Kloningsverktyg och kloning
Dagens föreläsning:
• Definition kloning (repetition)
• Grundläggande begrepp (repetition)
• Kloningsverktyg
vektorer
enzymer
• Ett kloningsexperiment från start till mål
Kapitel 5 Lodish, Molecular Cell Biology 7th ed, 2013.
Henrik Ring, 2014
Kloning
Amplifiering (kopiering) av ett specifikt DNA fragment till flera identiska
kopior av fragmentet.
DNA insatt i vektor amplifieras i bakterier. Bakterierna stryks ut på en platta
och en bakterie ger upphov till en koloni som består av miljontals kloner av
sig själv.
Till skillnad från PCR används bakterier och inte en maskin för
amplifieringen.
Fördelen mot PCR är att man får ut fler kopior, man kan amplifiera längre
fragment och att risken för mutationer minskar tack vare värdcellens proof
reading maskineri. Nackdelen är att man inte kan amplifiera specifika DNA
fragment direkt p.g.a. frånvaro av specifika primers.
Grundläggande begrepp
Rekombinant DNA: sammansatt från olika källor
PlasmidDNA: extrakromosomalt bakteriellt cirkulärt DNA, kan bära på t.ex.
antibiotikaresistens eller annan proteinkodande gen som är fördelaktig för
bakterien
Vektor: bearbetad cirkulärt DNA som bär på vissa egenskaper som gör att
den är lätt att arbeta med. Gör det möjligt att föra in DNA-fragment i
bakterier eller eukaryota celler. Vektorn bär på delar som möjliggör
amplifiering.
Olika typer av vektorer
Plasmider
Bakterievirus:
kallas även fager eller bakteriefager
Virus:
t.ex. Lentivirus, Adeno-associerat virus (AAV);
enkelsträngat DNA
BAC/YAC:
Bacterial/Yeast Artificial Chromosome. Större än en
vanlig plasmid
Vektorernas sekvensdelar
ORI:
origin of replication. Här startar replikationen av vektorn genom
värdcellens replikationsmaskineri.
MCS:
multiple cloning site. Region som innehåller sekvens som är
specifik för olika restriktionsenzym som inte klipper någon
annanstans i vektorn. Det är i MCS som DNA fragmentet man vill
klona ligeras in.
”Resistensgen”: kodar mot beta-laktamas som bryter ned ampicillin
(antibiotika)
Promotor: den del dit värdcellens RNApolII kan binda och initiera uttrycket
av en gen (transkription) som finns i vektorn
Reportergen: t.ex. GFP (green fluorescent protein)*, RFP (Red fluorescent
protein) eller LacZ. Uttrycks genom värdcellen via vektorpromotor och
visualiserar var vektorn uttrycks (i vilka celler vektorn är närvarande och
fungerande).
LacZ : kodar för beta-galaktosidas som möjliggör blå/vit screening.
Vektor ni kommer använda i lab 3, pMOSBlue
pEGFP vektor, lab 6
Enzymer
Nukleaser:
klyver bindningarna mellan nukleotiderna
endo- klipper inuti DNA-sträng
exo- klipper i ändarna
Restriktionsenzym: endonukleaser som produceras av bakterier. Känner igen
4-8 bp långa specifika sekvenser som kallas
restriktionssiter. Enzymet klyver båda strängarna i DNAt
och lämnar antingen sticky- eller bluntends.
Restriktionssitet är ofta palindrom (= samma sekvens från
båda håll).
Enzym
EcoRI
HindIII
XmaI
EcoRV
Restriktions site
Enzymer
Fosfatas:
tar bort fosfatgrupper; en vektor som klyvts och fått
bluntends kan återligera med sig själv och för att
förhindra detta kan man tillsätta fosfatas (CIP, calf
intenstine phosphatase) som tar bort
fosfatgruppen i 5’.
Ligas:
ligerar ihop två DNA sekvenser, skapar kovalenta
(atomerna delar elektroner för att fullt yttre skal)
bindningar mellan två nukleinsyrasträngar
.
Fungerar både för sticky- och bluntends. Kräver en ände
med 5’-fosfat och ATP som energikälla.
