Cellodling teorikompendium

Karlstads universitet
Inst för kemi, biomedicinska ämnen
Biomedicinsk laboratorievetenskap
CELLODLING
Teori kompendium
Sammanställd av: Birgitta Sundström
Innehållsförteckning
Inledning
3
Sterilteknik
3
Hur man arbetar i en LAF-bänk
4
Innan arbetet påbörjas
5
Efter avslutat arbete
5
Underhåll fodras för säkerhet
6
Rengöring och desinficering
6
Desinfektionsmedel
6
Inkubatorer
7
Medium och pH
8
Att frysa och tina celler
8
Upptining av celler
9
Nedfrysning av celler
10
Tillväxtkurvor
11
Beräkning av fördubblingstid
11
Cellräkning
14
Kloning
15
Subkultivering
15
mekanisk subkultivering
15
enzymatisk subkultivering - trypsinering
15
2
Inledning
Idag odlas vävnadsceller ofta som monolayer eller i suspension. Cellernas behov varierar och
mammalieceller är mer svårodlade än mikroorganismer eftersom de behöver många fler
näringsämnen och ofta växer på en speciellt behandlad yta. Om cellen ges rätt miljö kan de
överleva, föröka sig och även uttrycka differentieringsegenskaper under odling. Cellerna kan
kontrolleras under mikroskop eller analyseras biokemiskt och effekter av olika molekyler, ex.
hormoner eller tillväxtfaktorer, som tillsätts eller tas bort kan studeras.
Sterilteknik
Renlighet är den viktigaste förutsättningen för cellodling. Mikroorganismer (bakterier, svamp,
virus och mykoplasma) delar sig ca 50 gånger snabbare än mammalieceller och kommer
därför att snabbt växa över varje cellkultur.
Idag anses laminar flow (LAF) bänk som obligatorisk vid varje form av cellodlingsarbete.
Luften i en LAF-bänk filtreras genom ett HEPA-filter (High Efficient Particulate Air) och
innehåller därför mycket få partiklar, vilket har reducerat antalet spontana infektioner i
cellkulturer. Infektionsrisk finns fortfarande, eftersom den laminära luftströmmen störs vid
arbete i bänken. För att ytterligare minska risken för spontana infektioner, bör luften i
laboratoriet hållas så ren som möjligt. Antalet partiklar i laboratorieluften måste begränsas och
följande förhållningsregler rekommenderas därför:
• Fönstren hålls alltid stängda.
• Luftintag förses med HEPA-filter
• Dörren till cellodlingslaboratoriet hålls stängd
• Så få människor som möjligt går in och ut ur laboratoriet
• Om möjligt inrättas ytterligare ett rent rum, t.ex. i form av en sluss vid ingången till
cellodlingslaboratoriet
• Du bör byta arbetskläder och skor omedelbart utanför cellodlingslaboratoriets entré. För att
undvika att partiklar sprids till omgivningen från en person via hans eller hennes
arbetskläder, bör kläderna bytas minst en gång per dag. Rocken ska täcka dig så mycket
som möjligt, d.v.s. sluta tätt vid hals och handleder
• Sterila engångshandskar ska användas, eventuellt också munskydd och huvudbonad
• Så få personal som möjligt ska arbeta samtidigt i laboratoriet, eftersom varje person avger
partiklar
• Du bör arbeta i lugnt tempo - en hårt arbetande person avger betydligt fler partiklar än en
person i vila
• Temperaturen bör ligga vid 20°C. Ju varmare laboratoriet är, desto fler partiklar avger
personalen
3
• Om möjligt etableras ett svagt övertryck i laboratoriet, så att luften alltid cirkulerar från
cellodlingslaboratoriet till omgivningen.
• Allt som förs in i cellodlingslaboratoriet ska vara så fritt från damm som möjligt. Det som
tål det, desinficeras med t.ex. 70% etanol innan det tas in i laboratoriet. Varor i papplådor
packas upp utanför cellodlingslaboratoriet.
