Karlstads universitet
Inst för kemi, biomedicinska ämnen
010117/BiS
Cellodling
Laborationskompendium
Sammanställd av Birgitta Sundström
Karlstads universitet
Inst för kemi, biomedicinska ämnen
010117/BiS
Material och lösningar:
Odlingsmedium – 50 ml Falconrör (blå skruvkort)
Finns färdigt. DMEM:F12 1:1 med tillsats av 10% (v/v) fetalt kalvserum och
antibiotika i lämpligmängd (PEST). Odlingsmedium innehåller dessutom 15 mM
Hepes för att stabilisera pH.
Finns i kylskåp, ska rumstempereras föra användandet.
Odlingsflaskor – T25
Odling sker i flaska med 25 cm2 bottenyta. Flaskorna har förbehandlad plast för att
cellerna ska fästa bättre.
Finns i cellodlingslokalen.
Sterila pipetter – 10 ml, individuellt förpackade
Finns i cellodlingslokalen
70% denaturerad etanol för desinficering – i sprayfalska
En flaska placerad i rummet utanför. Används för att desinficera odlingsmediumrör
och rullbordet som ska vara placerat där.
En flaska finns i cellodlingslokalen. Används för desinfektion av LAF-bänk och
material och utrustning som tas in i LAF-bänk.
Pipetteringsutrustning
Används vid pipetteringar.
Finns i cellodlingslokalen.
Tvättlapp/trasa
Används vid desinficering av ytor.
Finns i rummet utanför cellodlingslokalen.
Finns i cellodlingslokalen.
Bürker räknekammare
Används för bestämning av antalet celler i odlingsmediet efter att de lossats från
underlaget via försiktig skakning.
Kan också användas för bestämning av antalet döda / levande celler i odlingen.
Inverterat mikroskop
Finns i cellodlingslokalen
Mikroskop
Finns i rummet utanför cellodlingsrummet.
Kristallviolett-lösning
Används för bestämning av totalantal celler i kulturen
Trypanblå-lösning
Används för bestämning av antal döda celler i kulturen.
Karlstads universitet
Inst för kemi, biomedicinska ämnen
010117/BiS
Denna laboration syftar till att ge kunskap om sterilteknik, odling av animalieceller och vad
odlade celler kan användas till.
Mediet som produceras ska användas i en senare laboration under kursen för separation /
rening av monoklonal antikropp.
Laborationen är upplagd på följande sätt:
1. En T25 flaska med celler erhålls från handledaren. Dag 1 splittas cellerna 1:5. De följande
två veckorna tillsätts nytt medium, alternativt byts 60% av det gamla mediet mot nytt.
Mediet som tas från cellerna centrifugeras, hälls över till nytt rör /flaska och förvaras i
kylskåp. Märk dina rör och flaskor så att du vet vilka som tillhör dig.
2. Från en cellsuspensionen som erhålls från handledaren tas ett prov ut för bestämning av
totalantal celler. Från suspensionen tas sedan 5 x 104 levande celler ut och överförs till ny
flaska. Mediet tillsätts så att volymen blir 8 ml. Tillväxtkurva.
3. Denna flaska används för att bestämma cellinjens tillväxtkurva. T.ex de dagar då medium
tillsätts/byts görs på de övriga 5 flaskorna så tas prov ut från denna flaska för cellräkning,
totalantal och antal döda celler. Antal döda celler.
Karlstads universitet
Inst för kemi, biomedicinska ämnen
010117/BiS
Utförande:
Dag 1:
En T25 flaska ska delas (splittas) 1:5. Se fig. nedan.
Titta på cellerna i flaskan med hjälp av det inverterade mikroskopet. Om
cellerna mår bra ska de vara lite bulliga och glänsa. Celler som ser granulerade
ut mår inte så bra.
Skaka försiktigt loss cellerna från flaskans botten. Överför suspensionen i ett
Falconrör och tillsätt ytterligare 20 ml nytt medium.
Blanda cellsuspensionen och överför 5 ml suspension till varje falska (5 st).
Fördela cellerna så lika som möjligt – pipettera endast 5 ml åt gången eftersom
cellerna sedimenterar i pipetten.
Märk flaskorna med signatur och passagenummer.
Titta på cellerna i flaskorna med hjälp av inverterade mikroskopet.
Placera flaskorna i koldioxid inkubatorn med ”öppnad” kork.
Karlstads universitet
Inst för kemi, biomedicinska ämnen
010117/BiS
Varannan till var tredje dag:
Titta på cellerna med hjälp av det inverterade mikroskopet. Om mediet blivit
gult tillsätts ytterligare 5 ml medium. I övriga fall får de stå kvar i inkubatorn.
Om flaskorna inkuberats med 10 ml medium i 2-3 dagar så byts ca 60% av
medium mot nytt medium.
¾ Titta på cellerna i flaska med inv. mikroskopet
¾ Ta ut flaskorna, ställ dem i LAF-bänken efter desinficering.
¾ Överför med pipett 8 ml medium från varje falska till ett rent Falconrör.
¾ Tillsätt nytt medium, 3 ml i varje falska.
¾ Placera flaskorna i inkubatorn
¾ Mediet centrifugeras vid ca 300xg under 10 min, Mediet överförs till ett nytt
rör eller flaska.
Tillväxtkurva:
Du ska räkna celler vid olika tidpunkter för att konstruera en tillväxtkurva för
cellen.
Från en flaska som fås av handledaren tas ett prov av cellsuspensionen för
räkning av antal celler.
¾ I en ny T25 flaska sätts 5x104 celler. Tillsätt medium så att totala volymen
blir 8 ml.
¾ Placera flaskan i inkubatorn
¾ Minst tre gånger varje vecka (t.ex när du byter medium på dina övriga
flaskor) skakas cellerna loss från botten och räknas med både totala antalet
och antalet döda celler mha Bürker räknekammare. Försök notera tiden så
exakt som möjligt.
Det är en fördel att räkna ofta när cellerna växer som snabbast (tidigt).
¾ Ta ut prov på cellsuspensionen – 0,5 ml som överförs till ett litet rör
¾ Blanda lika delar suspension och färglösning – ex 0,1 ml + 0,1 ml av
respektive.
¾ Placera i Bürker räknekammare och räkna antalet celler – se
teorikompendium.
¾ Rita en tillväxtkurva med ln (naturliga logaritmen) för totala antalet celler på
y-axeln mot tid i timmar på x-axeln (lin-lin papper).
¾ Från kurvan beräknas fördubblingstiden enligt formeln i teorikompendiet.
Bestämning av kvoten döda/levande celler
Från samma cellsuspension som ovan tas prov ut för att bestämma antalet döda
celler. Rita ett diagram där andelen döda celler av totalantalet celler sätts mot tid
i timmar.
Uppskattning av pH
Bestämning av mängd monoklonal antikropp enligt ELISA
