Analyser av biologiska läkemedel (med fokus på anti-TNF antikroppar) Per Marits ST-kurs i Allergi och Autoimmunitet 5:e oktober 2016 Biologiska läkemedel ’Biological medicinal product’, ’biologicals’ Framställda genom biologiska processer; inte kemiskt syntetiserade Några huvudgrupper: 1) Rekombinant framställda kopior av kroppsegna proteiner, t ex insulin, tillväxthormon, interleukin-2… 2) Monoklonala antikroppar 3) Lösliga receptorer; fusionsproteiner 4) Vacciner 5) Genterapi Immunogenicitet Biologiskt Läkemedel® TH Cytokiner B HLA II B Y Y Antigen-presentation för CD4+ T hjälparceller CD40-CD40L Antikroppar mot läkemedlet Potentiella konsekvenser för patienten Utebliven behandlingseffekt Infusionsreaktioner Autoimmunitet Drug target Läkemedelskoncentration Antikroppsbildning mot läkemedlet Anti-TNF läkemedel Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap. TNF biologi Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap. Verkningsmekanismer • Neutraliserar löslig TNF – inflammationsdämpande • Binder membranbundet TNF – Blockering / reverse signaling – apoptosinduktion • Interaktion med Fc receptorer – ADCC – Immunreglering Relevanta skillnader föreligger mellan preparaten med avseende på aviditet, farmakodynamik och -kinetik Farmakokinetik Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap. Total vs fritt läkemedel mAb + L ↔ [mAb*L] Serumnivåer av TNF vid behandling med infliximab Koncentrationsbestämning av Infliximab Detektions antikropp ALP-anti-human IgFc Αnti-human IgG Infliximab Patientserum TNFα Koncentrationen av fritt TNF-bindande läkemedel korrelerar med behandlingsresultaten Dalvärden av Infliximab underhållsbehandlade IBD-patienter Immunogenicitet mot anti-TNF läkemedel Frekvens antikroppsbildare varierar kraftigt mellan olika studier – för infliximab 10-60%! I de flesta har punktprevalensen immuniserade patienter angivits Infliximab > Adalimumab >> Etanercept Faktorer som påverkar immunogeniciteten av proteinläkemedel Läkemedlet Kroppseget / främmande Patienten Grundsjukdom Substitutionsbehandling? Annan medicinering? Framställningsmetod Immunstatus Beredning Hantering Administrationssätt (i.v. / s.c.) Doseringsschema T-cellsepitoper HLA-presentation Förvirrande terminologi • ATI – Antibodies To Infliximab • AAA – Antibodies Against Adalimumab • HACA – Human Anti-Chimeric Antibodies • ADA – Anti-Drug Antibodies Immunogenicitet mot terapeutiska antikroppar Antikroppar mot murina sekvenser Antikroppar mot glykosylerade epitoper Allotyp-specifika antikroppar Anti-idiotypa antikroppar Neutraliserande eller icke-neutraliserande (nADA vs bADA) Att detektera antikroppsbildning mot terapeutiska antikroppar • De flesta terapeutiska antikroppar är humana IgGantikroppar med lätta kedjor av kappa (κ) typ. • Kliniskt relevanta antikroppar mot läkemedel av denna typ är också humana IgG-ak • Analysen kan störas av: 1. Läkemedel använd som antigen i mätmetoden 2. Läkemedel som är kvar i cirkulationen Total vs fritt läkemedel igen mAb + L ↔ [mAb*L] mAb + ADA ↔ [mAb*ADA] Hur man kan skilja antigen från antikropp när båda är humant IgG • ELISA Anti-λ light chain antikropp som sekundärreagens Konvertera läkemedlet till F(ab)2 fragment Enzym-märkt läkemedel som sekundärreagens (bridging-ELISA) • Radioimmunoassay (RIA) Läkemedel som F(ab)2 använd som sekundärreagens (Antigen Binding Assay, ABA) Bridging ELISA – den vanligaste metoden för ADA mot terapeutiska antikroppsläkemedel ALP-Infliximab Y Y Y Y Y Infliximab Patientserum med anti-Infliximab ak Felkällor vid ADA-analys med Bridging ELISA Y Y YY Y Y ALP-Infliximab Patientserum med anti-Infliximab ak Falskt negativ: Läkemedlet blockerar (bilden) Falskt positiv: Reumatoid Faktor (RF) som korsbinder inflixmab i frånvaro av ADA Bestämning av anti-Infliximab antikroppar vid Karolinska universitetslaboratoriet Inhibitions-ELISA ALP-Infliximab TNFα Bestämning av anti-Infliximab antikroppar vid Karolinska universitetslaboratoriet Inhibitions-ELISA ALP-Infliximab Patientserum med anti-Infliximab ak TNFα Felkällor för inhibitions ELISA • Bindning av ALP-Infliximab blockeras av LM som finns kvar i patientens blod. ALP-Infliximab Patientserum med anti-Infliximab ak TNFα Y Y Y • Ger falskt positivt resultat • RF interfererar inte med analysen Cell-baserade metoder för ADA (Bioassays) • Definitionen av neutraliserande ADA (nADA) = antikroppar som blockerar effekten