Umeå Universitet
Biomedicinska analytikerprogrammet
Aktivering av T-cellsproliferation med konventionella
antigenet Purified Protein Derivative, mitogenet
Phytohemagglutinin och superantigenet
Staphylococcus aureus enterotoxin B
Årskull:
Laborationsrapport i Labmedicin II, termin 6
Laborationsdatum:
Handledare:
Inlämnad:
Godkänd:
Abstrakt
Toxiner är en virulensfaktor, som produceras av vissa typer av bakterier. Dessa kan delas in i två
grupper; endotoxiner och exotoxiner. Bland exotoxinerna finns så kallade superantigener som kan
aktivera T-cellsproliferationen genom att binda till utsidan av T-cellsreceptorn (TCR) och MHC klass
II, vilket skapar en kraftig T-cellsrespons med en massiv frisättning av cytokiner. Vid en
Staphylococcus aureus infektion kan detta bland annat orsaka ett tillstånd som kallas för Toxic Schock
Syndrome (TSS). Ett mitogen använder andra typer av mekanismer för att aktivera T-cellernas
proliferation, bland annat förändras aktiviteten hos jon-kanalerna, vilket skapar en miljö för delning.
Detektionen sker med 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) ELISA, där BrdU byggs in i DNAt hos cellerna
som prolifererar istället för tymin. Hypotesen är att den polyklonala stimuleringen från
Phytohemagglutinin (PHA) och Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) kommer ge en större och
snabbare proliferation än med det konventionella antigenet Purified Protein Derivative (PPD) både
efter 4 och 6 dygn.
Syftet med laborationen var att studera skillnaden i proliferationen hos T-lymfocyter med stimulans
från PHA, SEB och PPD, efter 4 och 6 dygns inkubation, med hjälp av BrdU ELISA.
Resultatet visade att celler som stimulerats med PHA hade den starkaste och snabbaste
proliferationen, och SEB var de som hade näst starkast. Koncentrationen celler minskade från dygn 4
till dygn 6, vilket kan förklaras med anergi eller otillräckligt med näring. PPD hade en långsam
proliferation som dock ökade från dygn 4 till dygn 6.
Nyckelord:
Proliferation, konventionellt protein, mitogen, superantigen, BrdU ELISA
1
Introduktion
När kroppen invaderas av mikroorganismer, avsett deras patogenicitet, är virulensfaktorerna hos
patogenen och värdens immunförsvar avgörande för resultatet. Mikroorganismers virulensfaktorer
kan vara till exempel ytproteiner, toxiner eller invasiner som kan underlätta vid infektionen eller för
att undkomma försvaret (1). Immunförsvaret är uppdelat i två delar – ett medfött och ett inducerat
försvar. Det medfödda är ospecifikt och agerar direkt mot en patogen men på samma sätt varje gång,
till skillnad från det adaptiva som tar längre tid på sig att mobilisera, men är antigenspecifikt. Efter en
infektion kan det adaptiva försvaret upprätta ett ”minne” för att snabbare kunna bekämpa patogenen
vid nästa infektionstillfälle (2). Just det adaptiva, cellmedierade immunförsvaret startar när en
bakterie infekterar kroppen och den plockas upp av en antigenpresenterande cell (APC). APC
sönderdelar och presenterar proteiner från bakterien på sin MHC klass II för T-cellsreceptorn (TCR)
på T-cellerna, som då aktiveras. Men för att T-cellen ska stimuleras och frisätta cytokiner, för att bland
annat aktivera andra typer av celler, så krävs det att TCR är specifik för just det antigenet som visas
upp på MHC klass II.
Som virulensfaktor kan vissa typer av bakterier producera toxiner. Toxinerna kan vara
lipopolysaccharider, så kallade endotoxiner, och frisätts då från bakteriens cellvägg. De kan också
bestå av proteiner som frisätts vid bakterietillväxt och lys, och benämns då som exotoxiner (3).