I lokalen ska finnas så få saker som möjligt där damm (och därmed mikroorganismer) kan
samlas. Detta underlättar även rengöring och desinficering.
Använd ett rullbord för de saker som behövs under dagens arbete. Efter avslutat arbete kan
rullbordet lätt tömmas och rengöras.
För att begränsa persontrafiken in och ut ur laboratoriet, bör apparatur som är nödvändig för
arbetet stå inne i rummet. För att begränsa antalet platser där damm kan samlas, bör apparatur
som inte är nödvändig för det dagliga arbetet stå utanför laboratoriet.
Hur man arbetar i en LAF-bänk.
Arbetstekniken har stor betydelse för skyddsfunktionen.
Det finns viktiga generella principer för arbetet, de är t. ex något olika för horisontell och
vertikal LAF och de kan behöva modifieras pga arbetsmaterialets storlek, riskfaktorer - men
en viss bästa arbetsteknik torde kunna formuleras. Här ges främst R3-kraven på arbetstekniken
i bänken.
• Ta först reda på att bänkens funktion är tillfredställande (luftflöde, filtertäthet, ljudnivå).
Arbete får aldrig utföras när bänken går med reducerad fläkthastighet
• Hand- och armrörelser ska vara långsamma (< 2 dm/s). Snabba rörelser skapar turbulens i
den sterila luftströmmen.
• Frontluckan skall befinna sig i arbetsläge under hela arbetsmomentet
• Passage i arbetsöppningen med händer och objekt - långsamt, låg frekvens. Behov av
materialsluss beaktas.
• Minimera antalet transporter ut och in i arbetsutrymmet. Varje gång en arm förs in i LAFbänken kommer också partiklar in och dessutom uppstår turbulens i den sterila
luftströmmen på grund av själva armrörelsen.
• Alla utensilier ska placeras bakom de främre hålen i arbetsytan. Fyll aldrig arbetsutrymmet
helt. Varje föremål som placeras på arbetsytan kommer att skapa turbulens i den sterila
luftströmmen.
• Allt arbete utförs bakom de främre hålen i arbetsytan.
• Används långärmad skyddsrock, ska ärmarna sluta tätt om handlederna. Den luft, som
kommer ut ur ärmen när den läggs på arbetsytan, kommer med större hastighet än den
4
laminära luftströmmen, varför den ”orena” luften från ärmen kommer att passera över
arbetsytan och produkten.
• Rör inte armar, händer eller icke-sterila utensilier över öppna odlingsflaskor / Petriskålar.
Partiklar från de ”orena” föremålen riskerar att föras med den laminära luftströmmen ner i
odlingsflaskorna / Petriskålarna.
• Undvik hantering av kraftigt värmeavgivande produkter eller hjälpmedel eftersom de
orsakar turbulens i luftströmmen.
• Bänken får aldrig vara uppställningsplats. Använd transportvagn utanför, materialsluss e d.
Inte heller ovanpå bänken får material placeras.
• Stora maskiner o d bör placeras utanför LAF-zonen så att endast kritiska operationer
utföres i zonen.
• Ergonomiska aspekter är viktiga - en trött operatör slarvar lätt. Bra stol, rätt sitthöjd,
armställning osv.
• Placera bänken så att direkt drag mot arbetsöppningen undviks.
• Placera heller inte bänken på plats där många människor passerar.
Innan arbetet påbörjas
• Ca 15 min. innan arbetet påbörjas startas fläkten och får gå med full hastighet. Den gröna
indikeringslampan visar att bänken fungerar korrekt.
• Arbetsutrymmet görs rent och desinficeras noggrant. Använd 70%-ig etanol eller liknande.
Använd helst trasor som inte luddar.
Till front- och sidorutor används normalt desinfektionsmedel -aldrig kloroform. Använd
alltid mjuk trasa, som inte repar rutorna.
• Produkter och hjälpmedel, som behövs för arbetsmomentet, rengörs och desinficeras -- om
nödvändigt -- innan de placeras i arbetsutrymmet.
