Mikroorganismer i
avloppsrening
Sofia Andersson
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
1
• Hela phyl träd med eukaryoter o allt!
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
2
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
3
Metoder
• Klassisk mikrobiologi
– Isolering och karaktärisering
• Molekylärbiologiska metoder
–
–
–
–
–
–
Fluorescent in situ hybridization, (FISH)
16S rRNA profil
Confocal Laser Scanning Microscopy, (CLSM)
Digestion Gradient Gel Electrophoresis, (DGGE)
Microarray
FISH-microautoradiography (FISH-MAR)
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
4
EUB-probe, grön (alla bakterier)
B. denitrificans -probe (röd) och
EUB-probe (grön) överlappar ⇒
orange signal
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
5
Extrahera DNA från slam, amplifiera
16SrRNA-gen mha PCR
Spotta 100-100 000 DNAprober på glas slide
Märk in genfragmenten
med fluorofor
= Microarray
Hybridisera gener
och DNA-prober
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
6
Avloppsrening
• Primärrening: mekanisk rening (1) (4)
• Sekundärrening: biologisk nedbrytning av
organiskt material (3), aerob, anoxisk eller
anaerob
• Tertiärrening: kemisk och biologisk rening av
kväve och fosfor (2) (3)
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
7
Mikroorganismer i avloppsrening
• Aktiv slam
– modellsystem
• Biofilm
• Anaeroba processer
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
8
Aktiv Slam
Renar bort:
–
–
–
–
–
Typer av mikroorganismer:
C
N
P
Patogener
Partiklar
–
–
–
–
–
Bakterier
Protozoer
Svampar
Metazoer
Microalger
Viktiga slamegenskaper:
– Flockbildning
– Undvika slamsvällning och skumning
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
9
Heterotrofer
Org. C + O2 → biomassa (50%) + CO2 + H2O
• Aeroba/ Fakultativt
anaeroba/ Anoxiska/
Strikt anaeroba
• Snabb tillväxt ⇒ hög
slamproduktion
• Proteobacteria (phylum;
Class: α, β, γ, δ, ε)
2009-03-24
TABLE 8.2. Distribution of Aerobic Heterotrophic
Bacteria in Standard Activated Sludge
Genus or Group
Comamonas-Pseudomonas
% Total
Isolates
50.0
Alcaligenes
5.8
Pseudomonas (fluorescent group)
1.9
Paracoccus
11.5
Unidentified (gram-negative rods)
1.9
Aeromonas
1.9
Flavobacterium-Cytophaga
13.5
Bacillus
1.9
Micrococcus
1.9
Coryneform
5.8
Arthrobacter
Mikroorganismer i avloppsrening
Aureobacterium-Microbacterium
1.9
10
1.9
Bakterier i kväverening
• Kväve inkommer till avloppsreningsverk som
– NH4+
– Organiskt bundet kväve
• Mekanismer för att rena kväve
– Nitrifikation+Denitrifikation
– Anammox
– Uppbyggnad av nya celler
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
11
Nitrifierare
•
•
•
•
•
•
•
•
Strikta aerober
Autotrofer (CO2 som kolkälla)
Kemolitotrofer (inorg. e- donator)
Långsamväxande (delningstid ca 1-10 dagar)
Känsliga för extrema pH, gifter etc.