Toxinerna verkar på olika delar av kroppen och kan till exempel vara cytotoxiska, enterotoxiska,
neurotoxiska eller helt enkelt dödliga (3). De exotoxiner som aktiverar T-cellernas proliferation kallas
för superantigener, och finns hos några grampositiver såsom staphylokock enterotoxin (serotyperna AE, G, och H), grupp A streptokock pyrogenisk exotoxin (serotyperna A-C), staphylokock exfoliatin
toxin och staphylokock TSST-1 (3). Dessa pyrogeniska exotoxin stimulerar till frisättning av cytokiner
som kan leda till feber och i värsta fall orsaka chock hos individen (3). Ett superantigen behöver inte
samma specificitet som ett konventionellt antigen gör, utan inducerar en massiv T-cellsaktivering
genom att selektivt binda in till utsidan av den variabla delen hos TCR β-kedja (vβ-kedja) och MHC
klass II (4,5). Ett superantigen kan alltså aktivera fler T-celler än vad ett konventionellt antigen kan
(5). Som följd av stimuleringen sker en massiv frisättning av cytokiner (4) såsom IL-1, IL-6, TNF och
GM-CSF (5). Förutom aktiveringen av T-cellerna kan responsen leda till en vβ-specifik deletion av
celler eller anergi (6,7). Ett tillstånd av paralysering där T-cellerna inte svarar på stimuli till följd av en
ofullständig co-stimulering, men är förknippat med upprepade stimulanser av superantigen (8,7).
För att studera proliferationen av CD4+ T-celler in-vitro, används ett konventionellt protein; Purified
Protein Derivative (PPD), ett mitogen; Phytohemagglutinin (PHA) och ett superantigen;
Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)(9). PPD används vid Mantoux test (10) och fungerar som
ett konventionellt antigen. Om specificiteten överensstämmer sker en monoklonal stimulering av Tcellerna och det blir en begränsad aktivering, som vid en normal infektion in-vivo. PHA, ett mitogen
som kommer från röda kidney bönor (11), stimulerar T-cellerna till polyklonal expansion (4,12), och
aktiverar utan specificitet. PHA agerar bland annat genom att förändra aktiviteten hos jon-kanalerna,
vilket ökar den intracellulära koncentrationen av Ca2+ och då även proliferationen (13). Superantigener
kan verka utan specificiteten som krävs med konventionella antigen, dock måste vβ-kedjan hos TCR
2
passa för att bindningen ska kunna ske (14). SEB stimulerar till en polyklonal expansion och kan
aktivera uppemot var femte T-cell, många fler än ett konventionellt protein som verkar på 1/10000 Tceller (14). Detta ger en onormalt hög frisättning av cytokiner, vilket kan ge upphov till Toxic Schock
Syndrome (TSS).
Hypotesen utgår ifrån antigenernas egenskaper där PHA kan aktivera utan specificitet och kommer
därför att ha den snabbaste aktiveringen efter 4 dygn. SEB kommer också ha en snabb proliferation,
men kräver ändå en viss specificitet och kan därför inte aktivera alla T-celler. Därför kommer
koncentrationen vara högst hos SEB efter 6 dygn om inte cellerna går in i anergi. Eftersom PPD agerar
som ett konventionellt antigen, kommer aktiveringen av T-cellerna att ta ett par dagar, såsom det
adaptiva immunsvaret gör in-vivo. Därför kommer proliferationen öka från dygn 4 till dygn 6, men
inte lika mycket som PHA och SEB.
För att detektera proliferationen används 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) ELISA (15) som är ett
icke-radioaktivt substitut till [3H]-thymidine och inkorporeras i de prolifererande cellernas DNA
istället för tymin. Efter cellerna har fixerats måste DNA denatureras för att antikropparna (anti-BrdUPOD) ska kunna binda in till det BrdU som inkorporerats i DNAt. Substratet tetrametyl-benzidin
(TMB) bildar en färgad produkt vid kontakt med immunkomplexen som bildats och genom att mäta
absorbansen kan en kvantifiering göras. Den avlästa absorbansen korrelerar med proliferationen (15),
där ett högre absorbansvärde innebär mer CD4+ T-celler. Blank-proverna kommer att ge information
om ospecifik bindning av BrdU och då också antikropparna, medan bakgrunds-proverna avslöjar om
det skett en ospecifik bindning av anti-BrdU-POD, och fungerar därför som kontroller.
