Analyser för biologiska
läkemedel
Per Marits
Klinisk immunologi
Karolinska universitetslaboratoriet
Biologiska läkemedel
’Biological medicinal product’, ’biologicals’
Framställda genom biologiska processer; inte kemiskt syntetiserade
Några huvudgrupper:
1) Rekombinant framställda kopior av kroppsegna proteiner, t ex insulin,
tillväxthormon, interleukin-2…
2) Monoklonala antikroppar
3) Lösliga receptorer; fusionsproteiner
4) Vacciner
5) Genterapi
Immunogenicitet
Biologiskt
Läkemedel®
TH
Cytokiner
B
HLA II
B
Y
Y
Antigen-presentation
för CD4+ T
hjälparceller
CD40CD40L
Antikroppar
mot
läkemedlet
Potentiella konsekvenser för patienten
Utebliven behandlingseffekt
Infusionsreaktioner
Autoimmunitet
Vad vill vi mäta?
Vad kan vi mäta?
Vad bör vi mäta?
Drug target
Läkemedelskoncentration
Antikroppsbildning mot läkemedlet
Anti-TNF läkemedel
Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.
TNF biologi
Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.
Verkningsmekanismer
Neutraliserar löslig TNF
•
Inflammationsdämpande
Binder membranbundet TNF
•
Blockering / reverse signaling
•
apoptosinduktion
Interagerar med Fc receptorer
•
ADCC
•
Immunreglering
Relevanta skillnader föreligger mellan preparaten med avseende på
aviditet, farmakodynamik och -kinetik
Farmakokinetik
Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.
Serumnivåer av TNF vid behandling med
infliximab
Charles et al. J Immunol 1999; 163:1521-1528
Total vs fritt läkemedel
mAb + L ↔ [mAb*L]
Koncentrationsbestämning av Infliximab
Detektions antikropp
ALP-anti-human IgFc
Αnti-human IgG
Infliximab
Patientserum
TNFα
Koncentrationen av fritt TNF-bindande läkemedel korrelerar med
behandlingsresultaten
Dalvärden av Infliximab hos
underhållsbehandlade IBD-patienter
Immunogenicitet mot anti-TNF läkemedel
Frekvens antikroppsbildare varierar kraftigt
mellan olika studier – för infliximab 10-60%!
I de flesta har punktprevalensen immuniserade
patienter angivits
Infliximab > Adalimumab >> Etanercept
Faktorer som påverkar immunogeniciteten
av proteinläkemedel
Läkemedlet
Patienten
Kroppseget / främmande
Grundsjukdom
Substitutionsbehandling?
Annan medicinering?
Framställningsmetod
Immunstatus
Beredning
Hantering
Administrationssätt (i.v. / s.c.)
Doseringsschema
T-cellsepitoper
HLA-presentation
Immunogenicitet mot
terapeutiska antikroppar
Antikroppar mot murina sekvenser
Antikroppar mot glykosylerade epitoper
Allotyp-specifika antikroppar
Anti-idiotypa antikroppar
Lite terminologi
ATI – Antibodies To Infliximab
AAA – Antibodies Against Adalimumab
HACA – Human Anti-Chimeric Antibodies
ADA – Anti-Drug Antibodies
Att detektera antikroppsbildning mot
terapeutiska antikroppar
De flesta terapeutiska antikroppar är humana IgGantikroppar med lätta kedjor av kappa (κ) typ.
Kliniskt relevanta antikroppar mot läkemedel av denna
typ är också humana IgG-ak
Analysen kan störas av:
1. Läkemedel använd som antigen i mätmetoden
2. Läkemedel som är kvar i cirkulationen
Totalt vs fritt läkemedel igen
mAb + L ↔ [mAb*L]
mAb + ADA ↔ [mAb*ADA]
Hur man kan skilja antigen från antikropp när
båda är humant IgG?
ELISA
Anti-λ light chain antikropp som
sekundärreagens
Konvertera läkemedlet till F(ab)2 fragment
Enzym-märkt läkemedel som sekundärreagens
Radioimmunoassay (RIA)
Läkemedel som F(ab)2 används som
sekundärreagens
Bridging ELISA – den vanligaste metoden
för ADA mot terapeutiska
antikroppsläkemedel
ALP-Infliximab
YYYYY
Infliximab
Patientserum
med antiInfliximab ak
Felkällor vid ADA-analys med Bridging ELISA
ALP-Infliximab
Y YY Y Y
Patientserum med
anti-Infliximab ak
Falskt negativ: Drogen blockar (bilden)
Detekterar inte monovalenta IgG4-antikroppar
Falskt positiv: Reumatoid Faktor (RF) som
korsbinder inflixmab i frånvaro av ADA
Bestämning av anti-Infliximab antikroppar vid
Karolinska universitetslaboratoriet
Inhibitions-ELISA
TNFα
ALPInfliximab
Bestämning av anti-Infliximab antikroppar vid
Karolinska universitetslaboratoriet
Inhibitions-ELISA
ALP-Infliximab
Patientserum med
anti-Infliximab ak
TNFα
Felkällor för inhibitions ELISA
Bindning av ALP-Infliximab blockeras av LM
som finns kvar i patientens blod.
