Grupp: Pyrola Sandberg, Hanna Norlin och Hanna Arvidsson
Kurs: Biokemi VT 2003
Inlämningsdatum: 2003-06-03
Handledare: Hans Eklund
Innehåll
Abstract
Inledning
Bakgrund
Enzymlänkade receptorer
Tillväxthormonet binder till receptorn
Prolaktin
Referenser
Abstract
The purpose with this project was to learn more about growth hormone. Growth hormone is a
signal substance which tells the body parts when its time to grow.
The growth hormone binds to two receptors that send the signals forward to the adaptor
protein.
This project will take you deeper in how the growth hormone binds to its receptor and how
the growth hormone binds to the prolactin receptor.
Inledning
Syftet med projektarbetet var att fördjupa sig i någon del som vi inte han gå in på under
kursens gång. Vi valde att läsa mer om tillväxthormoner och om hur tillväxthormonet binder
till sin receptor. Vi tar även upp prolaktin receptorn, ett hormon med egenskaper liknande
tillväxthormonets. För att få en övergripande bild av tillväxthormonets signalväg är den här
bilden bra att titta på.
Bild 1
Tillväxthormoner är ett signalämne som talar om för de olika kroppsdelarna att de ska växa.
Hos människor bildas det i hypofysen. Hypofysen producerar tillväxthormon (GH) som tas
upp av tillväxthomon receptorn (GHR). Den aktiverade receptorn fosforylerar Grb-2. Grb-2
länkar fosforuleringen av EGF-receptorn till att stimulera cellväxt genom en kedja av
proteinfosforyleringar. Grb-2 binder till en fosforylerad del av receptorn med domänen SH2 .
Grb-2 rekryterar ett protein, sos, som interagerar med Grb-2 genom två SH3-domäner. Sos i
sin tur binder och aktiverar RAS, en mycket bra signalöverförare. Då Ras är aktiverat binder
detta till andra komponenter som i sin tur leder till aktivering av specifika serin-treonin
proteinkinaser. Proteinkinaserna fosforylerar specifika mål som ger upphov till cellväxt.
Peptidhormoners receptorer är sensoriska maskiner som leder celler till t ex förökning eller
död. Tillväxthormonets receptor tillhör klassen cytokin eller den hematopoietic superfamiljen
för hormoners receptorer som medlar signaler från mer än 20 kända cytokin som tillexempel
interleukin, erythropoietin och prolaktin, såväl som växtfaktorer. Medlemmar av denna
superfamiljs receptor har en tredomäns organisation inkluderat en extracellulär
ligandbindningsdomän bestående av 250 aminosyror, ett ensamt transmembransegment och
en intracellulär domän bestående av 350 aminosyror som skiljer sig i sekvens bland
familjemedlemmarna.
Likt andra hormoner i klassen cytokines har tillväxthormon en hopbuntad fyra-helix
struktur.Tillväxthormonet är ett monomeriskt protein bestående av 217 aminosyror.
Tillväxthormonets receptor består av 638 aminosyror. Två utav _-helixarna, A och D, är långa
(runt 30 aminosyror ) och de andra två, B och C, är runt 10 aminosyror kortare. Likt andra
buntade fyra-helix strukturer är den inre kärnan av bunten gjord av nästan bara hydrofoba
rester.
Topologin av fyra-helixen är upp-upp-ner-ner med två överkorsande förbindelser från ena
änden till den andra änden av bunten, länkande helix A med B och helix C med D. Två korta
helixar finns i den första överkorsande förbindelsen och ytterligare en i loopen som förbinder
helixarna C och D.
Bakgrund
Humant tillväxthormon var det första läkemedel som tillverkades industriellt med genteknik
och det skedde hos det svenska läkemedelsföretaget Kabi-Vitrum. Somliga människor föds
utan förmåga att själva kunna tillverka tillräckligt med växthormon och drabbas då av så
kallad hypofysär dvärgväxt. För att hjälpa dem utvecklade Kabi-Vitrum i början av 1970-talet
en metod att preparera fram tillväxthormon från hypofysen från avlidna, men de mängder man
fick fram kom aldrig i närheten av att täcka efterfrågan. Därför fick den som behandlades med
preparatet hormoner från ett stort antal olika avlidna människor, och man var orolig för att få
kontamination av prioner, som orsakar Creutzfelts-Jacobs sjuka, den mänskliga varianten av
”galna ko”-sjukan.
I mitten av 1970-talet isolerade några amerikanska forskare genen för tillväxthormon. KabiVitrum köpte då genen, förde in bakterier som innehöll genen och odlade upp dem i stora
fermentationsbehållare där bakterierna bildade tillväxthormon. Bakterierna slogs sönder och
hormon renades fram som efter en tid kunde börja säljas.
