MÄLARDALENS HÖGSKOLA
Akademin för hållbar samhälls- och teknikutveckling
Detektion av Endosymbionter hos insekter via PCR,
kloning och sekvensering
Shaheen Rahman
Examensarbete, 15 hp
Handledare: Carl Påhlson
Examinator: Sven Hamp
Abstract
The purpose of this work was to detect microorganisms that live in
symbiosis with various insects and arthropods.
This thesis also aimed to provide insight into the different methods
used in the biomolecular field to detect parasites in living
organisms. The methods used were DNA purification, nested PCR,
electrophoresis, bacterial culture, cloning and sequencing.
The acronym stands for PCR polymerase chain reaction, a method that was
discovered by Karry Muller in 1988 and for which he received the 1993
Nobel prize. The DNA polymerase, which makes the method available is a
thermo-stable enzyme from the bacterium Thermus aquaticus.
PCR is a very popular method in the field of biochemistry because it
is a relatively simple method that can be used to efficiently amplify
a selected sequence. The principle of PCR amplification is based on a
repetitive series of temperature changes. The result is that you get
millions of copies that are identical to the original sequence.
Nested PCR is a variation of traditional PCR, which requires two
primerpairs. The second DNA fragment primerpair strengthens further by
using the amplified sequence from the first primerpair as template.
Nested PCR is a good method but sensitive to pollutants that can cause
false positive results.
MiniPrep of DNA are made to get as high DNA concentration as possible
and to remove any inhibitory substances, thereby making the PCR run as
successful as possible.
Gel electrophoresis is a method used to separate molecules by getting
them to walk and separated by size so that you then can interpret the
fragment length. The molecules migrate at different speeds depending
on the DNA fragment length, the short fragments migrate rapidly and
the long hike slowly.
DNA sequencing is done to identify different species and to compare
species within different genera. If the similarity in DNA sequence
between two different species is high, this means that they are
closely related. Sequencing can also be used to analyze non-culturable
microorganisms.
Sammanfattning
Syftet med detta arbete var att detektera mikroorganismer som lever i symbios med olika
insekter eller leddjur.
Detta examensarbete syftade också till att ge en inblick i de olika metoder som används inom
det biomolekylära området för att detektera parasiter i levande organismer. Metoderna som
användes var DNA rening, nested PCR, elektrofores, bakterieodling, kloning och
sekvensering.
Förkortningen PCR står för polymerase chain reaction, en metod som upptäcktes av Karry
Muller 1988 och för vilket han fick 1993 års Nobel pris. Det DNA polymeras som gör
metoden möjlig är ett termostabilt enzym som kommer från bakterien Thermus aquaticus.
PCR är en väldigt populär metod inom det biokemiska området eftersom att det är en relativt
simpel metod som kan användas för att effektivt amplifiera en utvald gensekvens. Principen
för PCR amplifiering bygger på en upprepad serie av temperaturförändringar. Resultatet blir
att man får miljontals kopior som är identiska med den ursprungliga sekvensen.
Nested PCR är en variation av traditionell PCR, där det behövs två primerpar. Det andra
primerparet förstärker DNA fragmentet ytterligare genom att använda den amplifierade
sekvensen från det första primerparet som templat. Nested PCR är en bra metod men
samtidigt känslig för föroreningar som kan förorsaka falskt positiva resultat.
Miniprep av DNA görs för att få så hög DNA koncentration som möjligt samt för att få bort
eventuella inhiberande substanser,för att man vilket i slutändan får ett så bra resultat som
möjligt.
Gelelektrofores är en metod som används för att separera molekyler genom att få dem att
vandra och separera efter storlek så att man på detta sätt kan tolka fragmentets längd.
Molekylerna vandrar i olika hastighet beroende på DNA fragmentets längd, de korta
fragmenten vandrar snabbt och de långa vandrar långsamt.
DNA-sekvensering görs för att identifiera olika arter och jämföra arterna inom olika släkten.
Om likheten i DNA-sekvens mellan två olika arter är hög, betyder det att dem är nära släkt.
Sekvensering kan också användas för att analysera icke odlingsbara mikroorganismer.
4
Innehållsförteckning
Inledning
4
Syfte
5
Material
6
Provmaterial
Kemikalier
Utrustning
Instrument
Metoder
6
6
6
6
7-8
Rickettsia
Wolbachia
Resultat
9-11
Rickettsia
Wolbachia
Diskussion
12
Referenser
13
Inledning
Endosymbiosis är ett grekiskt ord, endo betyder inre, sym betyder samman och biosis betyder
levande. Endosymbionter är mikroorganismer som hjälper sin värd antingen genom att
producera de näringsämnen som värden inte kan producera själv eller genom att metabolisera
sin värds avfallsprodukter till säkrare form. Det är väl känt att vissa organeller i eukoryota
celler, speciellt mitokondrierna uppstod via bakteriell endosymbiosis. Den ryska botinisten
Konstantin Merechkowki formulerade denna teori (1905) och den kallas för ”endosymbiotic
theory”.