ALP-Infliximab
Patientserum
med antiInfliximab ak
TNFα
Y Y Y
Falskt positivt resultat
RF interfererar inte med analysen
RIA
ADA
I125 IFX-F(ab’)2
Protein A
Potentiella fördelar:
Märkt läkemedlet i löslig fas ≈ in vivo
Troligen mindre känslig för kvarvarande läkemedel
Nackdel: Radioaktivitet
Cell-baserade metoder för ADA
Definitionen av neutraliserande ADA = antikroppar som blockerar
effekten av läkemedlet i ett cellulärt system (farmakodynamisk
påverkan)
Cellulära metoder krävs av läkemedelsindustrin vid validering och
godkännande av nya biologiska preparat
Dyrare och mer arbetsintensiva än ELISA och RIA-metoder
Kräver vana att hantera cellinjer
Cell-baserade metoder för ADA
Cellulär read-out för anti-TNFInfliximab
ADA
TNF-R1
läkemedel = bortfall av TNFmedierad effekt, t ex minskad
TNF-inducerad apoptos
iLite™ : cellinje som uttrycker
Luciferase vid TNF-signalering
Aktivering
av NFkB
Kvarvarande läkemedel
interfererar med detektion av
ADA
DNA
NFkB
response
element
Luciferas
Tillsats av substrat och
detektion av luminiscens
Cell-baserade metoder för klinisk
rutindiagnostik?
Kan ev. tillföra information, förutsatt att vald read-out är
biologiskt och kliniskt relevant
En cell-baserad assay täcker sällan alla potentiella
verkningsmekanismer för ett läkemedel
Bindande (icke-neutraliserande) ADA kan också påverka
behandlingsresultatet genom att förändra farmakokinetiken
(ökad clearance)
Är olika metoder jämförbara?
Metoder för koncentrationsbestämning av anti-TNFs
uppvisar generellt god linjär korrelation
Vid en publicerad blindad jämförelse av assays för ATI var RIA
(Sanquin) marginellt känsligare än bridging-ELISA (Leuwen)
men överensstämde kvalitativt väl (Vande Casteele, Aliment
Pharmacol Ther 2012).
ELISA-metoderna för LM-konc och ADA som används på
Karolinska är validerade mot analyserna i Sanquin och Leuwen
Jämförelse med en cell-baserad metod pågår…
Drug tolerant assays
Drug tolerant assays
Påvisa ADA som är bundet till läkemedlet
Dissociera immunkomplex t ex med lååång
inkubationstid eller syrabehandling och sedan
förhindra reassociation innan detektion av ADA
Kan potentiellt hitta ADA tidigare och möjliggöra
åtgärder för att förebygga terapisvikt
Komplexa metoder
Relevanta för kliniskt bruk?
Drug tolerant assays
Bloem et al (2014) jämförde”vanlig” RIA för antiadalimumab ak med fyra läkemedels-toleranta versioner i
en kohort av RA-patienter
Den vanliga RIA:n hittade ADA hos 14 av 94 pat (15%) jfr
med 48-54 pat (51-57%) med de toleranta analyserna
Prover som innehöll högre nivåer av ADA med de drogtoleranta metoderna uppvisade lägre adalimumab-nivåer
Inga kliniska data för patienterna
Temporal evolution of ADA
De flesta studier av ADA rapporterar punkt-prevalens
Ungar et al analyserade s-infliximab och ADA med en drug tolerant
assay i >1000 sera från 125 patienter under 2009-2012
De flesta patienter som utvecklade persisterande ADA gjorde det
under behandlingens första 12 mån.
ADA-positivitet föregick klinisk loss-of-respons
26% av patienterna vid uppvisade övergående ADA-positivitet i
isolerade prov, vilket inte verkade påverka behandlingseffekten
Mindre än hälften av patienterna var ADA-negativa efter 4 års,
trots kontinuerlig behandling
Ungar et al. Gut 2014;63:1258-64
Praktisk monitorering av biologiska LM
Börja med läkemedelskoncentrationen (dalvärden)
Vid omätbara nivåer av läkemedlet – komplettera med analys av
ADA (om det inte utförts per automatik)
Persisterande vs temporära ADA?
Upprepad provtagning vid osäkerhet
Utvärdera behandlingsjustering med intensifierad monitorering
Ring gärna lab för diskussion!
Aktuellt analysutbud för biologiska läkemedel vid
Karolinska universitetslaboratoriet
(Klinisk immunologi, Solna)
Läkemedel
Infliximab
Koncentration
JA
ADA
JA
Adalimumab
JA
JA
Rituximab
Etanercept
Goliumumab
JA
Under utveckling
Under utveckling
NEJ
-
Vedolizumab
Ustekinumab
Under utveckling
Under utveckling
-
(inklusive biosimilarer)
Tack till:
Klinisk immunologi, Solna
• Ulf Sundin
• Ann-Charlotte Wikström
• Lena A. Nilsson
• Kerstin Lavenius
• Ann-Britt Johansson
Gastrocentrum, Medicin
• Michael Eberhardson
Frågor o/e synpunkter?
[email protected]
