17-05-31
Stamceller i farmaceutisk
forskning
Camilla Svensson
[email protected]
Rekommenderad läsning:
• http://stemcells.nih.gov/
• http://www.nature.com/reviews/focus/stemcells/index.html
• www.genteknik.nu
Science 22 June 2012: Vol. 336 no. 6088 p. 1599 – Booklet
"Stem cells in review" (flera intressanta artiklar tex om iPSC)
• Stamceller-en introduktion
• Använding av stamceller i läkemedelsforskning
Möjligheter, utmaningar och risker
1
17-05-31
Introduktion
Stamcell:
• har obegränsad möjlighet att
förnya sig själv utan att åldras
• kan differentiera till en eller flera
olika celltyper in vivo och in vitro
Totipotent
(omnipotent)
det befruktade ägget, morulans cellmassa
Kan bilda alla kroppens celler och celler i
placentan
Pluripotent
kan bilda många olika celltyper
t ex Embryonala stamceller
Unipotent ex. Erytroid progenitor --> erytocyt
Embryonala stamceller (ES celler)
Morula
Befruktat ägg
Blastocyst
Embryonala stamceller
Trofoblast
placenta
Self-renewal
BMP (bone morphogenic protein)
och LIF (leukemia inhibitory factor)
Feeder cells
(Embryonala fibroblaster)
Spontan differentiering
i frånvaro av LIF
Mesoderm
Ben, brosk, kärl,
Blodceller, muskler,
hud (dermis)
Endoderm
Mage, tarmar, lungor
Ectoderm
Hud (epidermis),
nervsystem
2
17-05-31
Två olika protokoll för differentiering av ES celler
Hematopoies in vitro
DX5
T ex från benmärg, fosterlever,
eller differentierade från ES celler
IL-7
B220
IL-2/IL-15
CD90
CD45R
Ter119
Flt-3L/IL-7
1-2 veckor
NK celler
CD19
Hematopoietiska
stamceller
B celler
Erytrocyter
epo
OP9 celler
CD45
(stromacellinje
från benmärg)
17.4
(M-CSF-/-)
35.6
CD4
IL-7
OP9-Delta-like(DL)1 celler
T celler!
43.2
CD8
3.74
3
17-05-31
Använding av ES celler i läkemedelsutveckling:
- möjligheter
Exempel på använding inom
drug discovery & development
• identifiering av targets
- t ex en ny receptor som reglerar differentiering till
en nervcell
• identifiering av substanser som verkar på denna receptor
• karakterisering av mekanismer/ farmakologi/toxikologi
Nackdelar: Ej lika komplext som in vivo studier
Från stamcell till T cell in vitro:
några applikationer
Utvärdering av
immuntoxisk potential
Hematopoietiska
stamceller
ES celler
OP9-DL1
Exponering med
testsubstans/vehikel
OP9-DL1
Utredning av
molekylära mekanismer ,
Designa T celler
Manipulering av stamceller:
uttryck/nedreglering av
potentiella målgener genom genterapi
eller ”genome editing”
Manipulering av kulturen:
• antikroppar
• cytokiner
• farmakologiska inhibitorer
och agonister
• siRNA
ANALYS: • Fenotyp (flödescytometri)
dag 5-21 • Genuttryck cch cellsignallering med western blot,
RT-PCR, microarray, mm
• Funktionella studier
Camilla Svensson 2006
4
17-05-31
Utmaningar: terapeutisk kloning
Att uttnyttja genetiskt material från en patient för att utveckla
“reservdelar” till denna person
• Somatisk kärnöverföring: “gammalt” patient DNA förs in i en
tömd äggcell
OBS! Viktigt att förstå epigenetisk reprogrammering av
arvsmassan. Miljön i ägget påverkar vilka gener som är aktiva.
iPSCs - inducerade pluripotenta stamceller
Adulta somatiska celler från patient (tex fibroblaster) reprogrammeras
genom att inducera uttryck av “stamcellsgener”.
Inga äggceller behövs.
-> cell med liknande egenskaper som embryonal stamcell (eller?)
Exempel på gener som bidrar till stamcellegenskaper:
transkriptionsfaktorerna Oct 3/4, klf4, sox2, c-myc, Nanog, LIN28
(OKSM)
Olika metoder finns att uttrycka dessa gener- med olika för och
nackdelar:
- Viral transduktion (retrovirus/lentivirus vs adenovirus, sendaivirus)
- plasmider, transposoner, Naket DNA (elektroporering)
- RNA (med stabiliserande modifikationer)
- Rekombinanta proteiner (med polyargininankare)
- Kemikalier som härmar dessa transkriptionsfaktorer.
5
17-05-31
iPSC – vilka hinder finns på vägen
Oklart om dessa celler fullt ut motsvarar ESC
(testas genom genotypning och funktionell karakterisering)
.
Vilka möjliga risker finns (kopplade till genereringen av iPSC)?
- Risk för "insertional mutagenesis" vid framställning av iPSC
med hjälp av retrovirus och lentivirus.
- Åldrat DNA – tumörrisk?
För klinisk användning måste tillverkningen (generering,
expandering, differentiering) ske enligt good manufacturing
practice.
Kan cellerna etablera sig och överleva in vivo?
Risker med användning av (stam)cellsterapi
• immunologiska reaktioner
• odifferentierade celler -> potentiell risk för okontrollerad
differentiering och proliferation
• risk för att celler hamnar på fel plats
• Smittspridning, överföring av genetiska defekter
Åtgärd: Höga krav på tillverkning (good manufacturing practise),
kontroll och karakterisering av cellterapiprodukten (t ex av proliferation,
differentiering, kromosomanalys in vivo). Riktlinjer från EMA
Matchning/manipulering av MHC uttryck
Etik: Missbruk av teknikerna- kloning av människor
Regleras i lagar och förordningar, skillnader mellan olika länder.
6
17-05-31
Cellterapi i klinik:
Cellerna kan komma från: patienten (autologa) eller
från ej genetiskt identisk donator (allogena celler).
Få exempel på cellterapier baserad på embryonala stamceller.
Prövas för flera olika sjukdomstillståd, t ex:
• knäskador (nybildning av brosk med kondrocyter)
• hjärtinfarkt
• parkinsson
• ryggmärgsskador
• diabetes mellitus
• makulär degeneration
• tumörsjukdomar
Cellterapi vid cardiovaskulär sjukdom
7
17-05-31
Användning av iPS celler för behandling av
svårkontrollerad typ 1 diabetes
PATIENT
1. Biopsi
4. Implantering
2. Induktion av stamcellsegenskaper
-> iPS celler
3. Stegvis stimulering av cellerna med
faktorer som inducerar utmognad till
betaceller*
Läs mer
• http://hsci.harvard.edu/diabetes-0
• Sudhanshu P et al. PLOS ONE, 2015; 10 (1):e0116582
8
