Generation of monoclonal antibodies against hanta, HIV and measles virus
Ewa Björling, MTC, KI
MTC, Karolinska Institutet
171 77 Stockholm
Projekt: 9/98
Nyckelord: Monoklonala antikroppar, kombinatorisk antikroppsteknik, Hanta virus, HIV
Syfte:
Att framställa humana monoklonala antikroppar med kombinatorisk antikroppsteknik som är en
molekylär biologisk utveckling av tidigare mus hybridom tekniker. Här använder man sig istället av
enbart humant material för antikroppsframställning.
Betydelse samt påverkan på djurförsök:
Med denna studie avser vi att framställa humana monoklonala antikroppar för immunterapi och
profylax mot Hantavirus och HIV. Utvecklandet av antikroppar mot mässling är tänkta att användas för
att förklara och ytterligare belysa möjligheten att utveckla ett mässlingsvaccin som fungerar vid tidig
ålder, även i närvaro av maternella antikroppar.
Denna metod ersätter tidigare framställning av monoklonala antikroppar via möss på ett sådant sätt att
inga djurförsök alls behövs för rekombinanta humana monoklonaler. En ytterligare fördel är att man
kan välja vilket agens man vill framställa sina antikroppar mot och sedan återanvända samma
bibliotek, dessutom kommer man närmare in vivo situationen då man direkt arbetar med humant
material istället för att utvärdera sina resultat via mus och sedan utveckla mus-human hybrida
monoklonaler.
Arbetsplan:
Vi har använt mRNA utvunnet från perifera blod lymfocyter ur benmärg från människa med immunitet
mot dessa olika virus för att vidare framställa olika kombinatoriska antikroppsbibliotek. Olika IgG
bibliotek har sedan konstruerats i ett vektorsystem, pComb3 med lätt och tung kedja ligerade i vektorn
via användandet av olika restriktionsenzymer. Via en superinfektion med en fag M13 (human) sker ett
uttryck av Fab på ytan och man framställer sedan Fab fragment mot önskat antigen med hjälp av
upprepad exposition mot valt agens. Ytterligare en klyvning med restriktionsenzymer separerar sedan
Fab från fag och Fab används för biologisk karakterisering i olika tester, ex. neutralisation.
1)
Utveckling och karakterisering av rekombinanta humana Fab fragment specifika för Hanta
Puumala virus.
Vi har framställt ett antikroppsbibliotek av mjälte från en person med immunitet mot
Hantavirus. I detta arbete har vi funnit ett flertal neutraliserande antikroppar mot hanta
Puumala virus. Dessa antikroppar är väl karakteriserade med avseende på biologisk aktivitet
och kan sedan vidare rekonstitueras till hela IgG för att kunna användas i passiv immunisering.
Detta arbete har resulterat i en publicerad artikel ”A neutralizing recombinant human antibody
Fab fragment against Puumala Hantavirus”. C de Carvalho Nicacio, Å. Lundkvist, K. Brus
Sjölander, A. Plyusnin, P. W. H. I. Parren, E-M. Salonen, D.R. Burton and E.Björling (J Med Vir
60.446-454, 2000).
2)
Utveckling av humana Fab fragment med neutraliserande förmåga mot HIV-l och HIV-2.
Detta arbete har inte lyckats på grund av att grundmaterialet visade sig vara av för låg kvalité
för att kunna konstruera ett antikroppsbibliotek. På grund av den situation som rått under flera
år nere i Guinea-Bissau (krig), har vi inte heller haft möjlighet att få ytterligare material för
denna studie. Nu har situationen stabiliserats och laboratoriet där nere börjat komma igång
igen, varför vi inom en snar framtid kan hoppas på nytt material.
I stället har vi slutfört ett annat arbete med HIV-2 rekombinanta humana antikroppar, där vi
funnit flera antikroppar med biologisk aktivitet. Dessa antikroppar kommer nu att vidare
användas till att studera HIV-2’s ytprotein struktur, vilket är mycket viktigt för att ytterligare
klargöra vilka delar som är viktiga vid framtida vaccinframställning.
Generation and characterization of neutralizing HIV-2 specific human Fab molecules. E.