av läkemedlet i ett cellulärt system (farmakodynamisk påverkan) • Cellulära assays är obligata för läkemedelsindustrin vid validering och godkännande av nya biologiska preparat • Dyrare och mer arbetsintensiva än ELISA och RIA-metoder, som påvisar bindande ADA (bADA) – både neutraliserande och icke-neutraliserande. • Kräver vana att hantera cellinjer Cell-baserade metoder för ADA Cellulär read-out för anti-TNFInfliximab ADA TNF-R1 läkemedel = bortfall av TNF- medierad effekt, t ex minskad TNFinducerad apoptos iLite™ : cellinje som uttrycker Luciferase vid TNF-signalering Aktivering av NFkB Kvarvarande läkemedel interfererar även här DNA NFkB response element Luciferas Tillsats av substrat och detektion av luminiscens Cell-baserade metoder för klinisk rutindiagnostik? • Kan tillföra information, förutsatt att vald read-out är biologiskt och kliniskt relevant. • En cell-baserad assay täcker sällan alla potentiella verkningsmekanismer för ett läkemedel • Icke-neutraliserande ADA kan i vissa fall också påverka behandlingsresultatet genom att förändra farmakokinetiken (ökad clearance). Beror på läkemedlet och dess farmakokinetik och -dynamik. Jämförande studie av patienter med RA • Läkemedelsnivåer (anti-TNF) med ELISA och iLite • Binding ADA (bADA) med ELISA • Neutraliserade ADA (nADA) med iLite Läkemedelskoncentration med ELISA vs iLITE infliximab n=62 adalimumab n=22 iLite ELISA low low > 0.2 µg/ml 17 0 17 iLite ELISA > 0.4 µg/ml 0 45 45 low 17 45 62 low > 0.2 µg/ml Bra överensstämmelse! 9 0 9 > 0.4 µg/ml 0 13 13 9 13 22 Läkemedelsnivå och ADA med ELISA infliximab adalimumab ADA ELISA ADA+ drug level low > 0.2 µg/ml 17 0 17 ADA ELISA ADA0 45 45 ADA+ 17 45 62 drug level low > 0.2 µg/ml 3 0 3 ADA6 13 19 9 13 22 I sex (6) prover uppmättes låga läkemedelsnivåer men inga ADA. Ökad clearance av annan orsak än immunogenicitet. Jämförelse av bADA med ELISA vs nADA med iLite infliximab n=46 adalimumab n=22 iLite ELISA nADA+ bADA+ bADA- 7 0 7 iLite ELISA nADA10 29 39 nADA+ 17 29 46 10 prover är bADA+ men nADA- bADA+ bADA- 3 0 3 nADA0 19 19 3 19 22 bADA-negativa prover är även negativa för nADA! Läkemedelsnivåer, bADA och nADA ELISA Bioassay (iLite) ELISA (BAb)+ / iLite (NAb) + <0.2 µg/mL <0.65 µg/mL ELISA (BAb)+ / iLite (NAb) - <0.2 µg/mL <0.65 µg/mL ELISA (BAb) - / iLite (NAb) - 0.4 – 11 µg/mL 0.6 – 2.3 µg/mL Tidsfråga: bADA på väg att bli nADA? Spelar det någon roll? Drug tolerant assays • Påvisar ADA som är bundet till läkemedlet • Dissociera immunkomplex t ex med lååång inkubationstid eller syrabehandling och sedan förhindra reassociation innan analys av ADA • Komplexa metoder • Relevanta för kliniskt bruk? Immunkomplex kan påvisas tidigare än fria ADA van Schouwenburg Ann Rheum Dis 2013;72:1680–1686 Temporal evolution of ADA • De flesta studier av ADA rapporterar punkt-prevalens • Ungar et al analyserade s-infliximab och ADA med en drug tolerant assay i >1000 sera från 125 patienter under 2009-2012 • De flesta patienter som utvecklade persisterande ADA gjorde det under behandlingens första 12 mån. • ADA-positivitet föregick klinisk loss-of-respons • 26% av patienterna vid uppvisade övergående ADA-positivitet i isolerade prov, vilket inte verkade påverka behandlingseffekten • Mindre än hälften av patienterna var ADA-negativa efter 4 år, trots kontinuerlig behandling Ungar et al. Gut 2014;63:1258-64 Monitorering av biologiska läkemedel i praktiken Börja med läkemedelskoncentrationen (dalvärde) Vid omätbara nivåer av läkemedlet – komplettera med analys av ADA (om det inte utförts med automatik) Stämmer analysresultatet med den kliniska bilden? Persisterande vs temporära ADA? => Upprepad provtagning Utvärdera behandlingsjustering med intensifierad monitorering Aktuellt analysutbud för biologiska läkemedel vid Karolinska universitetslaboratoriet (Klinisk immunologi, Solna) Läkemedel Koncentration ADA Infliximab JA JA JA JA JA JA Under utveckling Some day maybe JA NEJ NEJ (inte än iallafall) NEJ (inte än iallafall) - (inklusive biosimilarer) Adalimumab Rituximab Vedolizumab Ustekinumab Etanercept Goliumumab Tack till: Klinisk immunologi, Solna: • Ulf Sundin • Theresa Neimert-Andersson • Ann-Charlotte Wikström • Lena A. Nilsson • Kerstin Lavenius, mfl… Gastrocentrum, Karolinska: Michael Eberhardson CMM, Karolinska institutet: Anna Fogdell-Hahn Reumatologkliniken, Karolinska: Saedis Saevarsdottir Frågor o/e synpunkter?