Utveckling av en in vitro-modell för studier av åldersdiabetes-relaterad neuropati.
Anna Forsby
Institutionen för Neurokemi och neurotoxikologi
Stockholms Universitet
106 91 Stockholm
Projekt: 15/99
Nyckelord: diabetes, nervceller
Syfte: att vidareutveckla och karaktärisera en in vitro-modell för studier av neuronal degeneration som
uppkommer i samband med diabetes, typ 2.
Resultat: Under året har vi undersökt hur humana neuroblastorna SH-SYSY celler svarar på
exponering med olika koncentrationer insulin och insulin-like growth factor, type I (IGF-I) med
avseende på tillväxt (fig. 1) och differentiering (neuritutväxt).
Fig. 1. The effect on the total protein content in SH-SY5Y cells after 72 hrs of incubation with insulin, IGF-I and
the truncated IGF-I(l-69) in serum-free medium. The results are expressed as percent of protein content at the
start of incubation
Uttrycket av insulinreceptorer och receptorer för IGF-I karaktäriserades i SH-SY5Y cellerna och
resultaten visade att mängden respektive receptorer nedreglerades efter inkubation med höga
koncentrationer insulin och IGF-I. De sammantagna resultaten tyder på att cellerna uttrycker
funktionella receptorer och kan därmed användas vid studier av uppkomst av insulinresistens, vilket är
en mycket starkt bidragande orsak till utveckling av diabetes, typ 2. Vi har dessutom undersökt
uttrycket av det mitokondriella "uncoupling" proteinet UCP3 i SH-SY5Y cellerna och noterat att detta
ökar efter inkubering med låga koncentrationer IGF-I och höga koncentrationer insulin, vilket tyder på
att detta sker via IGF-I-receptorn eftersom insulin i höga koncentrationer även aktiverar IGF-Ireceptorn.
Obehandlad diabetes karaktäriseras av höga koncentrationer glukos i blodplasma, vilket leder till
sekundära effekter i blodkärlsendotel, njurar, perifera nerver och retina. Med hjälp av högt
differentierade (vitamin A-syrabehandlade) SH-SY5Y celler som odlas i serumfritt medium visade det
sig vara möjligt att undersöka hur höga koncentrationer glukos påverkade cellkroppar och neuriter.
Cellinjer, som är transformerade celler eller tumörceller, svarar normalt på förhöjda glukoshalter
genom att öka proliferationshastigheten pga den ökade energitillförseln. Detta är ett tecken på
anaerob metabolism, något som inte sker i normala nervceller. Vi tolkar resultaten som att de högt
differentierade SH-SY5Y cellerna kan användas som modell för studier av glukosinducerad neuronal
degeneration.
Vi har även undersökt hur cellerna påverkas av insulin och IGF-I under höga glukoskoncentrationer.
Resultaten visade att IGF-1 skyddade cellerna mot glukostoxicitet (fig. 2).
Fig. 2. Highly differentiated human neuroblastorna SH-SY5Y cells cultured in N2-RA medium for 6 days before
exposure with 30 mM glucose for 72 hours in defined N2 medium with a) 8.6 nM insulin and b) 10 nM IGF-I.
Eftersom IGF-I även uppreglerade UCP3 och UCP3 förmodas verka som skydd mot oxidativ stress,
som induceras av förhöjda glukoshalter, kommer vi att undersöka om UCP3 kan skydda cellerna vid
IGF-I-behandling. Uttrycket av IGF-I och dess receptorer har visats vara nedreglerade vid diabetes
och det har även visats att IGF-I kan stimulera återbildning av nerver hos diabetespatienter.
Inledande försök visar att det är möjligt att studera förändringar i mitokondriernas membranpotential
över innermembranet (∆Ym), dels i hela celler, dels i isolerade mitochondrier. Vi har färgat in
mitokondriernas innermembran med rhodamine 123 och MitoTrackerRed® och mätt fluorescensen
före och efter tillsats av den kemiska ”uncouplern” CCCP som sänkte fluorescensintensiteten eftersom
∆Ym gick mot noll.
Slutsats: Vi har visat att de humana neuroblastorna SH-SY5Y cellerna är mycket lämpliga som
modell för studier av diabetes-relaterad neuronal degeneration. Det är känt sedan tidigare att cellerna
kan användas som modell för kvantifiering av axonopati som inducerats av kemikalier (DeJongh et al.,
1999; Nordin-Andersson et al., 1998; Forsby et al., 1995) och de nyfunna egenskaperna understryker
ytterligare möjligheten att studera axonal degeneration in vitro.
Referenser:
DeJongh J., Nordin Andersson M., Ploeger B.A. and Forsby A. (1999). Estimation of systemic toxicity
of acrylamide by integration of in vitro toxicity data with kinetic simulations. Toxicology and Applied
Toxicology, 13, 261-268.
Forsby A., Pilli E, Bianchi V. and Walum. E.(1995). Determinations of critical cellular neurotoxic
concentrations in human neuroblastorna (SH-SY5Y) cell cultures. ATLA 23, 800-811.
Nordin-Andersson M., Forsby A., Heldring N., DeJongh J, Kjellstrand P. and Walum E. (1998) Neurite
degeneration in differentiated human neuroblastorna cells. Toxicology in vitro, 12, 557-560.
Publicerade arbeten under perioden:
DeJongh J., Nordin Andersson M., Ploeger B.A. and Forsby A. (1999). Estimation of systemic toxicity
of acrylamide by integration of in vitro toxicity data with kinetic simulations. Toxicology and Applied
Toxicology, 13, 261-268.
Gustafsson H., Adamson L., Hedander L, Wilcke M., Walum E. and Forsby A.(1999). Insulin-mediated
regulation of UCP expression in human neuroblastorna SH-SY5Y cells. Abstract at 17th SSCT
workshop, Röstånga, Sweden.
Gustafsson H. and Forsby A. (2000). Insulin and IGF-l-mediated regulation of uncoupling protein 3
expression in human neuroblastorna SH-SY5Y cells. Manuscript in preparation.
Adamson L., Hedander L, Forsby A., Gustafsson M, and Walum E. (2000). Expression of uncoupling
proteins in human neuroblastorna SH-SY5Y cells. Keystone symposium on Diabetes mellitus, 00021622, New Mexico, USA.
Lavett M. (2000). The effect of the sesquiterpene polygodial on mitochondrial and cellular membranes
in human neuroblastorna SH-SY5Y cells. Undergraduate thesis,pp.33, Stockholm University.
Söderdahl T. (2000). Effects of hyperglycaemia on UCP3 protein expression and activity.
Undergraduate thesis, Stockholm University. To be presented in June-2000.
