Analyser för biologiska läkemedel

Analyser av biologiska läkemedel
(med fokus på anti-TNF antikroppar)
Per Marits
ST-kurs i Allergi och Autoimmunitet
5:e oktober 2016
Biologiska läkemedel
’Biological medicinal product’, ’biologicals’
Framställda genom biologiska processer; inte kemiskt syntetiserade
 Några huvudgrupper:
1) Rekombinant framställda kopior av kroppsegna proteiner, t ex
insulin, tillväxthormon, interleukin-2…
2) Monoklonala antikroppar
3) Lösliga receptorer; fusionsproteiner
4) Vacciner
5) Genterapi
Immunogenicitet
Biologiskt
Läkemedel®
TH
Cytokiner
B
HLA II
B
Y
Y
Antigen-presentation
för CD4+ T hjälparceller
CD40-CD40L
Antikroppar
mot
läkemedlet
Potentiella konsekvenser för patienten
Utebliven behandlingseffekt
Infusionsreaktioner
Autoimmunitet
Drug target
Läkemedelskoncentration
Antikroppsbildning mot läkemedlet
Anti-TNF läkemedel
Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.
TNF biologi
Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.
Verkningsmekanismer
• Neutraliserar löslig TNF
– inflammationsdämpande
• Binder membranbundet TNF
– Blockering / reverse signaling
– apoptosinduktion
• Interaktion med Fc receptorer
– ADCC
– Immunreglering
Relevanta skillnader föreligger mellan preparaten med avseende på
aviditet, farmakodynamik och -kinetik
Farmakokinetik
Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.
Total vs fritt läkemedel
mAb + L ↔ [mAb*L]
Serumnivåer av TNF vid behandling
med infliximab
Koncentrationsbestämning av Infliximab
Detektions antikropp
ALP-anti-human IgFc
Αnti-human IgG
Infliximab
Patientserum
TNFα
Koncentrationen av fritt TNF-bindande läkemedel korrelerar med behandlingsresultaten
Dalvärden av Infliximab
underhållsbehandlade IBD-patienter
Immunogenicitet mot anti-TNF
läkemedel
 Frekvens antikroppsbildare varierar kraftigt mellan
olika studier – för infliximab 10-60%!
 I de flesta har punktprevalensen immuniserade
patienter angivits
 Infliximab > Adalimumab >> Etanercept
Faktorer som påverkar immunogeniciteten av
proteinläkemedel
Läkemedlet
Kroppseget / främmande
Patienten
Grundsjukdom
Substitutionsbehandling?
Annan medicinering?
Framställningsmetod
Immunstatus
Beredning
Hantering
Administrationssätt (i.v. / s.c.)
Doseringsschema
T-cellsepitoper
HLA-presentation
Förvirrande terminologi
• ATI – Antibodies To Infliximab
• AAA – Antibodies Against Adalimumab
• HACA – Human Anti-Chimeric Antibodies
• ADA – Anti-Drug Antibodies
Immunogenicitet mot
terapeutiska antikroppar
Antikroppar mot murina sekvenser
Antikroppar mot glykosylerade epitoper
Allotyp-specifika antikroppar
Anti-idiotypa antikroppar
Neutraliserande eller icke-neutraliserande (nADA vs bADA)
Att detektera antikroppsbildning mot
terapeutiska antikroppar
• De flesta terapeutiska antikroppar är humana IgGantikroppar med lätta kedjor av kappa (κ) typ.
• Kliniskt relevanta antikroppar mot läkemedel av denna typ
är också humana IgG-ak
• Analysen kan störas av:
1. Läkemedel använd som antigen i mätmetoden
2. Läkemedel som är kvar i cirkulationen
Total vs fritt läkemedel igen
mAb + L ↔ [mAb*L]
mAb + ADA ↔ [mAb*ADA]
Hur man kan skilja antigen från
antikropp när båda är humant IgG
• ELISA
 Anti-λ light chain antikropp som sekundärreagens
 Konvertera läkemedlet till F(ab)2 fragment
 Enzym-märkt läkemedel som sekundärreagens
(bridging-ELISA)
• Radioimmunoassay (RIA)
 Läkemedel som F(ab)2 använd som sekundärreagens
(Antigen Binding Assay, ABA)
Bridging ELISA – den vanligaste metoden för
ADA mot terapeutiska antikroppsläkemedel
ALP-Infliximab
Y Y Y Y Y Infliximab
Patientserum med
anti-Infliximab ak
Felkällor vid ADA-analys med Bridging ELISA
Y
Y YY Y Y
ALP-Infliximab
Patientserum med
anti-Infliximab ak
Falskt negativ: Läkemedlet blockerar (bilden)
Falskt positiv: Reumatoid Faktor (RF) som korsbinder
inflixmab i frånvaro av ADA
Bestämning av anti-Infliximab antikroppar vid
Karolinska universitetslaboratoriet
Inhibitions-ELISA
ALP-Infliximab
TNFα
Bestämning av anti-Infliximab antikroppar vid
Karolinska universitetslaboratoriet
Inhibitions-ELISA
ALP-Infliximab
Patientserum med
anti-Infliximab ak
TNFα
Felkällor för inhibitions ELISA
• Bindning av ALP-Infliximab blockeras av LM som
finns kvar i patientens blod.
ALP-Infliximab
Patientserum med
anti-Infliximab ak
TNFα
Y Y Y
• Ger falskt positivt resultat
• RF interfererar inte med analysen
Cell-baserade metoder för ADA
(Bioassays)
• Definitionen av neutraliserande ADA (nADA) = antikroppar som
blockerar effekten av läkemedlet i ett cellulärt system
(farmakodynamisk påverkan)
• Cellulära assays är obligata för läkemedelsindustrin vid validering och
godkännande av nya biologiska preparat
• Dyrare och mer arbetsintensiva än ELISA och RIA-metoder, som påvisar
bindande ADA (bADA) – både neutraliserande och icke-neutraliserande.