Syftet med laborationen var att studera skillnaden i proliferationen hos T-lymfocyter med stimulans av
PPD, PHA och SEB, efter 4 och 6 dygns inkubation, med hjälp av BrdU ELISA.
Material och Metod
Celler
Mononukleära celler från venprov i CPT-rör.
Rening av celler
CPT-röret centrifugerades i 30 minuter vid 1510 RCF utan broms och de mononukleära cellerna
överfördes till ett sterilt 15 ml centrifugrör. Ca 14 ml steril PBS tillfördes cellerna och centrifugerades i
15 minuter vid 300 RCF med broms. Supernatanten avlägsnades och cellerna resuspenderades med
vortex innan 10 ml steril PBS tillsattes och röret centrifugerades i 10 minuter vid 300 RCF med broms.
Koncentrationsbestämning
Efter supernatanten tagits bort resuspenderades cellerna upptill ca fem ml med RPMI-medium
(RPMI-1640, 10% fetalt kalv serum (FCS), Penicillin/Streptomycin (100 units/ml penicillin och 100
µg/ml Streptomycin)). 10µl applicerades på Bürkers kammare och antalet mononukleära celler i 16 Brutor räknades. Cellerna späddes 1:10 till slutkoncentrationen 0,3 * 10^5 celler/ml.
3
Utodling
50 µl celler tillsattes till varje brunn på de två cellodlingsplattorna enligt B2-B11, C2-C11 och 100 µl
celler till brunnarna E4-E5 (bakgrund). 50 µl av SEB med koncentrationen 20 ng/ml tillsattes till
brunn C2-C6, PHA och PPD, båda med koncentrationen 10 µg/ml, tillsattes till B2-B6 respektive C7C11. Till brunn B7-B11 (noll-brunnar) tillsattes 50 µl RPMI-medium och till brunn E2-E3 tillsattes 100
µl (blank). 200 µl sterilt vatten applicerades i brunnarna runt provbrunnarna och plattorna
inkuberades i 37°C i 5% CO2 i 4 respektive 6 dygn.
BrdU
10 µl BrdU labeling solution (10 mM 5-bromo-2´-deoxyuridine i PBS, Roche Diagnositics GmbH,
Penzberg,Tyskland) applicerades till brunnarna innehållande celler, med en slutkoncentration på 10
µM BrdU. Plattan återinkuberades därefter i 37°C i 5% CO2 i ungefär fyra timmar. Lösningen i
brunnarna blandades om med en pipett och centrifugerades vid 300 g i 10 minuter. Lösningen
dekanterades från brunnarna och cellerna torkades med en hårtork i ca 15 minuter innan plattan
placerades i kylskåp för längre förvaring.
ELISA
200 µl FixDenat applicerades till alla brunnarna och inkuberades i 30 minuter i rumstemperatur.
FixDenat hälldes bort innan 100 µl anti-BrdU-POD working solution (Anti-BrdU-POD Stock Solution
spädd 1:100 med antibody dilution solution) applicerades till brunnarna och inkuberades i 90 minuter
i rumstemperatur. Innehållet hälldes bort och brunnarna tvättades tre gånger med 200 µl Washing
solution (Dilute Washing buffer concentrate spädd 1:10 med destillerat vatten). 100 µl Substrate
solution tillsattes till brunnarna och inkuberades i rumstemperatur i 10 minuter innan 25 µl 1 M
H2SO4 (stop solution) tillsattes och plattan avlästes i spektrofotometer (Labsystem Multiskan PLUS)
vid 450 nm.
Statistik
Q-test utfördes för att undersöka om extremvärden kunde strykas. F-test och t-test användes för att
undersöka om spridningen och medelvärdena för respektive antigen hade förändrats från dygn 4 till
dygn 6. Ytterligare tester med Mann Whitney U-test analyserade om det fanns en signifikant skillnad i
medelvärdena hos respektive antigen. Vid undersökning av alla antigen tillsammans användes Anova
One Way test för att undresöka om det fanns en signifikant skillnad och Post Hoc (Bonferroni)
fastställde var den signifikanta skillnaden fanns. SPSS Statisics 17.0 och Excel 2003 användes vid
analyserna.
