Per Olcén
Datum: 2009-03-10
Sidan 1 av 9
Neisseria meningitidis 2008
Årsrapport avseende
serogruppering, serotypning, genosubtypning och antibiotikakänslighet hos svenska Neisseria meningitidis stammar samt
direkt PCR diagnostik vid bakteriell meningit.
Totalt har 81 N. meningitidis (MC)-isolat från 76 patienter insänts från de kliniska mikrobiologiska
laboratorierna i landet och undersökts i Örebro under 2008. Isolat från likvor och/eller blod har karakteriserats från totalt 38 patienter. Den samlade bilden av invasiv meningokocksjukdom i Sverige för år
2008 fås genom sammanslagning av aktuell rapport med de obligatoriska kliniska anmälningarna som
går till Smittskyddsinstitutet (SMI). Publikation av totalbilden kommer från SMI, Solna.
Isolat av MC från likvor/blod, svalg/luftvägar inklusive konjunktiva, urogenitalt och annan lokal
(punktat) fördelade på serogrupp presenteras i Tabell I. Ett isolat redovisas per patient.
Tabell II visar serotypmönster för de 38 MC isolaten från likvor/blod.
Tabell IIIa och b visar genosubtypningmönstret för de 38 likvor/blod isolaten.
För vår internationella redovisning har Table IV utarbetats.
Serotypning utförs med helcells ELISA och subtypning genetiskt, s.k. genosubtypning, med sekvensering av porA genens tre mest variabla regioner (VR1, VR2 och VR3). Under 2006 infördes test för att
påvisa PorA proteinet som sådant som komplement till genetiken. Tekniken är co-agglutination med
monoklonal antikropp (4BG4-E7) som binder till en relativt konservativ del av PorA proteinet.
Efter rapport från Skåne om ett invasivt isolat som saknar GGT (gamma glutamyl transferas) positivitet i apiNH testet för speciesdiagnostik testades samtliga invasiva MC isolat från år 2007 (n=42).
GGT anges finnas hos de flesta MC och då det saknas anger systemet att N. polysaccharea är den mest
troliga species diagnosen. Vi fann att samtliga övriga isolat har GGT. Observationen är emellertid
viktig och förekomsten av ”denna anomali” får följas då den borde kunna lura diagnostiskt laboratorium som enbart lutar sig mot apiNH systemet, speciellt om ett isolat inte är invasivt.
PCR diagnostik på likvor, blod och punktat har genomförts med ett optimerat protokoll för att påvisa
artspecifikt bakteriellt DNA (ctrA för meningokocker) och bakteriellt DNA generellt (genen för 16S
rRNA).
POSTADRESS
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi
Universitetssjukhuset Örebro
701 85 Örebro
E-POST
[email protected]
[email protected]
BESÖKSADRESS
Södra Grev Rosengatan
Ingång F2
Örebro
TELEFON
019-602 35 73
TELEFAX
019-12 74 16
ORG.NR
232100-0164
INTERNET www.orebroll.se/uso/mikrobiol
Årsrapport lab MC2008.doc 090310.doc
Sidan 2 av 9
MC-stammar isolerade från likvor/blod (antal patienter = antal
stammar).
Serogrupp B.
Serotyp: De 14 serogrupp B MC likvor/blod-isolaten (9 sulfaresistenta, d.v.s. MIC > 10 mg/L) var av
serotyp 1 (n=2), serotyp 4 (n=2), serotyp 15 (n=5), serotyp 4/21 (n=1) och 29 % var ej serotypbara
(n=4, två sulfaresistenta), se tabell II.
Genosubtyp: presenteras i tabell III a.
Flest isolat hade P1.7,16,35 (n=3), P1.7-2,4,37 (n=2) och P1.7-2,13,35-1 (n=2). Övriga genosubtyper
återfanns bara hos enstaka isolat.
Serogrupp C.
Serotyp: Av de 16 MC serogrupp C likvor/blod-isolaten (10 sulfaresistenta) var 38% icke serotypbara
(n=6, tre sulfaresistenta). Resterande var av serotyp 15 (n=6, alla sulfaresistenta), serotyp 2a (n=4, en
sulfaresistent).
Genosubtyp framgår av tabell III b.