I många fall är endosymbionter och deras värdceller beroende av varandra, med andra ord de
kan inte överleva utan varandra, t.ex. Gutless havsborrmasker av släktet Riftia, som får näring
från sina endosymbiotiska bakterier. Andra exempel är bladlössymbionter, Buchnera, som
tillverkar viktiga aminosyror som bladlössen själva inte kan tillverka. De här bakterierna lever
i en speciell sorts celler i bladlössens kropp och överförs från en generation till en annan
genom att packas in i bladlössens ägg.1
4
Syfte
Syftet med detta examensarbete var att detektera endosymbionter som lever i insekter genom
olika biomolekylära metoder. Vi detekterade två olika mikroorganismer som kan leva inuti
olika insekter. Den ena är Wolbachia, en gramnegativ bakterie som upptäcktes av Marshall
Hertig och Simeon Burt Wolbach i myggarten Culex pipiens2.
Den andra mikroorganismen är en Rickettsia som också är en G- bakterie och som infekterar
däggdjur via vektorer av leddjur eller insekter.
5
Material
Provmaterial
1 silverfisk, Lepisma saccharina² (LS)
1 gråsugga, Oniscus asellus² (OA)
Kemikalier
TBE-buffert
Etidiumbromid (10 mg/ml)
Chemically competent E. coli TOP 10, Invitrogen
Kloningsvektor, pCR® 2.1-TOPO® Vector
Agarose NA, GE Healthcare 17-0554-02
Agarplattor med ampicilin 50 µg/ml
DNA storleksmarkör, Fermentas GeneRuler, 1 kb
(250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 bp)
Ready to go beads, Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads 27-9557-01
Formamid loading dye, GE healthcare, batch 341122
Utrustning
Ordinarie laboratorieutrustning.
Ordinarie elektroforesutrustning
Instrument
PCR-maskiner: Biometra, T3 thermocycle och Hybaid PCR Express
Centrifug: Hermle Z383K
Sekvenseringsmaskin: ALF-express, serienr. 001664, Pharmacia biotech
Inkubator: Gallencamp, Labassco
UV-kamera: Variable-intensity transilluminator, 212 nm UV, model TVL-312 A, Spectroline,
Spectronics Corporation
6
Metoder
Rickettsia
En nested PCR-assay gjordes för att detektera Rickettsia med ytterprimerparet P2/P3 och
innerprimerparet P4/P5. Första steget var att preparera insekterna för att rena fram deras
DNA, vilket skedde enligt manual för kitet DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). DNA:t
användes som templat för PCR amplifiering med ytterprimerparet P3/P2. Mastermixen för
denna assay ses i tabell 1. Samtliga primers användes med koncentrationen 1 OD.
Tabell 1. PCR reaktion för primers P3/P2.
PCR reaktion (µl)
Primer P2
Primer P3
Mastermix 5X (µl)
1
1
5
5
Dest. vatten
Templat
22
1
110
5x1
Total volym
25
120
Provet från PCR amplifieringen med P3/P2 användes som templat för nested PCR med
primrar P5/P4. Önskad fragmentstorlek var 213 bp. Samma mängd som i första steget
användes men undantaget var att templat togs med en ögla för att undvika kontamination. När
nested PCR körningen var klar var det dags för elektrofores för att studera DNA fragmentens
storlek. För att köra elektrofores blandades agarosgel med procenthalten 1,5 i TBE buffert.
Då PCR med innerprimerparet P4/P5 blev negativt gjordes en spädning av templatet 100X
och sedan kördes provet om. Dock med samma negativa resultat för gråsuggan. Silverfisken
blev däremot positiv vid ny körning med båda Rickettsia primers. Se figur 1. Bilden visar att
med primer P4/P5 amplifieras även ett extraband på ca 300 bp. För att undvika detta utfördes
gelextraktion och därefter en ny PCR med färre cykler och specifik amplifiering.
7
Figur 1. Ny PCR med P2/P3 och P4/P5. Brunn 1- 5: PCR med P2/P3. Brunn 6-11: PCR med P4/P5. I figuren
ses: Brunn 1) Storleksmarkör 1 kb 2) Positiv kontroll 3) Negativ kontroll 4) Utspädd OA 5) LSk 6)
Storleksmarkör 1 kb 7) Positiv kontroll 8) Utspädd OA 9) LS 10) Negativ kontroll 11) Storleksmarkör 1 kb
Wolbachia
Den andra PCR-analysen utfördes för detektion av Wolbachia och kördes med WSP
forward/WSP reverse med alla insekternas DNA som templat. PCR kördes enligt samma
princip som föregående analys.