4
Resultat
De beräknade värden för medelvärde och median var jämna för PHA och PPD för både 4 och 6 dygn,
och för SEB och Noll efter 6 dygn. Medelvärdet och medianen visade på en ojämn fördelning hos SEB
och Noll efter 4 dygns inkubation, och absorbansvärdet 0,157 kunde strykas från resultatet för Noll,
vilket gav ett nytt medelvärde på 0,0583, median 0,0585 och standardavvikelse 0,0097. Vid analys av
skillnaden i spridningen hos absorbansvärdena för varje antigen mellan dygn 4 och dygn 6, fanns
ingen signifikant skillnad (p>0,05). En signifikant skillnad i medelvärde (p<0,05) fanns hos PHA, PPD
och SEB, men inte hos Noll. PHA hade signifikant högre medelvärde dygn 4 än dygn 6 (p=0,009),
vilket även SEB (p=0,047) hade, till skillnad från PPD vars medelvärde var signifikant högre dygn 6 än
dygn 4 (p=0,016). Ett högre medelvärde kunde ses dygn 6 än dygn 4 för Noll, men det fanns ingen
signifikant skillnad (p=0,065), Tabell 2. Vid jämförelse av alla antigen mot varandra fanns en
signifikant skillnad i medelvärde (p=7*10^-15), där största skillnaden fanns mellan PHA och Noll
(p=2,34*10^-14), och minsta skillnaden mellan PHA och SEB (p=0,004), Figur 1. Inga Blank- eller
Bakgrundsprover kontrollerades för ospecifik inbindning.
Diskussion
Medelvärdet och medianen visade på fördelningen av absorbansvärdena, ju närmre varandra de ligger
desto jämnare är fördelningen. Eftersom värdena för SEB och Noll efter 4 dygn var ojämn så utfördes
Q-test, där 0,157 kunde strykas och den nya beskrivande statistiken visade på en jämnare fördelning.
När respektive antigens absorbansvärden från dygn 4 och dygn 6 jämfördes så fanns en signifikant
skillnad för PHA, PPD och SEB, men inte för Noll. Det innebär att förändringen i medelvärdet mellan
dygnen i Noll brunnarna berodde på slumpen. Detta eftersom det egentligen inte borde vara någon
skillnad eftersom det inte skett någon aktivering i Noll brunnarna för de innehöll endast celler och
odlingsmedium. Om ett absorbansvärde för utgångskoncentrationerna i brunnarna funnits, hade man
kunnat se om det skett någon proliferation i Noll brunnarna. Proliferationen hade i sånt fall kunnat
bero på redan aktiverade T-celler in-vivo eller IL-2 i provet som aktiverade in-vitro. Den minskning
som skett från dygn 4 till dygn 6 kan förklaras med näringsbrist och den celldöd som sker naturligt.
Den största skillnaden fanns mellan Noll och PHA, vilket innebär att den största proliferationen skett
bland cellerna som aktiverats med PHA, såsom i hypotesen. Mitogenet stimulerar utan specificitet och
kan därför snabbt aktivera alla T-celler i brunnarna, till skillnad från SEB, som också hade en snabb
proliferation, som kräver en specificitet i vβ-kedjan hos TCR. PPD verkar som ett konventionellt
antigen och hade därför en mindre och långsammare aktivering än både PHA och SEB. Normalt tas
antigenen upp via APC innan det visas upp i MHC klass II för TCR, vilket dels ger ett fördröjt
immunsvar, men också ett kontrollerat sådant, tills cellerna har förstört det främmande antigenet.
Därför skedde aldrig den massiva ökningen av T-celler som man kunde se för PHA och SEB. Däremot
skedde en ökning från dygn 4 till dygn 6 med PPD, medan en minskning kunde ses för både mitogenet
och superantigenet. Detta kan bero på att den massiva cellproliferationen gjorde slut på näringen i
odlingsmediumet och cellerna går in i apoptos, vilket inte förutsågs i hypotesen. Minskningen kan
5
även bero på att cellerna gick in i anergi på grund av den ofullständiga co-stimuleringen, men med
SEB har forskning visat att det krävs upprepade behandlingar med superantigenet innan cellerna går
in i anergi (8).