• Kräver vana att hantera cellinjer
Cell-baserade metoder för ADA
Cellulär read-out för anti-TNFInfliximab
ADA
TNF-R1
läkemedel = bortfall av TNF-
medierad effekt, t ex minskad TNFinducerad apoptos
iLite™ : cellinje som uttrycker
Luciferase vid TNF-signalering
Aktivering
av NFkB
Kvarvarande läkemedel
interfererar även här
DNA
NFkB
response
element
Luciferas
Tillsats av substrat och
detektion av luminiscens
Cell-baserade metoder för klinisk
rutindiagnostik?
• Kan tillföra information, förutsatt att vald read-out är biologiskt
och kliniskt relevant.
• En cell-baserad assay täcker sällan alla potentiella
verkningsmekanismer för ett läkemedel
• Icke-neutraliserande ADA kan i vissa fall också påverka
behandlingsresultatet genom att förändra farmakokinetiken
(ökad clearance). Beror på läkemedlet och dess farmakokinetik
och -dynamik.
Jämförande studie av patienter med RA
• Läkemedelsnivåer (anti-TNF) med ELISA och iLite
• Binding ADA (bADA) med ELISA
• Neutraliserade ADA (nADA) med iLite
Läkemedelskoncentration
med ELISA vs iLITE
infliximab n=62
adalimumab n=22
iLite
ELISA
low
low
> 0.2 µg/ml
17
0
17
iLite
ELISA
> 0.4 µg/ml
0
45
45
low
17
45
62
low
> 0.2 µg/ml
Bra överensstämmelse!
9
0
9
> 0.4 µg/ml
0
13
13
9
13
22
Läkemedelsnivå och ADA med ELISA
infliximab
adalimumab
ADA
ELISA
ADA+
drug level
low
> 0.2 µg/ml
17
0
17
ADA
ELISA
ADA0
45
45
ADA+
17
45
62
drug level
low
> 0.2 µg/ml
3
0
3
ADA6
13
19
9
13
22
I sex (6) prover uppmättes låga läkemedelsnivåer men inga ADA.
Ökad clearance av annan orsak än immunogenicitet.
Jämförelse av bADA med ELISA vs
nADA med iLite
infliximab n=46
adalimumab n=22
iLite
ELISA
nADA+
bADA+
bADA-
7
0
7
iLite
ELISA
nADA10
29
39
nADA+
17
29
46
10 prover är bADA+ men nADA-
bADA+
bADA-
3
0
3
nADA0
19
19
3
19
22
bADA-negativa prover är
även negativa för nADA!
Läkemedelsnivåer, bADA och nADA
ELISA
Bioassay (iLite)
ELISA (BAb)+ / iLite (NAb) +
<0.2 µg/mL
<0.65 µg/mL
ELISA (BAb)+ / iLite (NAb) -
<0.2 µg/mL
<0.65 µg/mL
ELISA (BAb) - / iLite (NAb) -
0.4 – 11 µg/mL
0.6 – 2.3 µg/mL
Tidsfråga: bADA på väg att bli nADA?
Spelar det någon roll?
Drug tolerant assays
• Påvisar ADA som är bundet till läkemedlet
• Dissociera immunkomplex t ex med lååång
inkubationstid eller syrabehandling och sedan
förhindra reassociation innan analys av ADA
• Komplexa metoder
• Relevanta för kliniskt bruk?
Immunkomplex kan påvisas tidigare
än fria ADA
van Schouwenburg Ann Rheum Dis 2013;72:1680–1686
Temporal evolution of ADA
• De flesta studier av ADA rapporterar punkt-prevalens
• Ungar et al analyserade s-infliximab och ADA med en drug tolerant
assay i >1000 sera från 125 patienter under 2009-2012
• De flesta patienter som utvecklade persisterande ADA gjorde det
under behandlingens första 12 mån.
• ADA-positivitet föregick klinisk loss-of-respons
• 26% av patienterna vid uppvisade övergående ADA-positivitet i
isolerade prov, vilket inte verkade påverka behandlingseffekten
• Mindre än hälften av patienterna var ADA-negativa efter 4 år, trots
kontinuerlig behandling
Ungar et al. Gut 2014;63:1258-64
Monitorering av biologiska läkemedel i praktiken
 Börja med läkemedelskoncentrationen (dalvärde)
 Vid omätbara nivåer av läkemedlet – komplettera med analys
av ADA (om det inte utförts med automatik)
 Stämmer analysresultatet med den kliniska bilden?
 Persisterande vs temporära ADA? => Upprepad provtagning
 Utvärdera behandlingsjustering med intensifierad
monitorering
Aktuellt analysutbud för biologiska läkemedel vid Karolinska
universitetslaboratoriet (Klinisk immunologi, Solna)
Läkemedel
Koncentration
ADA
Infliximab
JA
JA
JA
JA
JA
JA
Under utveckling
Some day maybe
JA
NEJ
NEJ (inte än iallafall)
NEJ (inte än iallafall)
-
(inklusive biosimilarer)
Adalimumab
Rituximab
Vedolizumab
Ustekinumab
Etanercept
Goliumumab
Tack till:
Klinisk immunologi, Solna:
• Ulf Sundin
• Theresa Neimert-Andersson
• Ann-Charlotte Wikström
• Lena A. Nilsson
• Kerstin Lavenius, mfl…
Gastrocentrum, Karolinska: Michael Eberhardson
CMM, Karolinska institutet: Anna Fogdell-Hahn
Reumatologkliniken, Karolinska: Saedis Saevarsdottir
Frågor o/e synpunkter?