Björling, M.Ehnlund, A.Mörner, E.Norrby, and M.Persson. J Gen Virol 1999,80,8, 1987–1993.
3)
Generering av humana monoklonala antikroppar mot mässling.
Vi har framställt ett antal antikroppar mot mässling. Två av dessa har visat sig ha en stark
neutraliserande förmåga och har vidare detaljstuderats, detta har resulterat i ett manuskript:
”Neutralizing measles virus H and F protein specific human Fab fragments”. C de Carvalho
Nicacio, Å. Lundkvist, A. Williamson, P. W. H. I. Parren, D.R. Burton and E.Björling.
Dessa kommer främst att användas för att göra kompetitiva studier med tidigare framställda
monoklonaler mot mässling för att utröna om det finns epitoper som är betydelsefulla för
neutraliserande antikroppar verksamma parallellt med maternellt förvärvade antikroppar vilket
är viktigt för framställande av ett vaccin som kan ges till spädbarn i u-länder där mässling
fortfarande orsakar en hög dödlighet.
Övriga resultat sedan 1998:
•
Characterization of neutralizing sites in the V2 and V4 region in the gp125 and a conserved
region in the gp36 of human immunodeficiency virus type 2. P.Skott, A. Achour, R.
Thorstensson, R., and E. Björling. Vir Immunol 1999:1, 79–88.
•
Fine characterization of a neutralizing epitope in the third variable region (V3) of the surface
glycoprotein (gp125) of human immunodeficiency virus type 2. A. Mörner, A. Achour, M. Norin,
R Thorstensson and E. Björling Virus Research 1999:59, 49–60.
•
Salivary sIgA response in human immunodeficiency virus type 1 infection. Skott, P., Lucht, E.,
Julander, I., Dillner, J., and Björling, E. J AIDS 1999; 21(2) 73–80.
•
Primary human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) isolates, like HIV-l, frequently use
CCR5 but show promiscuity in coreceptor usage. Mörner, A., Björndal, Å., Albert, J.,
KewalRamani, V., Littman, D., Thorstensson, R., Fenyö, E-M., and Björling, E. J Virol
1999:73, 2343–2349.
•
Generation and characterization of neutralizing HIV-2 specific human Fab molecules. E.
Björling, M.Ehnlund, A.Mörner, E.Norrby, and M.Persson. J Gen Virol 1999,80,8, 1987–1993.
•
Fine characterization of the antigenic flap region in the protease protein of HIV-l. Mariethe
Ehnlund, Ewa Björling (Arch Vir 145:365-369, 2000)
•
A neutralizing recombinant human antibody Fab fragment against Puumala Hantavirus. C de
Carvalho Nicacio, Å. Lundkvist, K. Brus Sjölander, A. Plyusnin, P. W. H. I. Parren, E-M.
Salonen, D.R. Burton and E.Björling (J Med Vir 60:446–454, 2000)
•
Immunoglobulin A (IgA) responses to Hanta puumala virus. Cristina de Carvalho Nicacio, Ewa
Björling and Åke Lundkvist. (J Gen Virol 81: 1453-1461, 2000)
•
Rytting, A-S., Åkerblom, L., Albert, J., Unge, T., Björling, E., Al-Khalili, L., Gronowitz, J.S., and
Källander, C.F.R. Monoclonal antibodies to native HIV type 1 reverse transcriptase and their
interaction with enzymes from different subtypes. (AIDS Res Hum Retroviruses 16: 1281–
1294, 2000)
Manus insända till tidskrifter för refereebedömning:
•
Measles virus specific maternal IgG antibodies in infants from Guinea-Bissau. de Carvalho
Nicacio, C., Aronsson, B., Demba Embalo, B., Gunnlaugsson, O., Troye-Blomberg, M.,
Björling, E. and Smedman, L. (submitted, The Pediatric Infectious Disease Journal)
•
Ehnlund, M., and Björling, E. Evaluation of inhibitory effect and antigenicity against HlV
mediated by peptides representing the entire secretory leucocyte proteinase inhibitor
(submitted, Immunobiology)
•
HLA alleles and the clinical outcome of Andes hantavirus infection in Argentina. Partanen, J.,
Gonzalez Della valle, M., Björling, E., Lundkvist, Å., Vaheri, A., Plyusnin, A. (submitted,
Lancet)
•
IgA-mediated neutralization of HIV-1 virus isolates: a comparison of salivary and serum
derived immunoglobulins in natural infection. Skott, P., Ehnlund, M., Lucht, E., Lundkvist, Å.,
Julander, I., Dillner, J., and Björling, E. (submitted, J Infect Diseases)
Bokkapitel:
Immune responses in HIV-2. E. Björling. Book chapter in Human Retroviral Infection:
Immunological and Molecular Theories, Friedman, H., Ugen, K., and Bendinelli, M. Kluwer
Academic/Plenum publishers, New York, USA. ISBN 0-306-46222-2, 1999.