Trots att den starkaste proliferationen skedde med mitogenet, så användes en högre koncentration av
PHA (10 µg/ml) än för SEB (20 ng/ml), vilket skulle kunna vara anledningen till den större
aktiveringen. Om man däremot applicerade samma koncentration av SEB till cellerna finns en risk att
det skulle varit direkt letalt på grund av den massiva stimuleringen och bristen på näring som då skulle
uppstå. Om man istället skulle använt en lägre koncentration av PHA och PPD, finns en risk att
proliferationen blivit så liten att den inte kunnat detekteras alls. Så frågan är ifall resultaten för PHA
och PPD i överhuvudtaget är jämförbara med SEB. Ett fastställande av vilka koncentrationer av PHA,
PPD och SEB som är jämförbara krävs innan laborationen. En felkälla till laborationen var själva
detektionsmetoden med BrdU ELISA. Detta eftersom det finns två sorter; colormetric och
chemiluminescence, där forskning visat att chemiluminescence metoden är känsligare vid mätningar
av cellers proliferation (16). Kanske kunde laborationen utförts med båda typer av detektionssystem
för att kunna jämföra resultaten.
Som slutsats kan man se att den starkaste proliferationen av T-celler skedde med PHA och SEB,
eftersom de kan aktivera T-celler utan specificitet respektive mindre specificitet. SEB kräver en viss
specificitet i vβ-kedjan hos TCR och kan därför inte aktivera alla T-celler, men för både mitogenet och
superantigenet fås en polyklonal ökning. De sjunkande absorbansvärdena visade på anergi eller
otillräcklig näringsmängd i brunnarna med PHA, SEB och Noll. PPD verkade som ett konventionellt
antigen, vilket kräver en specificitet mellan antigenet och TCR, och endast en monoklonal stimulering
skedde. Men man kunde se en ökning från dygn 4 till dygn 6. Noll brunnarna innehöll förutom celler
endast odlingsmedium, där proliferationen förklardes med redan aktiverade T-celler in-vivo eller IL-2
cytokiner från blod som aktiverade in-vitro. Dock användes en högre koncentration av både PHA och
PPD, än SEB. Men varken en ökad koncentration av SEB eller en minskad koncentration av PHA eller
PPD skulle varit gynnande för laborationen.
6
Tabeller och Figurer
Tabell 1. Visar uppmätta absorbansvärden för respektive antigen vid 4 och 6 dygns inkubation.
Beskrivande statistik i form av medelvärde, median och standardavvikelse har inkluderats.
Antigen
Dygn
Absorbans (450nm)
2
3
4
1,091
0,997
0,947
0,745
0,856
0,888
5
0,889
0,679
Medelvärde Median
1,020
0,798
0,997
0,823
0,115
0,085
Std.av
PHA
4
6
1
1,178
0,823
PPD
4
6
0,198
0,427
0,257
0,394
0,143
0,299
0,317
0,412
0,099
0,345
0,203
0,375
0,198
0,394
0,087
0,053
SEB
4
6
0,849
0,455
0,934
0,399
0,522**
0,644
0,978
0,602
0,812
0,534
0,819
0,527
0,849
0,534
0,179
0,101
0,052
0,078
0,065
0,045
4
0,065
0,048
0,068
0,157*
6
0,044
0,039
0,056
0,048
0,029
0,043
0,044
0,01
*) Absorbansvärde som kunde strykas med Q-test, vilket ger det nya medelvärdet 0,0583, medianen
Noll
0,0585 och standardavvikelsen 0,0097.
**) Absorbansvärde som inte kunde strykas med Q-test.
Tabell 2. Beräknade p-värden för F-test, t-test och Mann Whitney U-test, för respektive antigen.
Signifikant skillnad gäller för p<0,05.