Gynnas av hög slamålder
Phylum: Proteobakteria, Nitrospira
Identifiering:
– amoA gen (α-subenhet av enzymet ammonia monooxygenase)
– Isolering i specifikt medium (tidskrävande)
– FISH
NH4
2009-03-24
Ammonium oxiderare
NO2
Nitrit oxiderare
Mikroorganismer i avloppsrening
NO3
12
Ammonium oxiderande bakterier (AOB)
NH3 + O2 + 2e- + 2H+ → NH2OH + H2O
NH2OH + H2O + ½O2 → NO2- + 2H2O + H+
NH3 + 1½O2 → NO2- + H2O
Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
13
Nitrit oxiderande bakterier (NOB)
NO2- + ½O2 → NO3Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus, Nitrospina
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
14
Denitrifierare
NO3- (NO2-) → N2 (gas)
• Många olika heterotrofa bakterier kan denitrifiera vid
anoxiska förhållanden
• Vanligast: stavformad, GFISH Comamonas denitrificans
• Aerobt
⇒ växer snabbt
⇒ denitrifierar inte
• Anoxiskt
⇒ Denitrifierar
⇒ Växer långsamt
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
15
5CH3COOH + 8NO3- → 8HCO3- + 2CO2 + 6H2O + 4N2
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
16
Denitrifierare : Identifikation
Identifiering:
– Enzym-gen som molekylär markör: nitrite reductase,
nitrous oxide reductase
– Isolering och gallring mha denitrifikationstest
• Mjukagar rör
• mikrotiterplatta
många arter av Pseudomonas
Brachyomonas denitrificans
Comamonas denitrificans
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
17
Anaerob Ammonium Oxidering - ANAMMOX
•
•
•
•
•
Kemolitoautotrof
Delningstid 2 veckor
NH4+ elektron donator och NO2- elektron acceptor
Upptäcktes 1986, producerar ca 50% av N2
unik komposition av membranet (ladderane lipider) med
anammoxosome organell
• Phylum: planctomycetes
NH4+ + NO2- → N2 + 2H2O
Brocadia, Kuenenia, Anammoxoglobus (sötvattenarter), Scalindua
(marina arter)
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
18
Anaerob Ammonium Oxidering - ANAMMOX
CANON:
"completely autotrophic nitrogen removal over nitrite”
→ Kombination av aeroba nitrifierande bakterier (AOB) och
anaeroba ANAMMOX bakterier
→ O2-halt max 0.5mg/L
NH4+
AOB
NO2-
+ NH4+
ANNAMOX
N2
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
19
Enhanced Biological Phosphorus Removal,
EBPR
1) Anaerob miljö
2) Aerob miljö
PAO bakterie
PAO bakterie
Poly-P
Fettsyror
(VFA)
2009-03-24
Fettsyror
(VFA)
Pi
Bacillus
Mikroorganismer i avloppsrening
20
- Avger fosfor under
anaeroba förhållanden
+ Tar upp fosfor under
aeroba förhållanden
= Netto: Upptag större än
utsläpp
3. poly-beta-hydroxyalkanoat (PHA)
granule (ljus) 4.polyfosfat granul (svart)
•Candidatus Accumulibacter phosphatis (Uncultivated betaproteobacteria)
•Actinobacterium
•(Acinetobacter)
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
21
Definition av Polyphosphate Accumulating
Organism (PAO)
•
•
•
•
•
Synliga poly-P och PHA granuler
Favorit kolkälla: acetat, propion-/smörsyra
Orörliga stavar/kocker
Lever helst i kluster
Gram +/- ?
Ingen enskild organism har hittills isolerats som har alla
dessa egenskaper
Definitionen är baserad på egenskaper hos EBPR slam
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
22
Flockbildande bakterier
Varför är flockar viktiga?
⇒Sedimentering, dvs separation av slamfas och
vattenfas efter det biologiska reningssteget
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
23
Flockbildande bakterier
Bra: Zoogloea – bildar
extracellulära polymerer
(EPS) som binder ihop
slamflockarna (ytladdningar,
hydrofoba interaktioner)
→ lätt sedimenterat
Dålig: Beggiatoa – bildar
löst sammansatta flockar
→ Sedimenterar dåligt
2009-03-24
FISH bild av den flockbildande bakterien Zoogloea i
aktivt slam med kväverening
Mikroorganismer i avloppsrening
24
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
25
2009-03-24
b) small, weak flocs
Bar = 10 micrometers
a) pin floc
c) flocs contining filamentous
organisms
d) flocs containing filamentous
Mikroorganismer i avloppsrening
organism “network" or “backbone
26
Filamentösa bakterier
FISH bild av Anaerolineae, anaerob filamentös
bakterie i aktivt slam med kväverening.