Abstracts:
•
Coreceptor usage by primary HIV-2 isolates. A. Mörner, Å. Björndal, J. Albert, R.
Thorstensson, E-M. Fenyö and E.Björling. Munich, Germany, 28 feb–3 mars 1998. ECEAR;
Third European Conference on Experimental AIDS Research.
•
Expression and characterization of recombinant human monoclonal antibody fab fragments
against Puumala Hantaviruses. C. de Carvalho Nicacio, Å. Lundkvist, E-L. Salonen, P. Parren,
D. Burton and E. Björling. Atlanta, USA: 5–7 March, 1998. The Fourth International
Conference on HFRS and Hantaviruses.
•
Coreceptor usage by primary HIV-2 isolates. A. Mörner, Å. Björndal, J. Albert, R.
Thorstensson, E-M. Fenyö and E.Björling The 12th World AIDS conference, Geneva,
Switzerland, June 27–July 3, 1998.
•
IgA-mediated neutralization of HIV-1 virus isolates: a comparison of salivary and serum
derived immunoglobulins in natural infection. Skott, P., Ehnlund, M., Lucht, E., Julander, I.,
Dillner, J., and Björling, E. The 12th World AIDS conference, Geneva, Switzerland, June 27–
July3, 1998.
•
Characterization of salivary derived HIV-1 specific IgA antibodies. Skott, P., Ehnlund, M.,
Lucht, E., Julander, I., Dillner, J., and Björling, E. Symposium on prion and lentiviral diseases.
IX. Northern Lights Neuroscience Symposium. August 20–22, 1998 Reykjavik, Iceland.
•
IgA-mediated neutralization of HIV-1 virus isolates: a comparison of salivary and serum
derived immunoglobulins in natural infection. Björling, E., Skott, P., Ehnlund, M., Lucht, E.,
Julander, I.and Dillner, J. AIDS pathogenesis, Keystone symposia, 7–13 Jan, 1999, Colorado,
USA.-IgA-mediated neutralization of HIV-1 virus isolates: a comparison of salivary and serum
derived immunoglobulins in natural infection. Björling, E., Skott, P., Ehnlund, M., Lucht, E.,
Julander, I.and Dillner, J., Immunology Letters 1999;69 (1), 36. F10th international Congress
of Mucosal immunology, Amsterdam, June 28–July 1, 1999.
•
Humoral and CD4+ cellular responses after immunisation with recombinant Puumala
hantavirus nucleocapsid protein. De Carvalho, C., Björling, E., and Lundkvist, Å. XIth
International Congress of Virology, Sydney, Australia, 9–13 Aug, 1999.
•
The importance of the chemokine receptors CCR5 and CXCR4 for HIV-1 and HIV-2 in vitro
infection of human PBMC. Mörner, A., Björndal, Å., Fenyö, E-M., Björling, E., and Jansson,
•
M. XIth International Congress of Virology, Sydney, Australia, 9–13 Aug, 1999.
•
Cross-protection against challenge with Puumala virus after immunization with nucleocapsid
proteins from different hantaviruses. C. De carvalho Nicacio, M. Gonzalez Della Valle,
P.Padula, E. Björling, A. Plyusnin, and Å. Lundkvist. Negative strand viruses 2000, Quebec
City, Canada 26–29/6, 2000.