• Den höj- och sänkbara frontrutan placeras i rätt arbetsläge och skall så förbli under hela
arbetspasset. De hjälpmedel, som behövs för att utföra arbetet placeras inom bekvämt
räckhåll.
• Nödvändig personlig utrustning för både operatör och produkt, t.ex. handskar, mask, visir
eller annan renrumsutrustning, tas på.
Efter avslutat arbete
Produkt, tillhörande hjälpmedel samt arbetsutrymmet rengörs grundligt igen. Torka av fläkten
noga och låt den gå ca 15 min. Låt eventuellt fläkten gå ytterligare en stund med reducerad
hastighet.
5
Underhåll fordras för säkerhet
I en LAF-bänk är luftflödets storlek och förfiltrets samt HEPA-filtrets funktion avgörande för
funktionen.
Genom filtrets gradvisa igensättning minskar luftflödet. Förfiltret måste bytas och
fläktvarvtalet måste ev. korrigeras.
Då HEPA-filtret måste bytas gäller att det nya filtret anslutes absolut tätt. Vis arbete med
riskämnen tillkommer speciella avdödnings- och/eller filterbytes-åtgärder.
LAF-bänkar i Rena Rum av hög klass behöver mycket sällan få HEPA-filtren bytta,
livslängder om 10-20 år rapporteras.
Rengöring och desinficering
För att förhindra en anhopning av mikroorganismer, måste cellodlingslaboratoriet
totalrengöras och desinficeras innan arbetet påbörjas och därefter en gång per kvartal. Detta
innebär totalrengöring med efterföljande desinficering omfattande tak, väggar, golv, stolar,
skåp, lådor, hyllor, alla apparatur, CO2-inkubator och andra inventarier i laboratoriet.
Orsaken till att man måste göra rent före desinficeringen, är att damm, smuts och intorkat
organiskt material kan skydda mikroorganismerna och hindra desinficeringsmedlet från att
komma i kontakt med dem. Dessutom avlägsnas genom rengöringen en del mikroorganismer
som finns, så att det vid desinficeringens början inte är tal om några större mängder av
mikroorganismer.
Cellodlingslaboratoriet ska rengöras noggrant varje dag - om möjligt sist på dagen. Under
nattens lopp tar LAF-bänken och eventuella luftreningsanläggningar hand om partiklar som
virvlat upp vid rengöringen. Man använder rengöringsmedel som normalt används på
laboratorier. Den dagliga rengöringen omfattar utvändig avtorkning av apparatur och
arbetsbänkar samt golvtvätt. Daglig kemisk desinficering av golv och andra större ytor bör
inte förekomma, dels för att det saknas dokumentation om effekten av detta, dels för att
besvären och kostnaderna vid användning av kemiska desinficeringsmedel på större ytor är
stora. Vid synlig smuts eller spill av infekterat material, kan man desinficera själva fläcken
före rengöring.
Handskar bör alltid användas vid bruk av kemiska desinficeringsmedel. Effekten av ett
desinficeringsmedel beror dels på koncentrationen, dels på den tid medlet är i direkt kontakt
med mikroorganismen.
Desinficeringsmedel i utspädd form har en begränsad hållbarhet. För att ge
desinficeringsmedlet tid att vara i kontakt med mikroorganismerna, tvättas ytorna med en duk
som vridits ur i medlet. Ytorna får självtorka.
Desinfektionsmedel
Etanol, 70%: är särskilt effektivt mot bakterier och svamp. Effekten på virus är mindre väl
dokumenterad. Etanol kan vara brandfarligt. Den förångas lätt från en lösning och upprepad
6
inandning av ångorna kan vara hälsovådligt. Alkoholer bör därför inte användas på stora ytor
och inte heller i sprayform.
Aldehyder: dödar svamp, bakterier, sporer och virus. Metaller angrips inte av aldehyder, men
plast och gummi tar upp betydande mängder. Aldehyder är giftiga och irriterar ögon och
slemhinnor. De är dessutom allergiframkallande. God ventilation är nödvändig, eftersom
aldehyder lätt förångas.