WSP-genen som är templat i denna PCR är ytterligt specifik och endast Wolbachia bör
amplifieras.
Kloning gjordes enligt manualen för kitet TOPO TA Cloning Kit for sequencing, pCR 2.1TOPO Vector. För Rickettsia testades 8 kloner med primers M13/T7 varav 5 hade fragment
av rätt storlek (391 bp, varav 213 bp är fragmentet och 178 bp är kloningsvektorn.)
Motsvarande fragmentstorlek för Wolbachia bör vara 788 bp. Cykelsekvensering med
primern T7 utfördes med kitet BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing enligt manual.3
8
Resultat
Rickettsia
I figur 2 visas DNA fragmentet för silverfisk och gråsugga som amplifierades med primerpar
P3/P2 och P5/P4. Resultatet för gråsuggan med P3/P2 är ett starkt och tydligt band som
stämmer med förväntad storlek på 370 bp. Trots att gråsuggans DNA gav ett kraftigt band
med ytterprimerparet blev det negativt med nested primers. Ett svagt band kan urskiljas men
är av samma storlek som amplifikatet från PCR1. Trots utspädning var resultatet fortfarande
negativt.
Figur 2. Bilden visar resultatet för primrar P3/P2 och P5/P4 för silverfiskens samt gråsuggans DNA.
Brunn: 1) Storleksmarkör 1 kb 2) Negativ kontroll 3) P2/P3 med OA DNA som templat 4) P2/P3 med LS DNA
som templat 5) P4/P5 med LS 6) P4/P5 med OA 7, 8) Negativa kontroller 9) Storleksmarkör 1 kb
Efter gelextraktion och ny PCR erhölls ett fint och tydligt band från silverfisken.
Fragmentstorleken stämmer överens med den förväntade. Se figur 3. Kloner från kloning med
detta fragmentet ses i figur 4.
Figur 3. Ny PCR med specifik amplifiering för LS DNA.. Brunn 1) Storleksmarkör 1 kb 2) LS DNA som templat
3) Storleksmarkör 1 kb
9
Figur 4. Kloner från kloning med Rickettsia fragmentet från silverfisken. I brunn 4, 5, 6, 7 och 8 ses de positiva
kloner som sekvenserades.
Sekvensering av utvalda kloner och sökning i databasen BLAST4 bekräftade att vi hade
lyckats amplifiera 17 Kda yttre membranprotein genen och att den art som gav bäst
överenstämmelse var Rickettsia helvetica.
Wolbachia
Resultatet med WSP forward/reverse visar att ett fragment av rätt storlek.
Figur 4. PCR med Wolbachia forward/reverse. Brunn 1) Storleksmarkör 1 kb 2) Negativ kontroll 3) Silverfiskens
DNA 4) OA DNA 5) Storleksmarkör 1 kb
10
Resultatet stämmer bra med den teoretiska Wolbachia fragmentstorleken (610 bp). Positiv
amplifiering erhölls endast med LS DNA. M13/T7 amplifiering av kloner från kloning med
Wolbachia ses i figur 5 på nästa sida. Tyvärr kunde inget sekvenseringsresultat erhållas.
Figur 5. Figuren visar kloner från kloning med Wolbachia fragmentet från LS. Storleksmarkör 1 kb användes. I
brunn 1, 2, 3 och 6 ses kloner med rätt fragmentstorlek.
11
Diskussion
En period på 10 veckor är en relativt kort tid för att sätta upp och optimera metoder för PCRdetektion via kloning, amplifiering och sekvensering av ”icke-odlingsbara” mikroorganismer.
Här har vi lyckats få fram preliminära bevis på att Rickettsia kan förekomma i LS där de
aldrig tidigare påvisats. Att vi inte fick något sekvenseringsresultat med Wolbachia kan bero
på många olika faktorer. Det kan bero på kontamination, kemikalier eller på att det kanske
inte alls fanns några Wolbachia gensekvenser. Man kan få funderingar över de fragment som
motsvarade Wolbachias fragmentstorlek. Svaret kan bli att det var LSs egna DNA som gav
´fel` bildresultat. Det är bara en teori.
12
Referenser
1. Welburn, S.C., Maudlin, I. & Ellis, D.S. 1987, “In vitro cultivation of rickettsia-likeorganisms from Glossina spp. “Ann. Trop. Med. Parasitol., vol. 81, sidor 331-335
2. Hertig, Marshall; Wolbach, S. Burt, "Studies on Rickettsia-like microorganisms in
insects", Journal of Medical Research, 1924, vol. 44, sidor 329–74
3. Manual, BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit, Applied Biosystems
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/, National Center for
Biotechnology Information, 2009-11-20
13