Ett kloningsexperiment
Exempel:
Undersöka en gens funktion genom att uttrycka den ektopiskt (på fel plats)
Få celler att producera stora mängder av ett visst protein man vill använda i ett
annat syfte
Genterapi
Ett kloningsexperiment
• PCR
• Ligering in i vektor
• Transformation till bakterier
• Preparation av plasmidDNA för analys
• Restriktionsklyvning och analys på agarosgel
Transformation av rekombinant plasmid till bakterier
Transformation: överföring av plasmid till bakterie, kan ske genom t.ex.
elchock eller värmechock
Kompetenta bakterier: har specialbehandlats för att kunna ta upp plasmider
effektivt (t.ex. Ca2+)
Selektion: bakterier som tar upp plasmid med antibiotikaresistens kan växa
på näringslösning med antibiotika medan övriga dör.
pMOS vektorn tillåter så kallad blå/vit screening (mer om detta
på förlabben för lab 3). Om X-gal sätts till på agarplatta kommer
bakterier som tagit upp intakt (återligerad) vektor bli blå medan
de bakterier som tagit upp vektor med fragment inligerat i MCS
(LacZ förstörs; beta-galaktosidas klyver X-gal) blir vita.
Vektor ni kommer använda i lab 3, pMOSBlue
Preparation av plasmidDNA
Koloni som selekterats fram plockas från agarplatta och odlas upp i
flytande näringslösning. Därefter lyseras bakterierna med NaOH
och SDS. DNAt fälls ut som ett salt genom etanol.
För att försäkra sig om att ett fragment verkligen inligerats i vektorn
görs en ny restriktionsklyvning för att klippa ut fragmentet.
Klyvningsreaktionen körs sedan ut på en agarosgel (elektrofores) för
storleksbestämning
Agarosgel-elektrofores
Elektrofores: Inmärkt (t.ex. SYBRsafe) DNA sätts i en agarosgel och elektrisk
spänning slås på vilket resulterar i att DNAt vandrar mot +-polen: möjliggör
separation av olika stora fragment och koncentrationsuppskattning
Kvantifiering: till en gel sätts en liten mängd av plasmid-preppen med okänd
koncentration och en känd mängd DNA (t.ex. 1 µg). Genom visuell jämförelse
mellan plasmidpreppen och DNAt med den kända mängden kan plasmidpreppen
uppskattas innehålla ungefär hälften, dubbelt eller tredubbelt så mycket DNA som
den kända mängden
Verifiering: en viss volym av plasmidpreppen sätts ut i en brunn, i en annan sätts
en stege ut med fragment med olika storlek och kända koncentrationer. Är min
plasmid av rätt förväntad storlek? Klyvdes det ut något fragment från plasmiden?
Exempel: Du har ligerat in ett 1000 bp stort PCR-fragment i en 3000 bp stor vektor. Den
rekombinanta plasmiden transformeras till bakterier, som odlas upp under selektion och
plasmidDNA preppas fram. Du har nu klyvt ut ditt fragment med två restriktionsenzym och
undrar hur mycket mängd (ng) fragment kloningen gav totalt. PlamidDNAt har en
totalvolym på 100 µl och du satte ut 10 µl på agarosgelen. Den stege du satte till (5 µl) ses
nedan.
1µg (10µl) av GeneRuler DNA Ladder Mix
innehåller:
120ng av 1000bp fragmentet
120 ng av 3000bp fragmentet.
1. Jämför intensitet mellan ditt 1000 bp
fragment och stegens, låt säga 3 gånger
starkare.
2. På gelen finns 60 ng av 1000 bp
stegefragmentet, alltså har du satt ut ___ ng
plasmidDNA fragment
3. Du satte ut 10 µl av 100 µl DNAprepp,
således fick du totalt ut ___ ng av ditt
DNA fragment
Kloningsverktyg och kloning
Dagens föreläsning:
• Definition kloning (repetition)
• Grundläggande begrepp (repetition)
• Kloningsverktyg
vektorer
enzymer
• Ett kloningsexperiment från start till mål
Kapitel 5 Lodish, Molecular Cell Biology 7th ed, 2013.
