filerna kan öppnas och dess data bearbetas i vanliga kalkylprogram som t ex. Microsoft Excel, Lotus 123, Corel
Quattro Pro eller motsvarande. Analysen består av följande faser:
1) Se till att antalet event för respektive SSO i varje prov är minst 60. Du hittar den här informationen under DataType (Datatyp):
Count (Räkna) i CSV-filen.
2) Kontrollera att värdena för respektive provs konsensussonder ligger över det lägsta medianvärdet för fluorescensintensitet eller MFI.
Lägsta tröskelvärdet är partispecifikt. Du hittar det i tröskelvärdestabellen.
Varning:
•
För att resultaten ska bli tillförlitliga måste tillräcklig mängd data hämtas in av Luminex.
•
Samla in minst 60 händelser för varje SSO.
3)
4)
Genom att dra ifrån sondens bakgrundskontrollvärde från provets värde, erhålls en korrigerad uppsättning bakgrundsdata.
Bakgrundskontrollens värden återfinns i tröskelvärdestabellen och är partispecifika. Bakgrundsvärdena är genomsnittliga MFI-värden
för respektive kula och ska kompensera för bakgrundsbrus orsakat av avvikelser.
Genom att, för respektive prov, dela varje sonds korrigerade bakgrundsdata med motsvarande konsensussonds korrigerade
bakgrundsvärde, erhålls en normaliserad uppsättning data.
MFI (sond) – MFI (kontrollämne för sonden)
MFI (konsensus) – MFI (kontrollämne för konsensus)
5)
6)
Vid respektive sond anges det normaliserade värdet i tröskelvärdestabellen.
När samtliga sonder har tilldelats värden kan träffmönstret (d v s kombinationen av alla positiva och negativa uppgifter för ett givet prov)
jämföras med de medföljande träfftabellerna för sonder.
Varning:
•
Varje lokus och varje sondblandning har en separat tröskelvärdestabell.
•
Dessa tröskelvärdestabeller är partispecifika. Kontrollera att partinumret i tabellen matchar partinumret på typningspaketet.
•
Om ett normaliserat värde för en viss sond hamnar över maxgränsen för en negativ uppgift, och under minimigränsen för en positiv
uppgift, ska sondens prov anses resultatlöst. Provet ska typas, först genom att värdet antas vara negativt och sedan genom att värdet
antas vara positivt.
•
I avsnittet FÖRVÄNTADE VÄRDEN finns mer information om tröskelvärden.
KVALITETSSÄKRING
Det rekommenderas att en negativ och en positiv kontroll körs med varje prov, till exempel ett blindprov med vatten och ett tidigare typbestämt prov. Consensus
sekvensspecifika oligonucleotid (SSO) sonder, som listas i tröskeltabellen, hybridiseras till respektive lokusspecifika alleler. Värden som inhämtas med
Consensus SSO från positiva kontroller ska överskrida tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges i arbetsbladet med tröskeltabellen. Värden som inhämtas
med Consensus SSO från blindprov med ska ligga under tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges I arbetsbladet med tröskeltabellen.
LIFECODES sondblandningar innehåller en eller flera Consensus SSO sonder identifierade I arbetsbladen för typningspaketet. Dessa konsensussonder
hybridiserar till alla alleler och fungerar som interna kontroller för att verifiera förstärkning och för att bekräfta att hybridisering skett. Om minimivärdet inte
inhämtas för dessa SSO, kan det inträffa att provet inte ger rätt typ. Provet får då upprepas.
Analysen bör köras enligt rekommendationen i förpackningen, samt enligt övriga kvalitetskontrollmetoder i enlighet med gällande lokala, delstatliga, federala
och/eller andra kontrollorgan.
PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR
De beskrivna förutsättningarna för PCR och utvärdering kräver noggranna kontroller. Avvikelser från dessa parametrar kan leda till felaktigheter.
Alla instrument ska kalibreras enligt tillverkarens anvisningar och användas inom ramen för tillverkarens parametrar.
1)
2)
3)
4)
5)
Kulorna värms upp i förväg och ska vara väl uppslammade före användning. På så sätt garanteras att hybridiseringsbuffertens komponenter finns
med i lösningen.
Inkubation vid 47 °C respektive 56 °C kräver precision på hög nivå (+/- 0,5 °C). Använd termocykler. Temperaturen ska kontrolleras på plattan
i en termocykler med 96 brunnar, med hjälp av en termoomkopplare (t ex. Bio-Rad, VPT-0300 eller motsvarande). Temperaturen i och mellan
brunnarna får inte avvika mer än +/- 0,5 °C.
Tiden vid 56 °C är kritisk och får inte överskrida sammanlagt 15 minuter. Här ingår 10 minuters inkubation plus max 5 minuter för spädning
av samtliga prov med förtunning/ SA-PE-blandningen.
Efter spädning är proven stabila i rumstemperatur i upp till 2 timmar (förvaras mörkt). Det kan ta hela 1,5 timme att köra en hel 96-brunnsplatta
genom Luminex, och för att garantera att det sista provet analyseras inom tvåtimmarsgränsen bör analysen startas max 30 minuter efter
spädningen.