18
16
14
12
10
%
8
6
4
2
0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Figur 1A. Proportionen (%) MC med nedsatt känslighet enligt tidigare norm
(MIC > 0,10 mg/L) för pcG 1999 tom 2008.
Sidan 3 av 9
40
35
30
25
20
%
15
10
5
0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Figur 1B. Proportionen (%) MC med nedsatt känslighet enligt internationell norm
(MIC >0,064 mg/L) för pcG 1999 tom 2008.
Antibiotikakänslighet.
Alla MC-isolat har testats med Etest på ”choklad” Müller Hinton II agar medium (5 % hästblod) avseende MIC för pcG, pcV, cefotaxim, kloramfenikol, ciprofloxacin och rifampicin. Behandlas patienten
med annat antibiotikum görs alltid test även mot detta. Dessutom testas sulfakänslighet, vilket är en
epidemiologisk markör som kompletterar den övriga karakteriseringen, se ovan.
Av likvor/blod-isolaten hade 2/38= 5 % nedsatt känslighet för pcG (MIC >0,10 mg/L). Tidigare
proportioner från 1994 och framåt ses i figuren ovan.
Internationellt räknar man nu med MIC < 0,064 som S (känslig). Isolat med högre MIC värden har
nämligen visat sig ha genetiska förändringar i pc-bindande proteiner (ref. 7). Med denna definition var
11/38 dvs 29 % ej fullt känsliga för pcG år 2008. Motsvarande siffra för 1999 var 9 %, 2000 16 %,
2001 14 %, 2002 36 %, 2003 20 %, 2004 23 %, 2005 23 %, 2006 18% och 2007 26%.
Det finns all anledning att följa utvecklingen även om några misslyckade antibiotikabehandlingar av
invasiv meningokocksjukdom inte är identifierade.
PcV-känsligheten följer pcG men har 5-10 ggr högre MIC. Tre stammar hade MIC ≥0,50 mg/L.
Alla stammar hade cefotaxim-MIC ≤0,008 frånsett tre stammar med MIC 0,012 och två 0,016.
Alla stammar hade ciprofloxacin-MIC ≤0,006. Kloramfenikol-MIC varierade mellan 0,19 och 1,0.
Någon rifampicin-resistens sågs ej och högsta MIC var 0,023 mg/L.
Brytpunkter för MC inom SIR-systemet (S≤/R>) i mg/L, fastlagda av RAF-gruppen, är för
pcG 0,06/0,25, cefotaxim 0,06/0,25, ciprofloxacin 0,03/0,06, kloramfenikol 2/4 och rifampicin
0,25/0,25.
Sidan 4 av 9
MC DNA påvisat från normalt steril lokal (likvor, blod, punktat).
Under 2008 analyserades 114 prover med PCR-teknik avseende bakteriellt DNA. Ett var helblod, ett
serum, två rena DNA preparationer och resten likvor-prover. De flesta kom från andra laboratorier i
landet. MC DNA påvisades i 5 av dessa prover (Str. pneumoniae DNA i 7,och annat bakteriellt DNA i
några fall inkluderande en med Listeria monocytogenes.).
I selekterade fall erhölls genogrupp och genosubtyp av MC på genetisk väg direkt från provet (ref. 2).
Penicillin känsligheten skattades också med sekvensering av penA genen (ref 7, 8) direkt från några
odlingsnegativa likvor prov.
Sekvensering av bakteriellt DNA (16S rDNA) har också använts för species bestämning.
Sammanfattningsvis.
Ur referenslaboratoriets perspektiv fanns det inga klart dominerande isolat bland likvor/blod-isolaten i
Sverige under 2008. Flest isolat var:
MC serogrupp Y, T14, genosubtyp P1.5-2,10-1,36-2 (n = 4)
MC serogrupp C, T15, genosubtyp P1.7-2,16-29,35 (n = 4)
MC serogrupp B isolaten uppvisade alla individuella karaktäristika utom 2 som var B:15:P1.7,16,35
och 2 som var B:15:P1.7-2,13,35-1.
Jämfört med tidigare år (Table IV) kan det konstateras att MC serogrupp B (n = 14) ligger på en lägre
nivå än vad som noterats 1994 - 2007 (medeltal 30 likvor/blod isolat av MC serogrupp B per år, range
16-54).
MC serogrupp C har orsakat ett lägre antal insjuknanden (n = 16) jämfört med året 1997 men strax
över intervallet 10 - 15 fall/år som noterats de sista 10 åren.