Fenoler: enkla fenoler fungerar bäst mot Grampositiva bakterier. Halogen- och
alkylsubstituerade fenoler har störst verkan på Gramnegativa bakterier. Metaller angrips inte
av fenoler, men gummi och plast tar upp stora mängder. Fenoler är giftiga vid upptagning
genom huden och kan ge toxiska reaktioner. Fenoler förångas inte vid rumstemperatur.
Oxidationsmedel: kloramin dödar alla bakterier, sporer, svampar och virus. Det verksamma
kloröverskottet är bundet och effekten kommer långsamt. Hypoklorit har samma spektrum
som kloramin. Det verksamma kloröverskotten är fritt och effekten snabb. Översyror har
också ett spektrum motsvarande kloraminets. I utspädd form är oxidationsmedel i allmänhet
ofarliga att använda. I koncentrerad form är de frätande och i likhet med starkare utspädda
lösningar kan de ge hudirritationer. De klorhaltiga medlen luktat obehagligt. Vid längre tids
kontakt med oxidationsmedel kan metaller korrodera.
Slutsats: för att uppnå optimal effekt med ett medel som är så lite hälsovådligt som möjligt,
rekommenderas kloramin till desinficering av stora ytor. Till mindre arealer rekommenderas
70%-ig etanol. När det gäller utrymmen som är svåra att desinficera med hjälp av en våt duk,
kan man använda 70%-ig etanol i sprayform. Att göra sig av med dessa två
desinficeringsmedel kräver inga särskilda förhållningsregler. Avfall i form av giftiga
desinficeringsmedel kräver särskilda förhållningsregler, vilka bör kontrolleras för varje enskilt
ämne.
Inkubatorer
I den levande organismen är den optimala temperaturen för mammalieceller 37-37,5°C. Det är
välkänt att cellerna börjar ta skada när temperaturen når 42°C. I kultur dör de flesta celler efter
ca 10 timmar vid 42°C. Däremot tål de flesta mammalieceller en sänkning av temperaturen
mycket bättre. I en kultur tål de flesta celler förvaring vid 20°C i över 24 timmar. Sänks
temperaturen till 4°C, börjar cellerna dö efter några timmar. Det finns nästan inga celler som
tål ihållande temperatursvängningar. Större svängningar än ±0,3°C bör undvikas. För att
uppnå optimal tillväxt och/eller produktion bör celler därför odlas vid konstant temperatur,
vanligtvis 37°C. För att temperaturen ska kunna hållas så konstant som möjligt, ska
inkubatorkammaren vara omgiven av ett tjockt lager material med god
värmeledningsförmåga.
När vatten avdunstar från mediet, som cellerna växer i, stiger osmolariteten i mediet. En
ökning av osmolariteten med 5-10% kommer att verka toxiskt på de flesta celler. Man bör
därför se till att vatten inte förångas från mediet. Om cellerna odlas i öppna flaskor eller
ventilerade Petri skålar bör den relativa luftfuktigheten (RH) i inkubationskammaren hållas på
95-98%. Den relativa fuktighetsgraden bestäms som förhållandet mellan vattenångans aktuella
partialtryck och mättad vattenångas tryck vid gällande temperatur. 95-98% RH ligger alltså
mycket nära mättad vattenånga. Ju högre temperaturen är, desto mer vatten kan luften
innehålla i form av ånga. En relativ fuktighetsgrad på nästan 100% innebär en skillnad på 17
2°C på ytorna, vilket skapar kondens på den kallaste ytan. En del av vattenångan i det kallaste
området måste nämligen bli till vatten (kondens), då den kallare luften inte kan innehålla lika
mycket vatten i förångad form, som den varmare luften. Det är viktigt att kondens inte bildas
på ytorna i inkubatorn, eftersom kondens utgör en utmärkt växtmiljö för mikroorganismer.