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
Elektronmikroskop bild av
Microthrix parvicella
27
Filamentösa bakterier
• Mycket filamentösa bakterier i aktivt slam:
⇒Löst sammansatta flockar
⇒Slamsvällning
⇒Dålig sedimentering
⇒Skumbildning
→hyrofob cellyta hos filamentösa bakterier
→Luftbubblor fastnar
• Gynnas av hög slamålder
• Microthrix parvicella
– Bekämpas med polyaluminium (påverkar cellytan)
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
28
Filamentösa bakteriers effekt på aktivslamflockars morfologi och
sedimenterbarhet
100 µm
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
29
Patogener
Aktivt slam tar bort 80-99 % av alla patogener
– inaktivering, betning av protozoer/metazoer,
slam-adsorption
Bakterier: Salmonella typhi,
Streptococcus fecalis, Klebsiella spp.,
Vibrio cholerae
Virus: Adenovirus, Enterovirus, Rotavirus
Protozoer: Giardia, Cryptosporidium
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
30
Patogener
• Hur mäta fekala patogena bakterier ?
– Indikatororganism
•
•
•
•
Finnas i tarmar hos varmblodiga djur
Inte patogena
Motståndkraft/Livscykel/Förekomst som motsvarar patogen
Detekterbar
→Fekala/Totala koliformer
– Aeroba/Fakultativt anaeroba, Gram -, inga sporer,
stavformade, fermenterar laktos inom 48 h
– Echerichia coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
31
Patogener
Detektion av koliformer
– most-probable-number, MPN
– membrane filter, MF
• Selektiva/Diffrentierande medium
– reagenskit, snabb detektion
MPN
MF
Rekomenderade max-halter av Fekala Koliformer:
Dricksvatten: 0 per 100 mL
Badvatten: 200 per 100 mL
Fiske: 1000 per 100 mL
Renat avloppsvatten: 200 per 100 mL
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
32
Protozoer
• Encelliga djur
– Flagellater (Bode spp.)
– Amöbor (Nueglaria spp.)
– Ciliater (Cyclidium spp.)
Vorticella, stjälk ciliat, 15-50 µm
• Funktion i aktivt slam:
– ”Betar” bakterier och org. C
– Indikator organismer
• Flagellater → mkt hög BOD halt
• Frisimmande Ciliater → hög BOD halt,
bra rening
• Stjälk ciliater → låg BOD halt
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
Paramecium, stor (100-300 µm)
simmande ciliat
33
Svampar
• Förekommer sällan i aktivt slam (utom jäst),
däremot relativt vanlig i biofilmsprocesser
Penicillium
• Gynnas av
– Lågt pH
– Toxicitet
– Kvävebrist
• Kan eventuellt orsaka slamsvällning
• Rhodotorula spp. (jäst), Geotrichum,
Penicillium, Cephalosporium
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
34
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
35
Metazoer
• Flercelliga djur
– Rotiferer, Maskar (Tubificidae), Nematoder, Insekter,
Insektslarver, Kräftdjur, Hjuldjur
•
•
•
•
Äter protozoer och bakterier – både bra och dåligt
Bildar flockar genom att avge slem
Mineralisering av slam?
Vanliga vid hög slamålder, bra luftning och låg BODbelastning
Collotheca
(Rotifer)
2009-03-24
Nematod
Mikroorganismer i avloppsrening
36
Lecane sp. (Rotifer)
Mikroalger
• Förekommer i aktivt slam
• Vanliga i biofilms processer samt dammar
• Finns speciella algreaktorer
Scenedesmus
– Algproduktion + Avloppsrening
– Algerna syresätter reaktorerna
• Scenedesmus, Monoraphidium
Monoraphidium
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
37
Biofilms processer
Biofilmer i avloppsreningsprocesser består av:
– Extracellulära polymeriska substanser (polysackarider,
proteiner, aminosyror, fetter)
– Bakterier
– Protozoer, Alger, Svampar, Flercelliga
djur
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
38
Biofilms processer
Varför biofilm?