Serotyp/genosubtyp 15 P1.7-2,16-29,35 isolerades också år 2005 (n=6), 2006 (n=4) och 2007 (n=1).
Det är viktigt att följa penicillin/cefalosporin och kinolon känsligheterna men ännu krävs ingen ändring av antibiotika policy vad det går att förstå från laboratoriets horisont.
Nyheter och förändringar under 2009.
Resistensbestämningen utökas med meropenem (alternativt antibiotikum vid behandling av bakteriell meningit/sepsis) och makroliden azitromycin (diskuterat alternativ för profylaktisk behandling, speciellt i ett perspektiv av att en ciprofloxacin resistens kan komma att utvecklas, se ref. 10
som avhandlar USA situationen/diskussionen).
PcV utgår från rutinsortimentet då indikationen för detta är synnerligen smal vid meningokockfrågeställningar (bärarskapsbehandling av gravid).
För pcG lämnas MIC värdet utan att översättas till SIR då det för närvarande saknas data på var
gränsen går för behandlingssvikt.
Sidan 5 av 9
Referenser.
1. Olcén P, Fredlund H.
Isolation, culture, and identification of meningococci from clinical specimens.
Kapitel 2 i Methods in Molecular Medicine, vol. 67 (2001): Meningococcal Disease: Methods and
Protocols. Ed.: Pollard AJ, Maiden M. Human Press Inc., Totowa, NJ.
2. Mölling P, Jacobsson S, Bäckman A, Olcén P.
Direct and rapid identification and genogrouping of meningococci and porA amplication by
LightCycler PCR.
J Clin Microbiol 40:4531-4535, 2002
3. Clarke SC, Diggle MA, Mölling P, Unemo M, Olcén P.
Analysis of PorA variable region 3 in meningococci: implications for vaccine policy?
Vaccine 21:2468-2473, 2003.
4. Vazques JA ....Olcén P .... et al.
Interlaboratory comparison of agar dilution and Etest methods for determining the MICs of antibiotics used in management of Neisseria meningitidis infections.
Antimicrob Agents Chemother 47:3430-3434, 2003.
5. Taha M-K, Olcén P.
Molecular genetic methods in diagnosis and direct characterization of acute bacterial central nervous system infections.
APMIS 112:753-770, 2004.
6. Taha M-K ….Olcén P .... et al.
Interlaboratory comparison of PCR-based identification and
genogrouping of Neisseria meningitidis.
J Clin Microbiol 43:144-149, 2005.
7. Thulin S, Olcén P, Fredlund H, Unemo M.
Total variation in the penA gene of Neisseria meningitidis: correlation between susceptibility to βlactam antibiotics and penA gene heterogeneity.
Antimicrob Agents Chemother 50:3317-3324, 2006.
8. Thulin S, Olcén P, Fredlund H, Unemo M.
Combined real-time PCR and pyrosequencing strategy for objective, sensitive, specific, and high
throughput identification of reduced sensitivity to penicillins in Neisseria meningitidis.
Antimicrob Agents Chemother 52:753-756, 2008.
9. Jacobsson S, Olcén P, Löfdahl M, Fredlund H, Mölling P.
Characteristics of Neisseria meningitidis isolates causing fatal disease.
Scand J Infect Dis 40:734-744, 2008.
10.Wu HM, Harcourt BH, Hatcher CP et al.
Emergence of ciprofloxacin-resistant Neisseria meningitidis in North America.
NEJM 360:886-892, 2009.
Örebro 2009-03-10
Sändlista:
Per Olcén, Hans Fredlund, Paula Mölling,
Magnus Unemo och medarbetare.
Samtliga svenska Kliniskt Mikrobiologiska laboratorier, Infektionskliniker och Smittskyddsenheter
SMI: generaldirektör, chef för epidemiologen samt kvalitetsansvarig
SMI´s motsvarigheter i Norden
ECDC: Johan Giesecke, Karl Ekdahl
SoS: Johan Carlsson, Anders Tegnell
English version to ECDC, EMGM with the Ref. laboratories in Europé, CDC, Australia, New Zeeland.
Sidan 6 av 9
Tabell I
Serogruppmönster hos N. meningitidis isolat från 76 patienter som skickats till laboratoriet för karakterisering under 2008. Ett isolat per patient redovisas.
a)
.