Om gummilisten omkring dörren blir otät, kommer luft från rummet långsamt att strömma in i
inkubatorn. Eftersom luften ute i rummet är kallare än luften inne i inkubatorn, kommer det
att bildas kondens på ytorna inne i inkubatorn i det område, där den kalla luften kommer in.
Finns sådana kondenssträngar på ytorna i inkubatorn, ska gummilisterna bytas ut.
Medium och pH
Ett av de viktigaste ingredienserna vid cellodling är mediet. Det ska i princip imitera den
vätska som normalt omger cellerna i den intakta organismen. I praktiken använder man ofta
det medium som ger den snabbaste celltillväxten eftersom man oftast vill arbeta med en stor
cellpopulation. Med snabb celltillväxt följer också genetisk instabilitet. Detta innebär att om
odlingsmediet ändras kommer selektionstrycket att förändras och eftersom populationen från
början visar upp en viss heterogenitet kan nya populationer få tillväxtfördel och utvecklas
därför på bekostnad av övriga celler.
Ett basalmedium uppfyller baskraven av salter, vitaminer, aminosyror och glukos förutom de
krav på pH, buffertkapacitet och osmolaritet som cellen har.
De flesta cellinjer odlas optimalt vid pH 7.2 - 7.5. Många hybridomceller trivs bäst inom pH
intervallet 6.9 - 7.3. För att man hela tiden ska kunna kontrollera att de odlade cellerna har ett
optimalt pH så innehåller medium ofta en pH indikator, vanligen fenolrött.
För att undvika stora variationer av pH i cellernas omgivning innehåller mediet ett
buffertsystem. Vanligtvis används kolsyra / bikarbonat som buffert. I öppna system
upprätthåller man pH genom inkubation i CO2-inkubatorer med 5% CO2 i luft. I slutna system
gasas flaskorna med en blandning av 5% CO2 i luft som kan köpas på tub.
I slutna system kan man även använda andra buffertsubstanser ex. hepes som håller pH
konstant utan att CO2 behöver tillsättas. Dessa kan då placeras i en termostaterad inkubator.
Att frysa och tina celler
Celler som ska långtidförvaras förvaras vid så låg temperatur som möjligt. Flytande kväve är
en lämplig förvaringsplats, -196°C i flytande fasen eller vid flytande kvävets ångfas, -156°C.
Nedfrysning av celler görs för att behålla celler från låga passager och då speciellt icke
transformerade celler. Nedfrysning under -130°C minskar risken för genetiska förändringar
och kontamination.
Bäst är att frysa celler som befinner sig i log-fas. Nedfrysningen måste vara så skonsam som
möjligt eftersom om infrysning går för snabbt (>100°C / min) bildas iskristaller i cellen och
om de fryses för långsamt (<1°C/min) så ökar cellens saltkoncentration. Optimalt är 13°C/min ned till -40, -50°C och därefter snabbt ned till -140°C.
• Om man lägger kryorören i en volym på 1 liter (t.ex. en frigolitlåda med tjocka väggar och
en inre volym av 1 liter) kan -80°C frysen användas till infrysning av celler.
• Man kan också ställa rören i +4°C 30-60 min. och därefter flytta dem till -70°C frysen över
natten för att sedan flyttas till flytande kvävefrys.
8
Kristallbildningen är den mest skadliga för cellen och för att minska denna tillsätts DMSO
(dimetylsulfoxid) som penetrerar cellen och förhindrar kristallbildning. DMSO är toxiskt och
därför används högst 10% (v/v).
För att så stort antal celler som möjligt ska överleva upptining måste den ske så snabbt som
möjligt. Cellerna måste också tvättas fria från DMSO så snart som möjligt.
9
Upptining av celler
A. Cellodling - en praktisk handbok, AB Labassco Förlag, 1994
Den önskade ampullen finns i frys- och cellkartotek
Gör i ordning medium för utsådd
Var mycket noggrann med kontroll av pH. Under upptining är cellerna speciellt
känsliga för ett avvikande pH, i synnerhet om det är högt.