•
•
•
•
•
Robust: Tåliga mot toxiner, pH variationer, ”protozo-betning”
Mindre slamproduktion
Kompakta reaktorer, stor kontaktyta
Ingen recirkulation behövs
Flexibla
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
39
Mikroorganismer i biofilmer
•
•
•
•
•
EPS-bildande bakterier: Zoogloea
Organotrofer: de flesta bakterier (bryter ned org. C)
Nitrifierande bakterier: NOB, AOB
Denitrifierande bakterier: B. denitrificans
Protozoer (äter bakterier och EPS och ser till att
biofilmen inte blir för tjock och kompakt)
• Alger (fotosyntetiserar, kvävefixerar)
• Svampar (bryter ner toxiska ämnen)
• Flercelliga djur (äter bakterier och EPS och ser till att
biofilmen inte blir för tjock och kompakt)
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
40
Biofilm formation
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
41
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
42
Biofilm struktur
•
•
•
•
•
Komplex, heterogen struktur
Bakterie/EPS aggregat
Filamentöst EPS
Tomrum
Kanaler m. diameter 20-200 µm(transporterar O2,
näringsämnen)
• Mikroporer
• Påverkas av flödeshastighet
– Högt flöde, kompakt biofilm
– Lågt flöde, fluffig biofilm
• Kommunicerar via s.k. Quorum sensing
• FISH-CSLM, SEM, Particle tracking, Cryosectioning,
micro-biosensors
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
43
Quorum sensing
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
44
Anaeroba processer
Org. C → nya celler (5%) + CH4 + CO2 + H2 + NH3 +H2S
+
+
+
+
+
-
CH4 = Biogas = Energi
Ingen luftning
Hög kolbelastning
Kan bryta ner svårnedbrytbara substanser
Låg slamproduktion
Långsam och känslig process
Mikroorganismer:
Bakterier dominerar, Arkebakterier (svampar, protozoer)
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
45
Komplext org. C
(polysackarider, fetter)
Hydrolys
Hydrolytiska bakterier
Monomerer
(glukos, aminosyror, fettsyror)
Fermentation
Syrabildande bakterier t.ex. Clostridium
Organiska syror, alkoholer, ketoner
Syrabildning
Ättikssyrabildande bakterier t.ex.
Syntrobacter, Syntrophomonas
Acetat, CO2, H2
Metanbildning
Metanproducerande bakterier
Metan (CH4), CO2
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
46
Metanproducerande bakterier
• Tillhör Arkebakterierna
• Obligat anaeroba
• Långsamväxande (delningstid 3-50 dagar)
• Hydrogenotrophic methanogenes
– CO2 + 4 H2 → CH4 + 2H2O
• Methanobacterium, Methanocaldococcus,
Methanospirillum
• Acetotrophic metanogenes
– CH3COOH → CH4 + CO2
• Methanosarcina, Methanosaeta
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
47
Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB)
Reaktor på bryggeri i Nicaragua
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
48
Sammanfattning
• De flesta mikroorganismer finns i många olika
avloppsrenings processer.
• Genom att styra processen kan vissa
mikroorganismer gynnas
–
–
–
–
–
Anaerobt, hög BOD: Metan producerande bakterier
Aerobt, låg BOD, NH4: Nitrifierare
Anoxiskt, NO3/NO2: Denitrifierare
Anaerobt, VFS/Aerobt: PAO
Hög slamålder: Nitrifierare, Microtrix
• Forskning pågår ständigt ⇒ Kunskap förnyas
2009-03-24
Mikroorganismer i avloppsrening
49