Serogrupp
likvor/blod
svalg/luftvägar inkl.
ögon
urogenitalt
punktat
totalt
A
0
0
0
0
0
B
14
7 a)
0
0
21
C
16
0
0
0
16
X
0
0
0
0
0
Y
7
5 b)
1
1
14
Z
0
0
0
0
0
W-135
1
0
0
0
1
29E
0
0
0
0
0
ej grupperbar
0
23 c)
1
0
24
Totalt
38
35
2
1
76
1 bronksekret; b)
1 sputum och 1 konjunktiva; c)
1 sputum och 1 från halscysta.
Tabell II
Serotypmönster för samtliga N. meningitidis isolat från likvor/blod som inskickats till laboratoriet
under 2008 från 38 patienter.
Serogrupp
1
2a
4
14
15
4/21
ej typbar
Totalt
B
2
0
2
0
5
1
4
14
C
0
4
0
0
6
0
6
16
Y
0
0
1
6
0
0
0
7
W-135
0
1
0
0
0
0
0
1
Totalt
2
5
3
6
11
1
10
38
Sidan 7 av 9
Tabell III a
Genosubtypmönster för samtliga N. meningitidis grupp B isolat från likvor/blod (n=14) uppdelat
på de tre variabla regionerna VR1, VR2 och VR3 hos porA genen.
VR1
P1.7
P1.17
P1.19
P1.22
original
sekvens
6
1
1
1
5**
0
0
0
sekvensvariant
VR2
P1.1
P1.4
P1.13
P1.14
P1.15
P1.16
original
sekvens
1
2
2
1
0
3
sekvensvariant
0
0
0
0
1
4****
VR3
P1.35
P1.36
P1.37
original
sekvens
6
3
2
3*
0
0
sekvensvariant
* = en variant
** = två varianter
**** = fyra varianter
Sidan 8 av 9
Tabell III b
Genosubtypmönster för samtliga N. meningitidis isolat, utom grupp B från likvor/blod (n=24),
d.v.s. 16 C, 7 Y och 1 W-135.
VR1
P1.5
P1.7
original
4
2
12**
6**
sekvensvariant
VR2
P1.2
P1.10
P1.16
original
4
0
0
sekvensvariant
1
11*****
8*
VR3
P1.35
P1.36
original
8
0
sekvensvariant
0
16*
*
=
en variant
**
=
två varianter
***** = fem varianter
Grupp C-stammarna hade genosubtyp
Grupp Y-stammarna
Grupp W-135-stammen
P1.7-2,16-29,35
(n=5)
P1.5,2,36-2
(n=3)
P1.5-1,10-1,36-2
(n=2)
P1.5-1,10-8,36-2
(n=2)
P1.7,16-29,35
(n=2)
P1.5-1,2-2,36-2
(n=1)
P1.7-23,16-29,35
(n=1)
P1.5-2,10-1,36-2
(n=4)
P1.5-1,10-4,36-2
(n=1)
P1.5-2,10-28,36-2
(n=1)
P1.5-2,10-29,36-2
(n=1)
P1.5,2,36-2
K:/kontoret/per/Årsrapport lab MC2008.doc 090310
Per Olcén
Datum: 2009-03-10
Sidan 9 av 9
Tabell IV
1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
2005 2006 2007 2008
Totalt antal MC-isolat
(ett per patient)
80
114
133
99
87
87
102
116
83
74
73
70
75
81
76
MC från CSF/blod
53
68
75
64
57
46
44
58
36
41
47
48
44
43
38
MC från luftvägar
23
42
51
35
26
39
56
55
43
27
24
19
28
34
35
MC från genitaltrakt
2
1
4
0
3
2
1
2
3
4
0
1
3
3
2
Andra invasiva MC
2
3
3
0
1
0
1
1
1
2
2
2
0
1
1
A
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
B
44
42
54
32
35
25
23
33
20
27
24
25
21
16
14
C
3
19
9
25
13
12
15
14
10
11
11
15
15
15
16
Y
5
6
8
6
4
7
1
8
4
2
6
4
5
9
7
W-135
1
0
4
1
3
2
5
2
1
1
5
1
2
2
1
annan
0
1
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
ingen grupp
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
2
1
1
0
MC från CSF/blod
serogrupp