Snabb upptining är viktig
Gör i ordning ett 37°C vattenbad. Den önskade ampullen finns i frysen och förs
snabbt över till vattenbadet. Ampullen skakas försiktigt till dess att innehållet är
flytande (20-60 sekunder). Därefter förs ampullen över till en bägare med 70%ig etanol och doppas ned helt och hållet. När den tagits upp är den klar att
öppnas.
Spädning av frysmedium
Cellsuspensionen förs över till ett centrifugrör och 10 ml medium med serum
tillsätts först droppvis, sedan något snabbare. Suspensionen centrifugeras vid ca
300 g i 10 minuter, supernatanten tas bort och cellerna resuspenderas i färskt
medium och förs över till odlingsbehållare. Celltätheten ska vara 3-5 gånger den
som vanligtvis används till subkultivering.
Tillväxtresultatet noteras i kartoteket efter 24-48 timmar.
B. Antibodies - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988
Ta fram den frysta ampullen och transportera i en kontainer med kolsyre is.
Överför till cellodlingslaboratorium och start tina cellerna i 37°C vattenbad. Håll
ampullen lock över vattenytan för att minska risken för kontamination. Blanda
försiktigt några gånger.
När cellerna nästan tinat helt, för över ampullen till LAF-bänken. Torka av
ampullens utsida med 70%-ig etanol och skruva loss korken. Överför försiktigt
cellsuspensionen med en steril Pastör pipett. Vidrör inte ampullens sidor med
pipetten och överför innehållet till ett centrifugrör innehållande 10 ml medium
med 10% FCS (rumstempererad).
Centrifugera cellsuspensionen försiktigt (200g) under 5 minuter.
Avlägsna supernatanten och resuspendera cellerna med nya 10 ml medium med
10%FCS. Överför cellsuspensionen till en cellodlingsflaska och vidare in i
inkubator. Med bra utbyte (recovery), behöver du subkultivera cellerna inom 24
timmar efter utsådd.
C.
Ampullen tinas i 37°C vattenbad i en minut.
Cellerna suspenderas i 10 ml iskallt odlingsmedium och centrifugeras 10
minuter.
10
Cellerna resuspenderas därefter i 5 ml 37°C odlingsmedium och överförs till en
odlingsflaska.
Nedfrysning av celler
A.
Framställning av cellsuspension med dubbel cellkoncentration
För celler i monolayer: Låt cellerna växa till dess att de är subkonfluenta, d.v.s.
till sen logaritmisk fas. Överför cellerna till suspension med hjälp av PBS med
0,25% trypsin eller med PBS med 0,125% trypsin och 0,01% EDTA. Tillsätt
serumhaltigt medium till de suspenderade cellerna till dess att serum utgör minst
2% av suspensionen. Centrifugera cellsuspensionen vid ca 300g i 10 minuter.
Därefter resuspenderas cellerna i färskt medium med serum och
cellkoncentrationen justeras till 2x106 - 2x107 celler per ml.
För celler i suspensionskultur: Cellsuspensionen centrifugeras och cellerna
resuspenderas i färskt medium med serum och justeras till samma
cellkoncentration som ovan.
Framställning av frysmedium med dubbel koncentration av kryoskyddande
ämnen
Tillsätt DMSO eller glycerol i en koncentration av 20% till det färska mediet.
Detta ska göras omedelbart före användning och i rumstemperatur, eftersom det
sker en viss värmeutveckling.
Blandning av cellsuspension och frysmedium
Till 1 volym cellsuspension med dubbel koncentration av celler tillsätts samma
volym frysmedium med dubbel koncentration av kryoskyddande ämne.
Frysmediet tillsätts först droppvis, sedan snabbare och under försiktig
omskakning. Detta ska göras i rumtemperatur.
Cellsuspensionen innehåller nu 10% glycerol eller DMSO och 106-107 celler per
ml.
Det tillvägagångssätt som beskrivits ovan är en skonsam och bra metod, som gör
det lätt att justera den önskade cellkoncentrationen. Om man använder glycerol
bör denna metod användas. Om man använder DMSO kan man ofta få god
överlevnad genom att resuspendera cellerna i frysmedium med 10% DMSO
direkt efter centrifugering.
