Immunokemiska tekniker

advertisement
Immunteknologi,
en introduktion
Hur man använder antikroppar för
att mäta eller detektera biologiska
händelser.
Antikroppar genereras av b-lymphocyter, som är en del av de vita
blodkropparna
Varje ursprunglig b-lymphocyt genererar en unik antikropp
enligt ett intrikat genkombinatoriskt system
http://nobelprize.org/medicine/laureates/1987/tonegawa-lecture.pdf
Antikroppens uppbyggnad
Antikroppen är en
dynamisk enhet
http://www.path.cam.ac.uk/~mr
c7/mikeimages.html
Primärsvar:
vissa b-celler
genererar
antikroppssvar,
andra
hypermuterar
till nya
minnesceller
med starkare
affinitet mot
antigenet.
Antikropp
(g ml-1
serum)
Ett antigen är en substans som ger upphov
till ett immunsvar, då den uppfattas av
kroppen som ’icke-egen’.
Hur får vi tillgång till antikroppar?
• Skapa en antikroppsreaktion hos en
vertebrat, t ex kanin
• Rena upp antikropparna (affikolonn för
Fc) eller använd serum direkt
• Polyklonalt antikroppssvar fås!
eller
• Generera monoklonala antikroppar via
hybridomteknologi
eller
• Köp kommersiellt tillgängliga antikroppar
Generering av polyklonala antikroppar
– ’antiserum’
• För att ett protein skall vara antigent i en
främmande species måste sekvensen vara
olik
• Peptider och små molekyler < 2 kDa ger
inget eller mycket litet immunsvar
• Småmolekyler måste kopplas upp mot ett
bärarprotein för att ge immunrespons –
haptener
• Ytterligare ’boosting’ av immunsvaret ges
genom att lösa antigenet i en sk adjuvant
Generering av polyklonala
antikroppar
Nackdel/fördel med polyklonalt antiserum:
• Olika antikroppar i polyklonalt serum känner
igen varsina specifika epitoper hos antigenet
• … alltså känns större delen av antigenet igen…
• … vilket ger stark respons
• … men kan vara en analytisk nackdel…
• …och kan göra det svårt att korrelera med
medicinska data då man inte kan selektera för
antikroppar mot den epitop som genererar
autoimmunsvar.
Hur lösa detta???
Monoklonala antikroppar kan produceras i hybridom-celler
Monoklonala antikroppar kan produceras i hybridom-celler
Analytiska fördelar med antikroppar
•
•
•
•
Hög specificitet
Hög affinitet
Hög biologisk kompatibilitet
Kombination med cellbiologiska tekniker
Analytiska nackdelar
• Antikroppen ofta känslig för ofysiologiska
förhållanden
• Svårt att fysikaliskt kvantifiera analyserna
Tekniker
•
•
•
•
Immunoprecipitation
Märkning av antikroppar
Direkt och indirekt detektion
Immunometriska assays (konc och specificitet
av Ab)
• Immunbindnings-assays (konc av antigen,
bindningsanalys: ELISA etc)
• Immunoblotting
• Immunologisk infärgning
Immunoprecipitation
Genom att hitta ekvivalenta koncentrationer av Ab
och Ag kan man snabbt se specificitet och få ett hum
om koncentration av Ag och/eller Ab.
Fällningsanalys i agarosgeler – finns det en reaktion?
(används t ex för allergitester)
Märkning av antikroppar
• Fluoroforer: fluorescein, Rhodamin,
Physoerytrin m fl
• Radioisotoper: 125I
• Elektrontäta atomer: guld, järn
• Enzymer: b-galaktosidas,
glukosoxidas m fl. Omvandlar substrat
till annan färg (UV)
- Amplifiering av signal
Direkt och indirekt detektion
ELISA
ELISA för HIVanalys
Positive
Control
1.689
Negative
Control
Patient A
Patient B
Patient C
0.153
O.055
0.412
1.999
Assay
Control
0.123
Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical
density at 450nm. The cutoff value indicating a positive result is 0.500. Optical
densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values
below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be
retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive,
the patient will then be retested by western blotting analysis.
Fördelar
•
•
•
•
Experimentet enkelt att utföra
Resultatet enkelt att avläsa
Billigt
Kan enkelt göras i stor analysskala
Nackdelar
• Resultatet inte alltid enkelt att tolka
• Sidoreaktioner / korsreaktioner
• Epitopdefinition krävs för molekylär analys
Identifiering av proteiner från
komplicerade geler
Detektion av GroEl-proteiner i E. coli
Blot – att överföra proteiner från en gel
till membran för senare antikroppsanalys
Identifiering av virusprotein hos lax
Flera olika antikroppar kan användas vid
analysen samtidigt eller sekventiellt
(efter att föregående Ab tvättats bort)
Tillämpningsområden
• Identifiering, karakterisering och klassificering
– Patienttillstånd
– proteinidentitet
• Lokalisering i vävnader
– funktionsanalys
• Proteinrening/analys
• Gelshift (EMSA)
– Ändra molekylens vikt i en gelassay ger identifiering
• Antikroppen som handtag:
– cellulär analys (FACS), immunofluorescens/FRET,
– drug delivery, målsökande targetting (Affibody)
• Immunoprecipitering
– Hitta / fånga protein eller ligand
Immunotyping av prostatacancer genom infärgning med
specifika antikroppar
A panel of commercially available, well-characterized antibodies to cell
surface molecules can be used to identify cancers with distinct clinical
behaviors. Liu et al., American Journal of Pathology. 2004;165:1543-1556
Download
Random flashcards
Ölplugg

1 Cards oauth2_google_ed8be09c-94f0-4e6a-8e55-87a3b14a45db

Multiplacation table

156 Cards Антон piter

Fysik

46 Cards oauth2_google_97f6fa87-d6cd-4ae9-bcbf-0f9c2bb34c13

Create flashcards