Monitorering av
immunmodulerande behandling
med flödescytometri
Maria Hjorth & Charlotte Dahle
Klinisk immunologi & Transfusionsmedicin
Universitetssjukhuset Linköping
Region Östergötland
Immunmonitorering med flödescytometri
•
•
•
•
Autoimmuna sjukdomar
Immunbristutredning
HIV
Hematologpatienter /
stamcellstransplanterade
Region Östergötland
Totalt antal lymfocyter i blod
̴ x 109/L = 2.000.000.000/L
2
• T-celler
60-80 %
• B-celler
5-20 %
• NK-celler 5-20 %
Totalt ca 0,5 kg lymfocyter i kroppen
Region Östergötland
Monitorering vid immunmodulerande
behandling
• Allt fler prover från patienter med
immunmodulerande behandlingar
• Följa behandlingseffekt på cellulär nivå
• Ofta kraftig påverkan på en eller flera
lymfocytpopulationer
– Ökning / minskning av antal och andel.
• Utgångsprov innan behandling (”hade varit bra”)
Region Östergötland
Flödescytometri =
Vätska
Cell
Mätning
Fluorescerande antikroppar binder till
markörer på/i celler.
Fluorescensen som avges mäts när celler
passerar lasrar i ett vätskeflöde.
Region Östergötland
Flödescytometri
Analyserar tusentals celler per sekund
Region Östergötland
www.abcam.com
Granularitet
Flödescytometri
• Storlek
- FSC
• Granularitet - SSC
• Fluorescens
Storlek
Region Östergötland
Membranbundna receptorer (CD-markörer)
Cytoplasmatiska antigen
Nukleära antigen
Lymfocytprofil
CD3+ = T-cell
CD3+CD4+ = T-hjälparcell
CD3+CD8+ = Cytotoxisk T-cell
Lymfocyter som saknar
CD3:
CD19+ = B-cell
CD16+56+ = NK-cell
Region Östergötland
Immunmodulerande
behandling vid multipel skleros
Region Östergötland
Vad är MS?
• kronisk inflammatorisk sjukdom i CNS
• myelin och axon angrips av immunsystemet
• demyelinisering
• axonskada och nervcellsdöd
T-celler, B-celler, antikroppar, komplement, cytokiner,
kemokiner, toxiska metaboliter, oxidativ stress, neurotrofa
faktorer, hormoner etc
Region Östergötland
Fakta om Multipel skleros (MS)
•
•
•
•
•
•
Vanlig orsak till neurologiskt handikapp hos unga
Ca 10/100.000 diagnosticeras per år
1/500 har MS i Sverige
Kvinnor/män = 3/1
Insjuknande ålder 10-59 år (topp kring 30 år)
Flera bromsmediciner – alla påverkar
immunsystemet
Region Östergötland
Gilenya® Fingolimod
• Första tablettbehandlingen vid MS.
• Binder till S1P-receptorer.
• S1PR uttrycks i varierande nivåer på många olika celltyper.
• SIPR1 internaliseras och degraderas.
• Receptorn är nödvändig för att T- och
B-celler ska kunna ta sig ut från
lymfoida organ.
• Ffa CCR7+ celler som påverkas.
Effekt = kraftig lymfopeni
Region Östergötland
Bevan & Fink, Nature 2008
Före behandling
Efter 1 års behandling
L y m fo c y te r
p < 0 ,0 0 1
6000
a n ta l x 1 0
6
/L
5000
4000
3000
2000
1000
0
Region Östergötland
F ö re
E fte r
Fingolimods effekt på CD4+ och CD8+ T-celler
Efter
CD8
Före
CD4
C D 4 +Th-cell
CD4+
CD8+C DTc-cell
8+
p < 0 ,0 0 1
p < 0 ,0 0 1
2500
1400
1200
1000
6
1500
a n ta l x 1 0
a n ta l x 1 0
6
/L
/L
2000
1000
800
600
400
500
200
0
Region Östergötland F ö r e
0
E fte r
F ö re
E fte r
Fingolimods effekt på B- och NK-celler
C D 19+
C D 16+56+
p < 0 ,0 0 1
n .s
800
800
6
a n ta l x 1 0
a n ta l x 1 0
6
/L
1000
/L
1000
600
400
600
400
200
200
0
0
F ö re
Region Östergötland
E fte r
F ö re
E fte r
CD62L/CCR7
Differentiering av T-celler
Central Memory (CM)
Naive
Effector Memory (EM)
T effector memory
(TEMRA)
CD45RA
• Naiva och CM cirkulerar genom lymfoida
organ.
• EM och TEMRA vandrar till inflammatoriska
härdar.
Sallusto et al, 1999, Nature
Region Östergötland
Amyes et al, 2005, J Immunol
Fingolimods påverkan på fördelning av T-celler i blod
Före behandling
CD62L
Efter 1 års
behandling
Region Östergötland
CD45RA
Fingolimod Gilenya
• ”Skrämmande” låga antal T- och B-celler i
cirkulationen
• Finns i lymfkörtlar (antigen kommer dit)
• Risk för infektioner, dock ovanligt med
allvarliga
Region Östergötland
B-cellsdepletion vid reumatisk
sjukdom
Region Östergötland
Region Östergötland
Genetech Inc., Biogen Idec Inc.
Mabthera ® (Rituximab ): Anti-CD20
• Behandling av B-cellslymfom
o Effekt på antikroppsmedierade sjukdomar. Förbättring av
samtidig autoimmun sjukdom.
• Betydelse av B-celler vid T-cellsmedierad sjukdom
o Dämpar inflammation genom cytokinproduktion och
minskad antigen-presentation.
• Variation i respons på Rituximab-behandling
o Liten population kvarvarande B-celler efter Rituximab kan
ge fortsatta kliniska besvär. Nytta av ytterligare dos (Dass et
al., Arthritis & Rheumatism, 2008).
Region Östergötland
Region Östergötland
Genetech Inc., Biogen Idec Inc.
B-cellspanel med hög känslighet
•
Rituximab ger lågt antal B-celler (CD19+)
Konventionell analys visar vanligen avsaknad av
B-celler.
CD3
CD19
Eventuella kvarvarande celler kan detekteras
CD20
med flödescytometri med hög känslighet.
CD21
CD27
CD38
IgD
Region Östergötland
Dubbel volym blod + antikropp + insamling av allt
provmaterial, helst 50 000 – 100 000 lymfocyter.
Gatingstrategi - plasmablaster
Plasmablaster
1,5x106/L
0,5% av Bceller
Region Östergötland
Effekt av Rituximab
Plasmablaster
Obehandlad
11x106/L
4,6% av B-celler
Plasmablaster
Två doser;
fyra mån efter
senaste dosen
4,5x106/L
32% av B-celler
Plasmablaster
Fyra doser;
en vecka efter
senaste dosen
Region Östergötland
0,1x106/L
12% av B-celler
Konklusioner
• Immunmodulerande behandling allt
vanligare
• Ökande behov av immunmonitorering
• Utgångsprov före behandling
Region Östergötland