Var uppmärksam på mediets pH
Om det är nödvändigt leds en ström av fuktig luft/CO2 i lämplig blandning över
mediet till dess att rätt pH-värde nåtts.
B.
Använd endast celler som är friska och snabbt delande. På nedfrysningsdagen,
”splitta” cellerna 1:10 i färskt medium.
Överför cellerna i ett sterilt kylt centrifugeringsrör. Centrifugera vid 400g under
5 minuter vid 4°C.
11
Avlägsna supernatanten så noggrant som möjligt. Resuspendera cellerna
försiktigt i kall 8% DMSO, 92% FCS. Lägre koncentrationer än 5% DMSO ger
låga utbyten för de flesta hybridom.
Cellkoncentrationen ska vara ca 5x106-5x107 celler/ml.
Överför 0,5 ml cellsuspension till en kall frysampull.
Placera ampullen i en frysrack vid -70°C över natten, eller omslut ampullen med
flera lager papper och placera i -70°C. Normalt är det bäst att inte frysa många
ampuller vid samma tillfälle. Lång exponering för DMSO i dessa
koncentrationer är toxiskt för cellerna.
Celler kan förvaras vid -70°C under kortare tider och förblir viabla under flera
veckor eller månader. Långtidsförvaring kräver temperaturer vid -185°C,
flytande kväve.
Överför ampullen till flytande kväve kärl den följande dagen.
C.
Cellerna skördas och suspenderas i DMEM med 10% DMSO och 20% fetalt
kalvserum.
Frysampullerna innehåller 1 ml cellsuspension med 5 miljoner celler/ml.
Ampullerna förvaras i flytande kväve.
Tillväxtkurvor
Tillväxthastigheten bestäms bäst med hjälp av tillväxtkurvor som visar förändringen i antal
celler i en kultur som funktion av tiden. Tillväxtkurvor används t.ex. till:
• bestämning av tillväxthastigheten hos celler som etableras i kultur som ett led i
karakteriseringen av cellernas egenskaper
• kontroll av att en viss celltyps tillväxthastighet inte förändras efter lång tid i kultur
• batch-testning: undersökning av om ett givet medium eller mediumsupplement ger goda
tillväxtförhållanden
• undersökning av hur tillväxten påverkas av behandling med tillväxtfaktorer, hormoner,
transfektion med en gen och liknande
• terapiförsök med vissa ämnen; ofta föredrar man denna typ av försök assay som ger mer
direkta uttryck för celldöd
När cellräkning ska ligga till grund för tillväxtkurvor, sås cellerna ut i lämplig koncentration i
cellodlingsflaska ex. 5x104 - 5x105 celler / ml i 6-8 ml medium (överskott).
Cellkoncentrationen beror på celltypen och det är viktigt att exakt lika antal celler sås i varje
flaska. Vanligtvis sår man i tre flaskor och följer sedan varje flaska separat. Man skakar flaska
försiktigt för att slå loss cellerna från botten och blandar samtidigt. Vid uttaget tar man endast
den volym som ska föras över i en flaska. Om pipetten fylls helt för att sedan fördela cellerna
kommer antalet celler att variera eftersom de har en tendens att sedimentera under
pipetteringens gång. Tillväxtkurvan baseras på det genomsnittliga cellantalet vid varje
räkningsdag - se räkning av celler.
12
Beräkning av fördubblingstid
Beräkning av fördubblingstiden görs utifrån den linjära delen av kurvan i figuren nedan.
Riktningskoefficienten, k, för linjen beräknas och fördubblingstiden bestäms som
ln2/k=0,693/k
Riktningskoefficienten kan också bestämmas genom linjär regressionsanalys på de punkter
som svarar mot den linjära delen av tillväxtkurvan.