Blanda inte komponenter från olika paket och partier.
På grund av HLA-typningens komplexa natur bör endast kvalificerad personal hantera datatolkningen och typningsuppgifterna.
Sida 7 av 9
LC775IVDSV.17 (02/14)
FELSÖKNING
PROBLEM
Låg kulräkning
MÖJLIG ORSAK
Sondlösningen är dåligt uppslammad
Instrumentet fungerar
inte som det ska
LÖSNING
Förvärm, sonikera och vortexa sondlösningen och
upprepa analysen.
Kalibrera instrumentet. (Se bruksanvisningen till
Luminex IS.)
Kalibrering ej utförd
Provets flödesväg blockeras
CON-tröskelfel
Provet gick inte att
kopiera/resultatet
blev dåligt*
Lågt DNA
Nålen avlägsnas och sonikeras. Gör en backspolning.
Om problemet kvarstår, kontakta Immucor Transplant
Diagnostics, Inc. +1-888-329-0255
Kontrollera DNA-produktens koncentration och renhet.
Salter i huvudblandning saknas
i lösningen
Värm Huvudblandning vid 37 °C i 5 minuter, vortexa
försiktigt och centrifugera helt kort.
Dålig Taq-polymeras
Använd endast rekombinant Taq. Prova Lifecodes nr.
167075.
Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att
angivna parametrar efterföljs.
Värm förtunningen i 45 °C i 5 minuter före användning
och vortexíng. Förvara i rumstemperatur.
Byt ut R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin.
Förstärkningsförhållandena följer inte angivna parametrar
Lågt medianvärde för fluorescensintensitet (MFI)
Flerfaldiga SSO-fel
alt. provet
producerar ej HLAtypningsresultat
Allelspecifik förstärkning
Förstärkningsförhållandena
följer inte angivna parametrar
Förorenat DNA-prov
Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att
angivna parametrar efterföljs.
Återisolera DNA från blodprovet.
Delvis nedbruten DNA-produkt
Avdunstning i samband med hybridisering
Om du inte använder hela plattan, låt en rad på
respektive sida om analysproverna vara tom, så att
plattan kan förseglas ordentligt.
* PCR-förstärkning kan bekräftas med gelelektrofores (se bilaga A).
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Värden kan normalt bestämmas som positiva och negativa. I vissa fall kan värdena vara resultatlösa. ”Resultatlöst värde” innebär att varken positiva eller
negativa värden har kunnat iakttas. Om ett prov innehåller resultatlösa värden för en viss SSO-sond, ska provet typas med den sond som är negativ och därefter
med den sond som är positiv. Tre utfall finns:
1. Ett av alternativen (t.ex. positiv eller negativ) matchar.
2. Båda alternativen ger matchningar.
•
Provet kan analyseras på nytt eller också kan allelerna från båda typningarna rapporteras.
3. Inget av alternativen ger matchning.
•
I det här fallet finns troligtvis flera sonder med felaktiga uppgifter. Provet måste analyseras på nytt och möjligtvis kopieras om.
•
Om fler än två sonder är resultatlösa, ska hela provet analyseras om.
•
Om ett träffmönster inte resulterar i en HLA-typning, ska provet kopieras om och analyseras på nytt. Eventuellt måste även DNA återisoleras ur provet,
samt kopieras och analyseras på nytt.
•
Som angavs i avsnittet Procedurens begränsningar, är det mycket viktigt att protokollet följs exakt. Eventuella avvikelser kan leda till en
misslyckad typning.
SPECIFIKA FUNKTIONSEGENSKAPER
När LIFECODES HLA SSO typningspaket används enligt proceduren som beskrivs i produktinlagan kan DNA-typning av HLA i klass I och klass II fastställas.
HLA A eRes-paketet visar 98,46 % överensstämmelse (95,24 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) och HLA B eRes, DRB1 eRes och DRB 3-, 4-, 5paketen visar 100 % överensstämmelse (97,72 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) för 130 prover utvärderade vid jämförelse med resultat som inhämtats
med dubbelriktad sekvensering. HLA A-, B-, C- och DQB-paket visar 100 % överensstämmelse (92,9 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) och DRB-paket
visar 98 % överensstämmelse (89,4 % undre gräns på 95 % konfidensintervall) för 50 prover utvärderade vid jämförelse med resultat som inhämtats med PelFreez SSP UniTray-metoden. HLA DRB1-paketet visar 98 % överensstämmelse (91,1 % under gräns på 95 % konfidensintervall) för 60 prover utvärderade vid
jämförelse med resultat som inhämtats med LIFECODES HLA DRB-paket.
REFERENSER
1.
2.
Olerup, O., o.a. (1992) Tissue Antigens 39:225
Saiki, RK., o.a. (1986) Nature 324: 163
3.
4.