Enzymlänkade receptorer
Tillväxthormonreceptorn och prolactinreceptorn tillhör båda gruppen tyrosinkinas-associerade
receptorer, som i sin tur tillhör gruppen enzymlänkade receptorer. Det finns fem stycken
grupper med enzymlänkade receptorer; (1) receptortyrosin-kinaser fosforylerar specifika
tyrosin aminosyror; (2) tyrosinkinas-associerade receptorer associeras med proteiner som har
tyrosinkinas aktivitet; (3) receptortyrosin fosfataser, tar bort fosfatgrupper från tyrosin på
specifika intracellulära signalproteiner; (4) transmembranreceptor serin/treonin kinaser,
tillsätter fosfatgrupper till sidokedjorna på serin och treonin på målproteiner (target proteins)
och (5) transmembran guanyl cyclaser som katalyserar produktionen av cyklisk GMP
(guanosin monofosfat) i cytosolen. Den andra gruppen har domäner i cytosolen som saknar
definierade katalytiska funktioner. Det är en stor heterogen grupp som innehåller receptorer
för så väl cytokines som för vissa hormoner, t ex tillväxthormoner och prolaktin som beskriv
nedan.
Tillväxthormonet och dess receptorer
Tillväxthormonreceptorn sitter i cellmembranet med en extracellulär domän, en helix i
membranet och en intracellulär domän. Den extracelluära delen består i sin tur av två
domäner. Dessa båda domäner kallas N-terminal och C-terminal tillsammans består de av 250
aminosyror. Den intracellulära domänen består av 350 aminosyror. När inget tillväxthormon
är bundet till receptorn rör den sig över cellmembranet i form av en monomer.
Receptorns extracellulära domäner innehåller ett visst antal loopar som binder till varandra
och bildar tillsammans ytan där tillväxthormonet binder. Vid bindandet av hormonet används
tre av looparna i N-termnalen: A-B, C-D och E-F samt två stycken av looparna i C-terminal
domänen: B-C och F-G. Dessa loopar liknar varandra både i aminosyrasekvens och i den
tredimensionella strukturen.
De två receptorerna binder till hormonet med samma loopområde, medan hormonet binder
med totalt olika ytor till de båda receptorerna. Hormonets bindningsytor består av aminosyror
från _-helix A och D till den ena receptorn och till den andra receptorn binder hormonet med
aminosyror från _-helix A och C. Det finns inga strukturella likheter mellan ytorna.
Bindningsytan för A-C är platt medan bindningsytan för A-D är konkav. Inte heller några
likheter mellan aminosyrorna finns i dessa bindningsytor.
Bild 2
Tillväxthormonet (röd) binder till två stycken receptorer (blå). Varje receptor består av två extracellulära domäner (ljus- respektive mörkblå),
samt en intracellulär domän (ej i bild). Receptorernas bindningsyta är looparna markerade med gult.
Tillväxthormonet binder till den extracellulära domänen på receptorn med sin A-D-yta och
bildar ett första komplex med en receptor. I och med det förändras strukturen hos hormonet
vilket gör att en bindning till ytterliggare en receptor favoriseras. Därför kommer hormonet
till att binda till ytterligare en extracellulär domän på en annan receptor då den kommer
tillräckligt nära med sin A-C aktiva yta och ett andra komplex har bildats. Det andra
komplexet har formen av en dimer. Dimeren besår alltså av två receptorer som binder till ett
hormon. (se bild 1) Hormonet binder således till två receptorer som ser likadana ut men
hormonet kommer binda med två helt skilda ytor till de båda receptorerna. Den andra
bindningen underlättas genom interaktionen mellan C-terminaldomänerna i de två
receptorerna. I och med att de två extracellulära domänerna sammanlänkas till ett hormon
kommer även de två intracellulära delarna hos receptorerna till att interagera med varandra.
Det är det som gör att signalen kan föras vidare i cellen. Det sker genom att proteiner som
finns i de intracellulära domänerna aktiveras.
Bild 3
Schematisk bild över hur tillväxthormonet fäster till tillväxthormonsreceptorn.
Trots att tillväxthormonets bindningsytor är olika binder de likväl till samma plats på
receptorn. Skillnaden blir att de får olika bindningsstyrkor. Receptorn täcker 1300 Å2 av
hormonets A-D-bindningsyta medan den täcker 850 Å2 av hormonets A-C-bindningsyta. Det
gör att bindningen med A-D är betydligt starkare. Bindningsstyrkan beror på de specifika
interaktionerna som är involverade i bindningen. Men det finns alltså även ett samband
mellan bindningsytans storlek och bindningens styrka när proteiner interagerar.
Prolaktin receptorn
Prolaktin (PRL) är ett hormon som påminner mycket om tillväxthormonet (GH). Antagligen
härstammar de från en och samma gen. Deras användningsområden skiljer sig dock betydligt.