PHA
PPD
SEB
Noll
F-test
0,461
0,295
0,477
0,782
p-värden
t-test
0,008
0,005
0,013
0,059
U-test
0,009
0,016
0,047
0,065
7
Figur 1. Visar de uppmätta absorbansvärdena grupperade efter respektive antigen; Noll, PHA, PPD och
SEB, och inkubationstiden; 4 dygn och 6 dygn. p-värden för den signifikanta skillnaden mellan Noll
och PHA respektive PHA och SEB är inkluderade.
*) En outlier, men som inte kunde strykas med Q-test.
Referenser
1. Todar K, Ph.D. 2011. Staphylococcus aureus. Todar’s Online Textbook of Bacteriology. <
http://www.textbookofbacteriology.net/staph_2.html> (Hämtad 2011-03-15)
2. Todar K, Ph.D. 2011. Immune Defence against Bacterial Pathogens: Innate Immunity. Todar’s
Online Textbook of Bacteriology. <http://www.textbookofbacteriology.net/innate.html>
3. Todar K, Ph.D. 2011. Bacterial Protein Toxins. Todar’s Online Textbook of Bacteriology.
<http://www.textbookofbacteriology.net/proteintoxins.html> (Hämtad 2011-03-06)
4. Norrby-Teglund A et al. 1994. Superantigenic properties of the group A streptococcal exotoxin SpeF
(MF). Infect Immun. 62(12): 5227 – 5233. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7960098>
5. Hemalatha V et al. 2004. Superantigens – Concepts, clinical disease and therapy. Indian Journal of
Macrobiology. 22(4): 204 – 211. <http://www.ijmm.org/article.asp?issn=02550857;year=2004;volume=22;issue=4;spage=204;epage=211;aulast=Hemalatha>
6. Watson AR och Lee. 2006. Defective T cell receptor-mediated transduction in memory CD4 T
lymfocytes exposed to superantigen or anti-T cell receptor antibodies. Cell Immunol. 242(2): 80 – 90.
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17083922>
8
7. Vaishnani J. 2009. Superantigen. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology.
75(5): 540 – 544. <http://www.ijdvl.com/article.asp?issn=03786323;year=2009;volume=75;issue=5;spage=540;epage=544;aulast=Vaishnani>
8. Huang Y et al. 2007. Response of T cells in vivo induced by repeated superantigen treatments at
different time intervals. Acta Biochim Biophys Sin. 39(7): 467 – 474.
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17622466>
9-. Dinges M et al. 2000. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology Reviews. 13(1): 16
– 34. <http://cmr.asm.org/cgi/content/full/13/1/16?view=full&pmid=10627489>
10. Todar K, Ph.D. 2011. Immune Defence against Bacterial Pathogenes: Adaptive or Acquried
Immunity. Todar’s Online Textbook of Bacteriology.
<http://www.textbookofbacteriology.net/adaptive_6.html> (Hämtad 2011-03-06)
11. Kosti O et al. 2010. Phytohemagglutinin-induced mitotic index in blood lymphocytes: a potential
biomarker for breast cancer risk. Breast Cancer (Auckl). 15(4): 73 – 83.
<http://proxy.ub.umu.se:2061/pubmed/21234289>
12. Houghton Mifflin Company. 2004. Mitogen. The American Heritage Medical Dictionary.
<http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/mitogen> (Hämtad 2011-03-06)
13. Pieri C et al. 1992. The response of human lymfocytes to phytohemagglutinin is impaired at
different levels during aging. Ann N Y Acad Sci. 26(673): 110 – 119.
<http://proxy.ub.umu.se:2061/pubmed/1485708>
14. Todar K, Ph.D. 2011. Staphylococcus. Todar’s Online Textbook of Bacteriology.
<http://textbookofbacteriology.net/staph_4.html> (Hämtad 2011-03-06)
15. Roche Diagnostics. Product Page: Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric). Roche Applied
Sciences. <https://www.roche-appliedscience.com/servlet/RCProductDisplay?storeId=10151&catalogId=10151&langId=1&countryId=se&forCountryId=se&productId=3.5.3.21.1.8> (Hämtad 2011-03-08)
16. Profit S och Unteregger G. 2001. Quantitative Measurement of Cell Proliferation Using the BrdU
ELISA: A Comparison Between Colorimetric and Chemiluminesent Detection. BIOCHEMICA. 4.
9