Sida 8 av 9
Maeda, M., o.a. (1989) Tissue Antigens 34: 290
Bugawan, TL., o.a. (1990) Immunogenetics 32: 231
LC775IVDSV.17 (02/14)
BEGRÄNSAD LICENS
Denna produkt tillhandahålls ej med Taq-polymeras och inkluderar ej en licens under de utländska patenten, vilka ägs av F. Hoffmann-La Roche Ltd. och Roche Molecular
Systems, Inc. att utföra den PCR-process (”Polymerase Chain Reaction”) som beskrivs i dessa patent. Mer information om kravet på att erhålla inköpslicenser i ditt land kan
erhållas från F. Hoffmann-La Roche Ltd. eller Roche Molecular Systems, Inc. Vid inköp av den här produkten erhålls en begränsad, icke överförbar licens enligt amerikanskt
patent 5,981,180 eller utländsk motsvarighet, som innehas av Luminex Corporation, för utförandet av flerfaldiga HLA-typningsanalyser av kliniska prover.
Tillverkare: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 USA
Telefon: +1.203.328.9500 eller 888.329.0255 (i USA och Kanada), Fax: +1.203.328.9599
Auktoriserad representant: Emergo Europe, Molenstraat 15, 2513 BH, The Hague, The Netherlands.
Telefon: (31) (0) 70 345 8570 Fax: (31) (0) 70 346 7299
Europeisk teknisk service: Telefon: +32/3 385 4791
Dokumentets senaste revidering och utgivning: Rev 17, 2014-02-11
ANVÄNDA VARUMÄRKEN
AB Gene®
Costar®
Microseal™
Luminex®
AB Gene House
Corning Incorporated
Bio-Rad Laboratories, Inc.
Luminex Corporation
IDNA® Agarose
QIAAmp™
GelStar®
Cambrex Bio Science
Qiagen Inc.
Cambrex Bio Science
BILAGA A
Gelektrofores
PCR-reaktionerna som utförs med LIFECODES HLA-SSO typningspaket är avsedda att generera både dubbel- och enkelsträngade produkter, d v s de
produkter som i huvudsak hybridiseras till SSO. Vid kvalitetskontroll eller felsökning av ett experiment kan ev. en gelelektrofores krävas för att kontrollera
förekomsten av förstärkt DNA i PCR-reaktionen.
Erforderligt material (listat eller motsvarande)
•
•
•
•
•
•
Elektrofores agaros (Cambrex IDNA® agaros nr. 50170)
Elektroforesinstrument/nätanslutning
1x gelbuffert (40xTAE, Promega nr. V4281)
GelStar® Nucleic Acid Gel Stain (Cambrex nr. 50535)
UV-transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. modell TM36)
Bildhanteringssystem
Den relativa migreringen av den enkelsträngade produkten beror på gelkoncentrationen och vilket buffertsystem som används. Ungefärlig migrering vid varje
förstärkning listas nedan, för prov som körs i 2 %-ig agarosgel i 1x TAE-buffert.
Elektroforesens förutsättningar
1.
2.
Ta ut GelStar® Nucleic Acid Stain (Cambrex nr. 50535) ur frysen och låt tina. Förvara mörkt.
Den gel som används här måste vara 2 %-ig, d v s till en 200 mL gelbädd används 4 gram agaros till 200 mL 1X TAE (späd från 40X TAE). Tillsätt 10 µL
GelStar® Nucleic Acid Stain till den smälta agarosen. När gelen öses, lämna rikligt med utrymme för DNA-produktens stigning (3-5 cm). VAR FÖRSIKTIG:
GelStar® är en potentiell carcinogen.
ANMÄRKNING: Det går att köra geler med 20 µL av 10 mg/mL etidiumbromid i stället för GelStar® Nucleic Acid Stain. Produktbandets intensitet är lägre med
gel som innehåller etidiumbromid än gel med GelStar®. VAR FÖRSIKTIG: Etidiumbromid är en känd carcinogen.
3. Förvara gelen mörkt och låt stelna.
4. Läsa in en blandning av 2,5 µL av varje PCR-produkten och 2,5 µL 2 X lastning buffert med synliga färgämnet per prov, per förstärkning. Kör gelen
i mörker vid cirka 160 V i ungefär 45 minuter, eller tills provet har körts så länge att det går att iaktta separata band för singel- och dubbelsträngad produkt
(bromofenolblå band eller annan synlig markör migrerar 3-5 cm från brunnarna).
5. Fotografera med UV-transilluminator och ett GelStar® gult fotofilter (Cambrex nr. 50536).
VARNING: Vid hantering av GelStar® Nucleic Acid Stain eller etidiumbromid, samt vid fotografering av gel med UV-transilluminator, ska
skyddsutrustning bäras.
6. Gelanalys
HLA-A
HLA-B
HLA-C
HLADRB1
HLA-DRB
3,4,5
HLA-DQB
Dubbelsträngad(e)
~420
~370, ~340
~476, ~447
~280
~280
~260, ~160
Enkelsträngad(e)
~240
~200
~250, ~200
~180
~180
~170, ~100
Geltolkning
Förstärkning
Icke-förstärkning
Brunn
Dubbelsträngat DNA
Enkelsträngat DNA
----(ljus)
------- (mindre ljust)
Primerband
Sida 9 av 9
LC775IVDSV.17 (02/14)