Fördubblingsdelen härleds från exponentialfunktionen Nt = N0 ekt, där
antal celler vid tiden t
Nt
N0
antal celler vid tiden 0
t
tiden för celler i exponentiell tillväxt
k
konstant som anger riktningskoefficienten för kurvan
Härledning: en fördubbling ⇒
Nt = 2xN0 ⇒ 2N0 = N0 ekt ⇒
2 = ekt ⇒ ln2 = kt
t = ln2 / k
13
Cellräkning
Rengör en Bûrker räknekammare och sätt fast täckglaset.
Totala antalet celler
• Cellerna överförs i suspension via skakning om de sitter löst fast eller via trypsinering om
de växer som monolayer.
• Ta ut ett litet prov - ex. 0,5 ml - på den välblandade cellsuspensionen.
• Tillsätt lika volym kristallviolett-lösning
• Blanda röret och överför prov i räknekammaren.
• Räkna 5 st A-rutor (motsvarar 0,1 mm3).
• Beräkna medeltalet celler i varje ruta.
• Antalet celler / stor ruta multipliseras med 104 motsvarar antal celler / ml. Glöm inte att
multiplisera med spädningsfaktorn (2). Antalet celler bör ligga mellan 20-300 celler / ruta
annars görs räkningen om med koncentrerad eller utspädd cellsuspension om.
Kristallviolett lösning som används färgar alla cellkärnor oavsett om cellen lever eller är död.
Om man vill bestämma antalet döda celler görs samma räkning med trypanblått (giftigt).
Färgning av döda celler med trypanblått
• I ett rör blandas lika delar cellsuspension med 0,4% trypanblått.
• Låt stå 2-5 min.
• Räkna i räknekammare
• Beräkna antalet celler som ovan
14
Kloning
Ett väsentligt problem vid vävnadsodling är cellernas genotypiska och fenotypiska instabilitet.
med detta menas att de odlade cellerna kan förändra såväl sina genetiskt betingade egenskaper
som de egenskaper (genotypiska), som inte orsakas av förändringar i arvsmassan utan, till ex.,
av förändringar i odlingsförhållanden (fenotypiska).
På grund av denna genetiska instabilitet måste alla icke-klonade cellinjer samt klonade
cellinjer efter ett fåtal passager betraktas som heterogena, d.v.s. att cellpopulationen består av
celler med ett varierande antal olika egenskaper. Eftersom man räknar med en mutation per
106 celldelningar, kommer det i det dagliga arbetet med vävnadsodling alltid att finnas en risk
för uppkomst av nya varianter.
Med kloning avses etablering av en subpopulation av celler, som alla härstammar från en enda
cell. Det finns olika typer av kloningsförfarande ex. spädningskloning och kloning i mjuk
agar.
Subkultivering
Vid odling av celler i ex. flaska kommer cellpopulationen att bli så stor att de måste delas upp
på flera flaskor för att tillväxten ska fortsätta att vara optimal. På grund av de förändringar
som kan uppstå under cellodling ska man vid varje subkulttivering notera passagenummer
såväl som delningsförhållandet (split). Subkultivering av en cellpopulation ska helst ske exakt
vid den tidpunkt då cellskiktet blir konfluent (sammanhängande). För monolayerkultur kräver
subkultivering att cellerna lösgörs från underlaget på ett skonsamt sätt, så att så många celler
som möjligt överlever och behåller sin vidhäftningsförmåga. Två metoder kan användas: en
mekanisk och en enzymatisk.
Mekanisk subkultivering
Genom att skaka odlingsflaskan kan man få löst sittande celler att frigöras till suspension.
Denna metod är lämplig för många hybridomcellinjer eftersom de inte fäster så hårt till
plasten.
Enzymatisk subkultivering - Trypsinering
Trypsin är en vanlig enzymatisk metod för subkultivering. Enzymet kan användas i
kombination med EDTA. Trypsin hämmas av komponenter i serum. Detta innebär att celler
som odlas i seruminnehållande medium måste sköljas med PBS utan Ca2+ och Mg2+ innan
trypsinet tillsätts. EDTA förstärker trypsinets verkan genom att komplexbinda ev. kvarvarande
kalciumjoner.
15