Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Riktade mutationer i GC-rkit DNA
Magnus Green
Alla organismers ärftliga information lagras i varje enskild cell i form av DNA (deoxyribonukleinsyra ).
DNA består av fyra stycken olika byggklossar som upprepas i olika kombinationer. Byggklossarna kallas
nukleotider och är uppbyggda av en sockergrupp, en fosfatgrupp och en av de fyra kvävebaserna adenin (A),
tymin (T), guanin (G) eller cytosin (C). När nukleotidernnas fosfatgrupper binds ihop bildas långa
spiralformade kedjor. Varje kedja sitter ihop med en annan komplementär DNA-kedja och bildar
dubbelsträngat DNA. De komplementära DNA-kedjorna hålls ihop genom att A binder med T och G med C,
de kallas AT-baspar respektive GC-baspar. GC-basparens bindning är mycket starkare än AT-basparens
bindning. När cellen tillverkar proteiner används olika begränsade delar av DNA-sekvensen som mall. En
sådan begränsad sekvens kallas för en gen. DNA är en mall för mRNA som också består av nukleotider,
mRNA är i sin tur en mall för proteinsyntesen. Nukleotiderna i mRNA delas in i tripletter som kallas kodon.
Varje kodon kodar för en av 20 aminosyror. Aminosyror är byggklossarna i proteiner, de kopplas ihop efter
varandra och veckas ihop till ett protein. Om ett protein påskyndar eller på annat sätt påverkar en kemisk
reaktion kallas proteinet för ett enzym.
Cellulosa och hemicellulosa är polysackarider som utgör ca 70% av innehållet i träd och plantor. När träd
och plantor förmultnar bryts de ner av enzymer till enstaka molekyler. Enzymerna tillverkas i celler. De är
antingen verksamma i cellen eller så utsöndras de från cellen och är då verksamma utanför cellen. I det här
arbetet har en gensekvens, man26a, amplifierats genom en metod som heter Polymerase Chain Reaction
(PCR). Gensekvensen kodar för ett enzym som heter b-mannase och kommer från en bakterie som heter
Cellulomonas fimi. b-mannase är ett enzym som deltar i nedbrytningsprocessen av hemicellulosor. Enzymet
utsöndras från C. fimi som är vanligt förekommande i miljöer rika på förmultnande trä- och växtmaterial.
DNA-polymeras är ett enzym som kopierar DNA. När polymeras kopierar DNA delar det först på det
dubbelsträngade DNA:t och sedan använder det de båda enkelsträngade DNA-kedjorna som mallar för att
göra två komplementära DNA-kedjor. Denna reaktion går även att göra laborativt (in vitro). In vitro blandas
DNA-polymeras, de fyra nukleotiderna, dubbelsträngat DNA och små DNA-bitar som kallas primers. En
primer är cirka tjugo nukleotider lång och är specifikt komplementär mot en del av DNA:t i samma lösning.
Lösningen värms upp så att DNA denaturerar och bli enkelsträngat. Sedan sänks temperaturen och primer
sekvenserna binder in till DNA:t. Polymeraset binder in till primern och använder DNA:t som mall när den
förlänger primern. På detta sätt kopieras DNA:t. Uppvärmning, nedkylning och förlängning kallas för en
PCR cykel och upprepas flera gånger varpå antalet DNA-kopior ökar. Om en förändring av
nukleotidsekvensen introduceras i primern resulterar det i en punktmutation i det kopierade DNA:t. Detta i
sin tur innebär även att det blir en förändring av aminosyrasekvensen när DNA:t översätts till aminosyror i
enzymsyntesen. Slutresultatet blir ett muterat enzym. Muterade enzym är viktiga i enzymforskningen. När ett
muterat enzym jämförs med ett icke muterat enzym kan det ge information om det omuterade enzymets
egenskaper och funktioner.
I detta arbete användes en PCR metod som heter Quick Change PCR för att introducera en punktmutation i
man26a genen. I den här metoden är genen som ska amplifieras insatt i en plasmid. En plasmid är
dubbellsträngat cirkulärt DNA. Ju högre procent GC-baspar DNA:t som ska kopieras har ju svårare är det att
denaturera DNA:t till enkelsträngat DNA vid uppvärmning. Gensekvensen man26a har ett högt GC-innehåll
och är därför komplicerad att amplifiera. Dessutom har området där primerna ska binda in till DNA:t extremt
högt GC-innehåll vilket försvårar PCR:n ytterligare. Ofta är det nödvändigt att tillsätta ett ämne som
underlättar denatureringen av DNA, som har högt GC-innehåll, för att lyckas med en PCR. Med den
plasmiden som användes här räckte det dock inte att tillsätta ett ämne, utan det krävdes en kombination av
två ämnen för att det slutligen skulle lyckas. I detta arbete finns en beskrivning av hur bestämda
koncentrationer av dimetylsulfoxid (DMSO) och betaine tillsatts en PCR-reaktion och därmed löst problemet
med GC-rikt templat och GC-rika primers.
Swedish official title: Punktmutation på den GC-rika man26A genen från Cellulomonas fimi
Swedish credits: 20p
E-mail address of first author: [email protected]
Supervisor: Henrik Stålbrand, Lund University, Dept of Biochemistry
Submission date/time: 2003-12-09
Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Site directed mutagenesis on the GC-rich man26A gene from
Cellulomonas fimi
Magnus Green
Chemistry, Biochemistry
Spring 2003
Abstract in English
Hemicelluloses are branched heteropolysaccharides that comprises 20-30 % of the softwood
content. The two main hemicelluloses are heteroxylans and heteromannans. One such
heteromannan is galactoglucomannan which comprise 20 % of the soft wood content. The key
depolymerazing enzyme of mannan-based polysaccharides like galactoglucomannan is endo-1,4-bmannanase. It randomly cleaves 1, 4-b-D-mannosidic linkages within the backbone of the
polysaccharide. This makes Endo-1,4-b-mannanase very important in the decomposition process of
dead and decaying wood and plant material. A microorganism that secretes endo-1,4-b-mannanase
and is common in environments rich in decaying plant material is Cellulomonas fimi. The gene
man26a from C. fimi encodes a modular b-mannanase. It has a catalytic module that belongs to
family 26 of glycoside hydrolases, a mannan binding module (MBM) and two additional modules
of unknown functions. The aim of this work was to construct an expression vector enabling the
production of a protein comprised of the catalytic module and the mannan-binding module of C.
fimi Man26a (i.e amino acid no: 1-690). For this a plasmid PCR procedure was used. However,
probably due to the high GC-content, this was not straightforward. The work describes how DMSO
(2%) and betaine (1.8 M) were used to make a PCR reaction with plasmid containing the GC-rich
(73%) man26a gene as template and with GC-rich (84%) mutated primers successful, when using
Quick Changeâ PCR plasmid amplification site directed mutagenesis. Unfortunately further
microbiological work on the plasmid failed after the PCR step. Therefore a number of trials were
set up to bring light on why further work failed. These trials showed that restriction enzymes
maintain their specificity but loose some efficiency when operating on plasmids suspended in
DMSO and betaine. And that the restriction enzymes efficiency is higher if the
plasmid/DMSO/betaine-solution been heated then not heated prior restriction. Furthermore it was
shown that restriction only worked on heat-denatured plasmids if the plasmids were suspended in
DMSO and betaine when heat-denaturalized. A transformation capability trial gave similar result.
Transformations with plasmids that been heat-denaturalized in betaine and DMSO suspension gave
more tenfold more transformants than plasmids suspended in ddH2O when heat-denaturalized.