Prolaktin har flera olika användningsområden hos olika vertebrater. Hos däggdjur så styr
prolaktin mjölkproduktionen, hos sötvattenfiskar reglerar det vattenbalansen och
saltkoncentrationen och hos fåglar regelerar prolaktin fettmetabolismen. Att prolaktin har så
många användningsområden hos de olika arterna tyder på att de har utvecklats under
evolutionens gång. Tillväxthormon och prolaktin räknas som skilda hormon bland annat för
att de har olika receptorer. Båda receptorerna tillhör samma klass av cytokineser och de liknar
varandra mycket. De liknar varandra framförallt i deras vikning medan deras sekvens bara är
identisk i 28 %. Domänernas struktur och de aktiva ytorna påminner mycket om varandra men
förhållandet mellan domänerna skiljer sig åt mellan tillväxthormon receptorn (GHR) och
prolactin receptorn (PLR). Trots det kan tillväxthormonet binda och aktivera även prolaktin
receptorn. Tilläxthormonet kommer här bara att binda till en receptor och inte som då
hormonet binder till två stycken tillväxthormonreceptorer(GHR) (se bild 3). Hormonet binder
till PLR med samma aktiva yta som den skapar den starkare bindningen till GHR. Alltså till
den aktiva ytan A-D på tillväxthormonet. Hormonets struktur förändras mycket lite beroende
om den binder till GHR eller till PLR. Hur är det då möjligt för hormonet att binda till
receptorn trots att förhållandet mellan domänerna skiljer sig åt och att inte alla rester är
identiska vid aktiva ytorna?
Bild 4
Hormonet binder bara till en prolactin receptor och inte till två som då den binder till växthormonreceptorn.
Faktum är att det som man kan tro ska vara en nackdel, skillnaden i förhållandet mellan
domänerna här är en fördel. Receptorernas sekvens vid de aktiva ytorna är nästan identiska
men det finns vissa kritiska skillnader. Det är samma loopar hos både växthormon receptorn
och prolaktin receptorn som utgör bindningen till hormonet. En av de skillnader som finns är
placerad i de fyra första resterna i en av bindningsytorna. Hos GHR är dessa retser:
Ser-Val-Asp-Glu. Hos PLR är motsvarande rester: Asp-Val-Thr-Tyr. Det finns ytterligare sju
rester som interagerar i den här bindningen men de är identiska hos GHR och PLR och är
därför inte särskilt intressanta i den här jämförelsen. Då hormonet binder till GHR så är det en
arginin hos hormonet som bildar en saltbrygga till glutamat 127 hos GHR. Hos PLR sitter det
en tyrosin 127 istället för glutamat 127. Det är omöjligt för hormonets arginin att bilda en
saltbrygga med tyrosins hydroxidjon. Eftersom förhållandet mellan domänerna inte ser
likadant ut för PLR som för GHR kommer aspartat 124 kunna komma upp och ta tyrosins
plats och därmed kan en saltbrygga bildas mellan homonet och receptorn.
Bild 5
Växthormonets Arg 167 bildar en saltbrygga till Glu 127 hos växthormonreceptorn men till Asp 124 hos prolactin receptorn.
En annan viktig skillnad mellan de båda receptorerna finns i början på F-G-loopen i
C-terminaldomänen. Hos GHR lyder sekvensen Arg-Asn-Ser och de aminosyrorna tar inte
någon aktiv del i bildandet av bindningar mellan hormonet och receptorn. Hos prolaktin
receptorn finns det tre andra rester: Asp-His-deletion. De interagerar med histidin 18 och
glutamat 174 hos hormonet. Tillsammans bildar de en mycket stark bindningsplats för zink.
Då ett zink binder i den här ytan kommer bindningen mellan hormonet och receptorn till att
bli mycket stark. Finns det inget zink kan ingen bindning uppstå här. Det är alltså zink som
blir den bindande faktorn mellan växthormonet och prolaktin receptorn och i närvaro av zink
ökar affiniteten mellan hormonet och prolactin receptorn med 10000 gånger. Zink har ingen
effekt för affiniteten mellan hormonet och växthormon receptorn.
Bild 6
Om zink är närvarande kommer affiniteten mellan prolactin receptorn och hormonet öka med 10 000 gånger. Zink har ingen effekt på
bindningen mellan hormonet och växthormon receptorn.
De båda exemplen ovan visar på vikten av sekvensskillnader och skillnaden i relationen
mellan domäner för att bindningen ska kunna uppstå mellan växthormonet och de båda
receptorerna. Genom att förstå hur det fungerar underlättar man byggandet av modeller för
andra aktiva ytor hos andra receptorer och dess hormoner. Det har i sin tur stor betydelse för
läkemedelsforskningen. Genom att förstå hur hormoner binder till receptorer, vilka de aktiva
ytorna är och hur hormonet och receptorn interagerar med varandra. Samt förstå hur
sekvensskillnader kan förändra strukturen och därmed skapa nya bindningsytor och föra fram
nya rester till den aktiva ytan och hur domäners förhållande till varandra kan skapa nya
bindningar kan nya läkemedel tillverkas. Det gäller inte bara hormoner och deras receptorer
utan även smärtreceptorer och alla andra receptorer som finns hos männniskor och djur.
Referens
Carl Branden & John Tooze. Introduction to protein structure, 2nd ed. 1999. Garlan
Publishing Inc, New York.
Jeremy Berg, John Tymoczko, Lubert Stryer, Biochemistry, 5th ed. 2002. W.H. Freeman and
Company, New York.
Henrik Brändén. Molekylär biologi. 1:a upplagan. Studentlitteratur, Lund.
